Name: bidirectional retroviral integration site pcr methodology and quantitative data analysis workflow
Uploaded: 2017-06-14T15:00:00
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O financiamento foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Subsídios de Saúde R00-HL116234, U19 AI117941 e R56 HL126544; O National Science Foundation Grant DMS-1516675; Fundação Nacional de Pesquisa da Coréia (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); E o programa de iniciativa KRIBB.

1. Gerando Bibliotecas de Seqüência de Junção (esquerda) e a jusante (direita) <ol><li> Preparação do linkador de DNA: <ol><li> Prepare uma solução de ADN de ligação de 10 μL adicionando 2 μL de oligos de LINQUER_A 100 μM (final: 20 μM), 2 μL de oligos de LINQUER_B 100 μM (final: 20 μM), 2 μL de NaCl 5 M (final: 1M) e 4 μL de água livre de nuclease num tubo de PCR. Consulte a Tabela 1 para as sequências do linker. </li><li> Incube a solução de DNA do linker a 95...

<ol>
	<li>Serrao, E., Engelman, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sites+of+Retroviral+DNA+Integration:+From+Basic+Research+to+Clinical+Applications.">Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+HSPC+Repopulation+in+Nonhuman+Primates+Revealed+by+a+Decade-Long+Clonal-Tracking+Study.">Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study.</a> Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).</li><li>Bushman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+integration+and+human+gene+therapy.">Retroviral integration and human gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).</li><li>Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+stem+cells:+methodological+constraints.">Counting stem cells: methodological constraints.</a> Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).</li><li>Schr&#246;der, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots.">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110 (4), 521-529 (2002).</li><li>Silver, J., Keerikatte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+polymerase+chain+reaction+to+amplify+cellular+DNA+adjacent+to+an+integrated+provirus.">Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus.</a> J. Virol. 64, 3150 (1990).</li><li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+insertion-site+analysis+by+linear+amplification-mediated+PCR+(LAM-PCR).">High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR).</a> Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).</li><li>Brady, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+sequence+and+quantify+DNA+integration+for+monitoring+outcome+in+gene+therapy.">A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy.</a> Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li><li>Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+cloning+and+sequencing+human+immunodeficiency+virus+type+1+integration+sites.">A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites.</a> J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).</li><li>Maldarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Restriction+Enzyme-Free+Linear+Amplification-Mediated+Polymerase+Chain+Reaction+Approach+for+Tracking+Lentiviral+Integration+Sites+Does+Not+Abrogate+Retrieval+Bias.">High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias.</a> Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).</li><li>Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+Bias+of+Gammaretrovirus+Vectors+following+Transduction+and+Growth+of+Primary+Mouse+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+and+without+Selection.">Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection.</a> Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).</li><li>Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Amplification+Mediated+PCR;+Localization+of+Genetic+Elements+and+Characterization+of+Unknown+Flanking+DNA.">Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA.</a> J Vis Exp. (88), e51543 (2014).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+sensitive+quantification+of+repopulating+hematopoietic+stem+cell+clones.">High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones.</a> J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).</li><li>Mitchell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+ASLV,+HIV,+and+MLV+show+distinct+target+site+preferences.">Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences.</a> PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).</li><li>Melkus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1.">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li><li>Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+approach+to+the+restriction+of+a+mouse+genome.">A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome.</a> BMC Res Notes. 6, 284 (2013).</li><li>Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genomic+mapping+of+vector+integration+sites+in+gene+therapy+studies.">High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies.</a> Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li><li>Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+HIV-1+infection+in+human+T+cells+by+lentiviral-mediated+delivery+of+small+interfering+RNA+against+CCR5.">Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning:+powerful+tools+in+functional+genomics.">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li><li>Cartier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+with+a+lentiviral+vector+in+X-linked+adrenoleukodystrophy.">Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.</a> Science. 326 (5954), 818-823 (2009).</li></ol>

O ensaio bidirecional permite a análise simultânea de ambas as sequências de junção de DNA do vetor do vetor a montante (esquerda) e a jusante (direita) e é útil em uma série de aplicações de terapia genética, células-tronco e pesquisa de câncer. O uso de enzimas com motivo GTAC (RsaI e CviQI) e a abordagem de PCR bidirecional melhora significativamente as chances de detectar um integrome (ou uma população clonal) quando comparado aos ensaios baseados em enzimas de TCGA-padrão ( TaqαI ) <sup cl...

Retroviruses inserem seu DNA genômico no genoma do hospedeiro em vários locais. Esta propriedade única, que pode contribuir para o desenvolvimento de cânceres e outras formas de patogênese viral, tem o benefício irônico de tornar esses vírus altamente acessíveis à engenharia celular para terapia genética e pesquisa de biologia básica. O site de integração viral (IS) - a localização no genoma do hospedeiro onde um DNA estrangeiro (vírus) está integrado - tem implicações importantes para o destino dos vírus integrados e das células hospedeiras. Os ensaios IS foram utilizados em várias configurações de pesquisa biológica e clínica para estudar a seleção do site de integração retroviral e patogênese, desenvolvimento do câncer, biologia das células-tronco e biologia do desenvolvimento 1 , 2 , 3 , 4 . Baixa sensibilidade de detecção, baixa reprodutibilidade de dados e freqüente contaminação cruzada estão entreOs principais fatores que limitam as aplicações dos ensaios IS aos estudos atuais e planejados. Muitas tecnologias de análise IS foram desenvolvidas. Os ensaios de locais de integração baseados em enzimas de restrição, incluindo a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) 5 , a PCR inversa 6 e o PCR 7 da Medição Lineada por Amplificação (LAM), são os mais amplamente utilizados. O uso de enzimas de restrição específicas do site, no entanto, gera um viés durante a recuperação do IS, permitindo apenas um subconjunto de integromes (um DNA estrangeiro integrado no genoma do hospedeiro) na proximidade do site de restrição a ser recuperado 4 . As tecnologias de ensaio que avaliam mais detalhadamente o vetor IS também foram introduzidas nos últimos anos. Esses ensaios empregam várias estratégias, incluindo o PCR 8 mediado por Transposon, não restritivo (nr) -LAM PCR 9 , enzima de restrição do tipo II-mDigestão editada 10 , cisalhamento mecânico 11 e PCR aleatória baseada em hexâmero (Re-free PCR) 12 , para fragmentar DNAs genômicos e amplificar IS. As tecnologias atuais têm níveis variáveis ​​de sensibilidade de detecção, cobertura de genoma, especificidade de alvo, capacidade de alto rendimento, complexidade de procedimentos de teste e vies na detecção de frequências relativas de sites alvo. Dadas as diferentes qualidades dos ensaios existentes e a variedade de propósitos para os quais eles podem ser usados, a abordagem de ensaio ideal deve ser cuidadosamente selecionada. Este trabalho fornece procedimentos experimentais detalhados e um fluxo de trabalho de análise de dados computacionais para um ensaio bidirecional que melhora significativamente as taxas de detecção e a precisão da quantificação da seqüência ao analisar simultaneamente o IS a montante e a jusante do DNA alvo integrado (ver Figura 1 para uma visão esquemática dos procedimentos de ensaio ). Esta abordagem também forneceS os meios para caracterizar o processo de integração retroviral (por exemplo, a fidelidade da duplicação do site alvo e as variações nas seqüências genômicas das inserções a montante e a jusante). Outros métodos bidirecionais foram utilizados principalmente para clonagem e seqüenciamento de ambas as extremidades do DNA alvo 11 , 13 , 14 . Este ensaio é amplamente otimizado para a quantificação de alto rendimento e reproduzível de clones marcados por vetores, utilizando o método de LM-PCR bem estabelecido e o mapeamento de análise computacional e para quantificar as junções a montante e a jusante. A análise bidirecional com a enzima TaqαI provou ser útil para quantificação clonal de alto rendimento em estudos pré-clínicos de terapia de células-tronco 2 , 15 . Este artigo descreve um método modificado usando um cortador mais freqüente (RsaI / CviQI - motivo: GTAC) que dobra tAs chances de detectar integromes em comparação com um teste baseado em TaqαI . Procedimentos detalhados de análise experimental e de dados que utilizam as enzimas do motivo GTAC para o lentiviral (NL4.3 e suas derivadas) e as análises do vector IS da gama-retroviral (vetores pMX) são descritas. Os oligonucleótidos utilizados no ensaio estão listados na Tabela 1 . Um script de programação interno para análise de seqüência IS é fornecido no documento suplementar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1004">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Thermostable DNA polymerase</td>
			<td style="width:208px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">600424</td>
			<td style="width:347px;">PicoMaxx Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermostable DNA polymerase buffer</td>
			<td style="width:208px;">Agilent</td>
			<td>600424</td>
			<td style="width:347px;">PicoMaxx Polymerase buffer</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Deoxynucleotide (dNTP) solution mix</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>dNTP solution mix (10mM each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR tubes</td>
			<td style="width:208px;">VWR International</td>
			<td style="width:119px;">53509-304</td>
			<td style="width:347px;">PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">2ml microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:208px;">Molecular Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">3453</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">RsaI&#160;</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0167L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CviQI</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0639L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Buffer A</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>NEB CutSmart buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Polymerase I large (klenow) fragment&#160;</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td>Blunting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">streptavidin beads solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Binding Solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Washing Solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stand</td>
			<td style="width:208px;">ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>DynaMag&#8482;-2 Magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>T4 DNA ligase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">10X T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>T4 DNA ligase reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">5X T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:208px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>46300-018</td>
			<td>T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S06497</td>
			<td style="width:347px;">Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">pvuII</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>R0151L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">sfoI</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>R0606L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer B</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td>NEB buffer 3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-05-01-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Capillary electrophoresis</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td style="width:347px;">QIAxcel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Veriti 96-well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375305</td>
			<td>PCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Rotating wheel (or Roller)</td>
			<td style="width:208px;">Eppendorf</td>
			<td>M10534004</td>
			<td>Cell Culture Roller Drums</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929559</td>
			<td>QX size marker (100-2,500 bp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929554</td>
			<td>QX size marker (50-1,500 bp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA alignment markers</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929524</td>
			<td>QX DNA Alignment Marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">genomc DNA</td>
			<td style="width:208px;">Not Available</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bidirectional retroviral integration site pcr methodology and quantitative data analysis workflow

Os ensaios do Site de Integração (IS) são um componente crítico do estudo dos sites de integração retroviral e sua importância biológica. Nos recentes estudos de terapia de genes retrovirais, os ensaios de IS, em combinação com a sequenciação da próxima geração, foram utilizados como ferramenta de rastreamento celular para caracterizar as populações de células-tronco clonais que compartilham o mesmo IS. Para a comparação precisa de repetir os clones de células-tronco dentro e entre diferentes amostras, a sensibilidade de detecção, a reprodutibilidade dos dados e a capacidade de alto rendimento do ensaio estão entre as qualidades de ensaio mais importantes. Este trabalho fornece um fluxo de trabalho detalhado de análise de dados e dados para a análise IS bidirecional. O ensaio bidirecional pode simultaneamente seqüenciar junções vetor-host a montante e a jusante. Comparado com as abordagens convencionais de seqüenciamento IS unidirecional, a abordagem bidirecional melhora significativamente as taxas de detecção de IS e a caracterização de eventos de integração em ambas as extremidades de tEle alvo DNA. O encanamento de análise de dados descrito aqui identifica e enumera com precisão as seqüências IS idênticas através de várias etapas de comparação que mapeiam as seqüências IS no genoma de referência e determinam erros de seqüenciamento. Usando um procedimento de ensaio otimizado, publicamos recentemente os padrões de repovoamento detalhados de milhares de clones de células estaminais hematopoiéticas (HSC) após transplante em macacos rhesus, demonstrando pela primeira vez o ponto de tempo preciso do repovoamento de HSC e a heterogeneidade funcional de HSCs no Sistema de primatas. O protocolo a seguir descreve o procedimento experimental passo a passo e fluxo de trabalho de análise de dados que identifica e quantifica precisamente as seqüências IS idênticas.

O ensaio IS bidirecional gerou diferentes tamanhos de amplicões de PCR para as junções de hospedeiros vetoriais a montante (esquerda) e a jusante (direita) ( Figura 2 ). O tamanho de um amplicon de PCR depende da localização do motivo GTAC mais próximo a montante e a jusante de um integrome. O ensaio também produziu amplicões internos de PCR de DNA: seqüências retrovirais perto do trato de polipurina e o local de ligação do iniciador foram amplif...

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Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Este manuscrito descreve o procedimento experimental e análise de software para um ensaio de site de integração bidirecional que pode simultaneamente analisar DNA de junção vetor-hospedeiro a montante e a jusante. Os produtos de PCR bidirecionais podem ser usados ​​para qualquer plataforma de seqüência a jusante. Os dados resultantes são úteis para uma comparação quantitativa de alto rendimento de alvos de DNA integrados.

Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

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Genética

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Detecção da expressão de microRNA na Membrana Peritoneal de Ratos Usando PCR Quantitativa em Tempo Real

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Varredura Retroviral: Mapeamento de sites de integração MLV para definir regiões reguladoras específicas de células

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-Locus variável-número tandem-repita a análise do peixe-patogénico bactéria Yersinia ruckeri pela PCR multiplex e pela electroforese capilar

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

RT-PCR quantitativo de alta produtividade em amostras de elegans C. single e bulk usando tecnologia nanofluidica

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...