Name: bidirectional retroviral integration site pcr methodology and quantitative data analysis workflow
Uploaded: 2017-06-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow at JoVE.com

Финансирование осуществлялось Национальными институтами здравоохранения Грантов R00-HL116234, U19 AI117941 и R56 HL126544; Национальный научный фонд Грант DMS-1516675; Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); И инициатива KRIBB.

1. Создание восходящих (левых) и нижестоящих (правых) -функций последовательностных библиотек <ol><li> Получение ДНК-линкера: <ol><li> Подготовьте 10 мкл линкерного ДНК-раствора, добавив 2 мкл 100 мкМ олигонов LINKER_A (окончательный: 20 мкМ), 2 мкл 100 мкМ олигонов LINKER_B (окончательный: 20 мкМ), 2 мк?...

<ol>
	<li>Serrao, E., Engelman, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sites+of+Retroviral+DNA+Integration:+From+Basic+Research+to+Clinical+Applications.">Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+HSPC+Repopulation+in+Nonhuman+Primates+Revealed+by+a+Decade-Long+Clonal-Tracking+Study.">Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study.</a> Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).</li><li>Bushman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+integration+and+human+gene+therapy.">Retroviral integration and human gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).</li><li>Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+stem+cells:+methodological+constraints.">Counting stem cells: methodological constraints.</a> Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).</li><li>Schr&#246;der, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots.">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110 (4), 521-529 (2002).</li><li>Silver, J., Keerikatte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+polymerase+chain+reaction+to+amplify+cellular+DNA+adjacent+to+an+integrated+provirus.">Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus.</a> J. Virol. 64, 3150 (1990).</li><li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+insertion-site+analysis+by+linear+amplification-mediated+PCR+(LAM-PCR).">High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR).</a> Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).</li><li>Brady, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+sequence+and+quantify+DNA+integration+for+monitoring+outcome+in+gene+therapy.">A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy.</a> Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li><li>Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+cloning+and+sequencing+human+immunodeficiency+virus+type+1+integration+sites.">A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites.</a> J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).</li><li>Maldarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Restriction+Enzyme-Free+Linear+Amplification-Mediated+Polymerase+Chain+Reaction+Approach+for+Tracking+Lentiviral+Integration+Sites+Does+Not+Abrogate+Retrieval+Bias.">High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias.</a> Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).</li><li>Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+Bias+of+Gammaretrovirus+Vectors+following+Transduction+and+Growth+of+Primary+Mouse+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+and+without+Selection.">Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection.</a> Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).</li><li>Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Amplification+Mediated+PCR;+Localization+of+Genetic+Elements+and+Characterization+of+Unknown+Flanking+DNA.">Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA.</a> J Vis Exp. (88), e51543 (2014).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+sensitive+quantification+of+repopulating+hematopoietic+stem+cell+clones.">High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones.</a> J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).</li><li>Mitchell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+ASLV,+HIV,+and+MLV+show+distinct+target+site+preferences.">Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences.</a> PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).</li><li>Melkus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1.">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li><li>Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+approach+to+the+restriction+of+a+mouse+genome.">A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome.</a> BMC Res Notes. 6, 284 (2013).</li><li>Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genomic+mapping+of+vector+integration+sites+in+gene+therapy+studies.">High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies.</a> Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li><li>Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+HIV-1+infection+in+human+T+cells+by+lentiviral-mediated+delivery+of+small+interfering+RNA+against+CCR5.">Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning:+powerful+tools+in+functional+genomics.">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li><li>Cartier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+with+a+lentiviral+vector+in+X-linked+adrenoleukodystrophy.">Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.</a> Science. 326 (5954), 818-823 (2009).</li></ol>

Двунаправленный анализ позволяет одновременно анализировать как последовательности восходящего (левого), так и нижестоящего (правого) вектора-хозяина ДНК-соединения и полезен в ряде применений генной терапии, стволовых клеток и исследований рака. Использование ферментов GTAC-motif (RsaI и C...

Ретровирусы вставляют свою геномную ДНК в геном хозяина в разных местах. Это уникальное свойство, которое может способствовать развитию рака и других форм вирусного патогенеза, имеет ироничную выгоду от того, чтобы эти вирусы были сильно поддаются клеточной инженерии для генной терапии и фундаментальных исследований в области биологии. Вирусный сайт интеграции (IS) - местоположение гена хозяина, в котором интегрирована чужая ДНК (вирус), имеет важные последствия для судьбы как интегрированных вирусов, так и клеток-хозяев. Анализы IS были использованы в различных биологических и клинических исследованиях для изучения селекции и патогенеза сайтов ретровирусной интеграции, развития рака, биологии стволовых клеток и биологии развития 1 , 2 , 3 , 4 . Низкая чувствительность обнаружения, низкая воспроизводимость данных и частое перекрестное загрязнение относятся к числуКлючевые факторы, ограничивающие применение ИСП-анализов для текущих и запланированных исследований. Разработаны многие технологии анализа IS. Наиболее широко используются анализы сайтов интеграции на основе рестрикционных ферментов, в том числе Linker-Mediated (LM) полимеразная цепная реакция (ПЦР) 5 , обратная ПЦР 6 и ПЦР 7 с линейной амплификацией (LAM). Однако использование сайтов-специфических рестрикционных ферментов создает смещение во время извлечения ИС, позволяя только подмножество интегромов (чужой ДНК, интегрированной в геном хозяина) вблизи рестрикционного сайта, подлежащего восстановлению. 4 . В последние годы также были внедрены аналитические технологии, которые более всесторонне оценивают векторные ИС. Эти анализы используют различные стратегии, в том числе МС-транспозон-опосредованную ПЦР- 8 , нерезистивный (nr) -LAM ПЦР 9 , рестрикционный фермент типа IIПищевое расщепление 10 , механическое срезание 11 и случайную ПЦР (без повторной ПЦР) на основе гексамера 12 , для фрагментации геномных ДНК и амплификации ИС. Современные технологии имеют различные уровни чувствительности обнаружения, охват генома, специфичность мишени, высокую пропускную способность, сложность процедур анализа и предубеждения при определении относительных частот целевых сайтов. Учитывая различные качества существующих анализов и разнообразие целей, для которых они могут быть использованы, следует тщательно подобрать оптимальный подход к анализу. Эта работа обеспечивает подробные экспериментальные процедуры и рабочий процесс анализа вычислительных данных для двунаправленного анализа, который значительно улучшает скорость обнаружения и точность количественной оценки последовательности, одновременно анализируя ИС вверх и вниз по течению от интегрированной целевой ДНК (см. Рисунок 1 для схематического обзора процедур анализа ). Этот подход также обеспечиваетS - средство для характеристики процесса ретровирусной интеграции (например, верность дублирования целевого сайта и вариации геномных последовательностей восходящих и нисходящих вставок). Другие двунаправленные методы были в основном использованы для клонирования и секвенирования обоих концов ДНК-мишени 11 , 13 , 14 . Этот анализ широко оптимизирован для высокопроизводительной и воспроизводимой количественной оценки векторизованных клонов с использованием хорошо зарекомендовавшего себя метода LM-PCR и картографирования вычислительного анализа, а также для количественного определения обоих восходящих и нисходящих соединений. Двунаправленный анализ с ферментом TaqαI оказался полезным для высокопроизводительной клональной квантификации в доклинических исследованиях генной терапии стволовых клеток 2 , 15 . В этой статье описывается модифицированный метод с использованием более частого резака (RsaI / CviQI - motif: GTAC), который удваивает tОн имеет шансы обнаружить интегромы по сравнению с анализом на основе TaqαI . Описаны подробные процедуры экспериментального анализа и анализа данных, которые используют ферменты мотивации GTAC для лентивирусов (NL4.3 и его производных) и вектора γ-ретровирусных (pMX-векторов). Олигонуклеотиды, используемые в анализе, перечислены в таблице 1 . Внутренний сценарий программирования для анализа последовательности IS представлен в дополнительном документе.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1004">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Thermostable DNA polymerase</td>
			<td style="width:208px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">600424</td>
			<td style="width:347px;">PicoMaxx Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermostable DNA polymerase buffer</td>
			<td style="width:208px;">Agilent</td>
			<td>600424</td>
			<td style="width:347px;">PicoMaxx Polymerase buffer</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Deoxynucleotide (dNTP) solution mix</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>dNTP solution mix (10mM each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR tubes</td>
			<td style="width:208px;">VWR International</td>
			<td style="width:119px;">53509-304</td>
			<td style="width:347px;">PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">2ml microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:208px;">Molecular Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">3453</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">RsaI&#160;</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0167L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CviQI</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0639L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Buffer A</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>NEB CutSmart buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Polymerase I large (klenow) fragment&#160;</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td>Blunting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">streptavidin beads solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Binding Solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Washing Solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stand</td>
			<td style="width:208px;">ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>DynaMag&#8482;-2 Magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>T4 DNA ligase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">10X T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>T4 DNA ligase reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">5X T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:208px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>46300-018</td>
			<td>T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S06497</td>
			<td style="width:347px;">Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">pvuII</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>R0151L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">sfoI</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>R0606L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer B</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td>NEB buffer 3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-05-01-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Capillary electrophoresis</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td style="width:347px;">QIAxcel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Veriti 96-well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375305</td>
			<td>PCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Rotating wheel (or Roller)</td>
			<td style="width:208px;">Eppendorf</td>
			<td>M10534004</td>
			<td>Cell Culture Roller Drums</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929559</td>
			<td>QX size marker (100-2,500 bp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929554</td>
			<td>QX size marker (50-1,500 bp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA alignment markers</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929524</td>
			<td>QX DNA Alignment Marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">genomc DNA</td>
			<td style="width:208px;">Not Available</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bidirectional retroviral integration site pcr methodology and quantitative data analysis workflow

Анализы интеграции (IS) являются критическим компонентом исследования сайтов ретровирусной интеграции и их биологического значения. В недавних исследованиях ретровирусной генной терапии ИСС-анализы в сочетании со последовательностью следующего поколения использовались в качестве инструмента отслеживания клеток для характеристики популяций клоновых стволовых клеток, имеющих один и тот же ИБ. Для точного сравнения репопулирующих клонов стволовых клеток внутри и между разными образцами чувствительность обнаружения, воспроизводимость данных и высокая пропускная способность анализа являются одними из самых важных характеристик анализа. Эта работа обеспечивает подробный рабочий процесс анализа протоколов и данных для двунаправленного анализа ИС. Двунаправленный анализ может одновременно кодировать как переходы, так и нижестоящие узлы-хозяины. По сравнению с обычными однонаправленными подходами секвенирования ИС двунаправленный подход значительно улучшает скорость обнаружения ИБ и характеристику событий интеграции на обоих концах tОн нацеливается на ДНК. Конвейер анализа данных, описанный здесь, точно идентифицирует и перечисляет идентичные последовательности IS посредством нескольких этапов сравнения, которые отображают последовательности IS на эталонный геном и определяют ошибки последовательности. Используя оптимизированную процедуру анализа, мы недавно опубликовали подробные образцы репопуляции тысяч клонов Hematopoietic Stem Cell (HSC) после трансплантации в макаках резуса, впервые демонстрируя точную временную точку репопуляции HSC и функциональную гетерогенность HSCs в Система приматов. В следующем протоколе описывается пошаговая экспериментальная процедура и рабочий процесс анализа данных, который точно идентифицирует и количественно идентифицирует идентичные последовательности IS.

Двунаправленный анализ ИС генерировал различные размеры ПЦР-ампликонов как для восходящих (левых), так и для нисходящих (правых) хостов-узлов ( рис. 2 ). Размер ПЦР-ампликона зависит от местоположения ближайшего моста GTAC вверх и вниз от интегрома. Анализ ?...

Watch this Scientific Journal Video about Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow at JoVE.com

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

В этой рукописи описывается экспериментальная процедура и программный анализ для анализа двунаправленного интеграционного сайта, который может одновременно анализировать ДНК-перекрестный узел вверх и вниз по течению. Двунаправленные продукты ПЦР могут использоваться для любой последующей секвенирующей платформы. Полученные данные полезны для высокопроизводительного количественного сравнения интегрированных целей ДНК.

Двунаправленная ретровирусная интеграция сайта Методология ПЦР и количественный анализ данных

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Слияние абсолютной и относительной количественной ПЦР данных для количественного определения Stat3 сплайсированный вариант Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Обнаружение экспрессии микроРНК в перитонеальной мембране крыс с использованием количественной ПЦР в реальном времени

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Ретровирусное сканирование: определение сайтов интеграции MLV для определения регуляторных областей, специфичных для клеток

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Пробоподготовки и анализа данных на основе RNASeq ген выражение данио рерио

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Стандартная методология для изучения на месте мутагенность как функция Точечная мутация ремонта, катализируемые ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и SsODN в клетках человека

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Методология для точного обнаружения метилирования митохондриальной ДНК

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Информатики анализ последовательности данных из пакетного дрожжи 2-гибрид экраны

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Мульти-локус переменный номер Тандем-повтор Анализ рыбы-патогенной бактерии Yersinia ruckeri по multiplex PCR и Капиллярэлектрорез

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Цифровой ПЦР на основе конкурентного индекса для высокой пропускной способностью анализ фитнеса в сальмонелле

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

Высокая пропускная способность Количественный RT-PCR в одиночных и массовых C. elegans образцы с использованием нанофлюидных технологий

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...