Name: bidirectional retroviral integration site pcr methodology and quantitative data analysis workflow
Uploaded: 2017-06-14T15:00:00
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El financiamiento fue proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones R00-HL116234, U19 AI117941, y R56 HL126544; La Fundación Nacional de Ciencias Grant DMS-1516675; La Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); Y el programa de la iniciativa KRIBB.

1. Generación de las bibliotecas de secuencia de derivación (izquierda) y descendente (derecha) <ol><li> Preparación del enlazador de ADN: <ol><li> Preparar una solución de ADN de ligador de 10 μL añadiendo 2 μL de oligos LINKER_A 100 μM (final: 20 μM), 2 μL de oligos LINKER_B 100 μM (final: 20 μM), 2 μL de NaCl 5 M (final: 1M) y 4 μL de agua libre de nucleasa en un tubo de PCR. Véase la Tabla 1 para las secuencias enlazadoras. </li><li> Incubar la solución de ADN del ...

<ol>
	<li>Serrao, E., Engelman, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sites+of+Retroviral+DNA+Integration:+From+Basic+Research+to+Clinical+Applications.">Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+HSPC+Repopulation+in+Nonhuman+Primates+Revealed+by+a+Decade-Long+Clonal-Tracking+Study.">Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study.</a> Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).</li><li>Bushman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+integration+and+human+gene+therapy.">Retroviral integration and human gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).</li><li>Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+stem+cells:+methodological+constraints.">Counting stem cells: methodological constraints.</a> Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).</li><li>Schr&#246;der, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots.">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110 (4), 521-529 (2002).</li><li>Silver, J., Keerikatte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+polymerase+chain+reaction+to+amplify+cellular+DNA+adjacent+to+an+integrated+provirus.">Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus.</a> J. Virol. 64, 3150 (1990).</li><li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+insertion-site+analysis+by+linear+amplification-mediated+PCR+(LAM-PCR).">High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR).</a> Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).</li><li>Brady, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+sequence+and+quantify+DNA+integration+for+monitoring+outcome+in+gene+therapy.">A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy.</a> Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li><li>Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+cloning+and+sequencing+human+immunodeficiency+virus+type+1+integration+sites.">A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites.</a> J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).</li><li>Maldarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Restriction+Enzyme-Free+Linear+Amplification-Mediated+Polymerase+Chain+Reaction+Approach+for+Tracking+Lentiviral+Integration+Sites+Does+Not+Abrogate+Retrieval+Bias.">High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias.</a> Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).</li><li>Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+Bias+of+Gammaretrovirus+Vectors+following+Transduction+and+Growth+of+Primary+Mouse+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+and+without+Selection.">Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection.</a> Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).</li><li>Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Amplification+Mediated+PCR;+Localization+of+Genetic+Elements+and+Characterization+of+Unknown+Flanking+DNA.">Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA.</a> J Vis Exp. (88), e51543 (2014).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+sensitive+quantification+of+repopulating+hematopoietic+stem+cell+clones.">High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones.</a> J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).</li><li>Mitchell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+ASLV,+HIV,+and+MLV+show+distinct+target+site+preferences.">Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences.</a> PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).</li><li>Melkus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1.">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li><li>Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+approach+to+the+restriction+of+a+mouse+genome.">A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome.</a> BMC Res Notes. 6, 284 (2013).</li><li>Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genomic+mapping+of+vector+integration+sites+in+gene+therapy+studies.">High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies.</a> Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li><li>Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+HIV-1+infection+in+human+T+cells+by+lentiviral-mediated+delivery+of+small+interfering+RNA+against+CCR5.">Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning:+powerful+tools+in+functional+genomics.">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li><li>Cartier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+with+a+lentiviral+vector+in+X-linked+adrenoleukodystrophy.">Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.</a> Science. 326 (5954), 818-823 (2009).</li></ol>

El ensayo bidireccional permite el análisis simultáneo de ambas secuencias de unión de ADN vector-huésped aguas arriba (izquierda) y aguas abajo (derecha) y es útil en una serie de aplicaciones de terapia génica, células madre y cáncer. El uso de enzimas GTAC-motivo (RsaI y CviQI) y el enfoque de PCR bidireccional mejora significativamente las posibilidades de detectar un integromo (o una población clonal) cuando se compara con anteriores enzimas de motivo TCGA- TaqαI 2 ,<...

Los retrovirus insertan su ADN genómico en el genoma del huésped en varios sitios. Esta propiedad única, que puede contribuir al desarrollo de cánceres y otras formas de patogenia viral, tiene el beneficio irónico de hacer estos virus altamente susceptibles a la ingeniería celular para la terapia génica y la investigación básica de la biología. El Sitio de Integración viral (IS) - la ubicación en el genoma del host donde está integrado un ADN (virus) extraño - tiene implicaciones importantes para el destino tanto de los virus integrados como de las células huésped. Los ensayos de IS se han utilizado en diversos contextos de investigación biológica y clínica para estudiar la selección y la patogénesis del sitio de integración retroviral, el desarrollo del cáncer, la biología de células madre y la biología del desarrollo 1 , 2 , 3 , 4 . La baja sensibilidad de detección, la baja reproducibilidad de los datos y la frecuente contaminación cruzadaLos factores clave que limitan las aplicaciones de los ensayos de IS a los estudios actuales y previstos. Se han desarrollado muchas tecnologías de análisis de IS. Los ensayos de sitios de integración basados ​​en enzimas de restricción, que incluyen la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) 5 , la PCR inversa 6 y la PCR 7 de Medición de Amplificación Lineal (LAM), son las más ampliamente utilizadas. El uso de enzimas de restricción específicas de sitio, sin embargo, genera un sesgo durante la recuperación de la IS, permitiendo sólo un subconjunto de integromes (un ADN extraño integrado en el genoma del huésped) en la vecindad del sitio de restricción a ser recuperado [ 4] . En los últimos años también se han introducido tecnologías de ensayo que evalúan de forma más exhaustiva el vector IS. Estos ensayos emplean diversas estrategias, incluyendo la PCR 8 mediada por transposón Mu, la PCR 9 no restrictiva (nr) -LAM, la enzima de restricción tipo IILa digestión edificada 10 , el cizallamiento mecánico 11 y la PCR aleatoria basada en hexámero (Re-PCR libre) 12 , para fragmentar ADN genómicos y amplificar IS. Las tecnologías actuales tienen diferentes niveles de sensibilidad de detección, cobertura del genoma, especificidad del objetivo, capacidad de alto rendimiento, complejidad de los procedimientos de ensayo y sesgos en la detección de las frecuencias relativas de los sitios objetivo. Dadas las diferentes cualidades de los ensayos existentes y la variedad de propósitos para los cuales pueden ser usados, el enfoque de ensayo óptimo debe ser cuidadosamente seleccionado. Este trabajo proporciona procedimientos experimentales detallados y un flujo de trabajo de análisis de datos computacionales para un ensayo bidireccional que mejora significativamente las tasas de detección y precisión de cuantificación de secuencias analizando simultáneamente el IS aguas arriba y aguas abajo del ADN diana integrado (ver la Figura 1 para una vista esquemática de los procedimientos de ensayo ). Este enfoque tambiénS los medios para caracterizar el proceso de integración retroviral (por ejemplo, la fidelidad de la duplicación del sitio objetivo y las variaciones en las secuencias genómicas de inserciones aguas arriba y aguas abajo). Se han utilizado otros métodos bidireccionales principalmente para clonar y secuenciar ambos extremos del ADN diana 11 , 13 , 14 . Este ensayo se optimiza ampliamente para la cuantificación de alto rendimiento y reproducible de clones marcados con vectores, utilizando el método LM-PCR bien establecido y la cartografía de análisis computacional, y para cuantificar las uniones tanto aguas arriba como aguas abajo. El análisis bidireccional con la enzima TaqαI ha demostrado ser útil para la cuantificación clonal de alto rendimiento en estudios preclínicos de terapia génica de células madre 2 , 15 . Este artículo describe un método modificado que utiliza un cortador más frecuente (RsaI / CviQI - motivo: GTAC) que dobla tLas posibilidades de detectar integromes en comparación con un ensayo basado en TaqαI . Se describen procedimientos experimentales detallados y procedimientos de análisis de datos que utilizan enzimas con motivo GTAC para el análisis IS vectorial lentiviral (NL4.3 y sus derivados) y gamma-retroviral (vectores pMX). Los oligonucleótidos usados ​​en el ensayo se enumeran en la Tabla 1 . En el documento complementario se proporciona un script de programación interno para el análisis de secuencias de IS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1004">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Thermostable DNA polymerase</td>
			<td style="width:208px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">600424</td>
			<td style="width:347px;">PicoMaxx Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermostable DNA polymerase buffer</td>
			<td style="width:208px;">Agilent</td>
			<td>600424</td>
			<td style="width:347px;">PicoMaxx Polymerase buffer</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Deoxynucleotide (dNTP) solution mix</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>dNTP solution mix (10mM each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR tubes</td>
			<td style="width:208px;">VWR International</td>
			<td style="width:119px;">53509-304</td>
			<td style="width:347px;">PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">2ml microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:208px;">Molecular Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">3453</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">RsaI&#160;</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0167L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CviQI</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0639L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Buffer A</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>NEB CutSmart buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Polymerase I large (klenow) fragment&#160;</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td>Blunting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">streptavidin beads solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Binding Solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Washing Solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stand</td>
			<td style="width:208px;">ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>DynaMag&#8482;-2 Magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>T4 DNA ligase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">10X T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>T4 DNA ligase reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">5X T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:208px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>46300-018</td>
			<td>T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S06497</td>
			<td style="width:347px;">Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">pvuII</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>R0151L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">sfoI</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>R0606L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer B</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td>NEB buffer 3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-05-01-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Capillary electrophoresis</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td style="width:347px;">QIAxcel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Veriti 96-well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375305</td>
			<td>PCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Rotating wheel (or Roller)</td>
			<td style="width:208px;">Eppendorf</td>
			<td>M10534004</td>
			<td>Cell Culture Roller Drums</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929559</td>
			<td>QX size marker (100-2,500 bp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929554</td>
			<td>QX size marker (50-1,500 bp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA alignment markers</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929524</td>
			<td>QX DNA Alignment Marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">genomc DNA</td>
			<td style="width:208px;">Not Available</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bidirectional retroviral integration site pcr methodology and quantitative data analysis workflow

Los ensayos del sitio de integración (IS) son un componente crítico del estudio de los sitios de integración retroviral y su importancia biológica. En estudios recientes de terapia génica retroviral, los ensayos de IS, en combinación con secuenciación de próxima generación, se han utilizado como una herramienta de seguimiento celular para caracterizar poblaciones de células madre clonales que comparten la misma IS. Para la comparación precisa de repoblar clones de células madre dentro y entre diferentes muestras, la sensibilidad de detección, la reproducibilidad de los datos y la capacidad de alto rendimiento del ensayo están entre las cualidades de ensayo más importantes. Este trabajo proporciona un protocolo detallado y flujo de trabajo de análisis de datos para el análisis bidireccional IS. El ensayo bidireccional puede secuenciar simultáneamente las uniones vector-huésped aguas arriba y aguas abajo. Comparado con los enfoques de secuenciación SI unidireccionales convencionales, el enfoque bidireccional mejora significativamente las tasas de detección de IS y la caracterización de eventos de integración en ambos extremos de tÉl se dirigió al ADN. La tubería de análisis de datos que aquí se describe con precisión identifica y enumera secuencias IS idénticas a través de múltiples pasos de comparación que mapean las secuencias de IS al genoma de referencia y determinan los errores de secuenciación. Utilizando un procedimiento de ensayo optimizado, hemos publicado recientemente los patrones detallados de repoblación de miles de clones de células madre hematopoyéticas (HSC) después del trasplante en macacos rhesus, demostrando por primera vez el momento preciso de la repoblación de HSC y la heterogeneidad funcional de HSCs en el Sistema de primates. El siguiente protocolo describe el procedimiento experimental paso a paso y el flujo de trabajo de análisis de datos que identifica y cuantifica con exactitud las secuencias IS idénticas.

El bidireccional IS ensayo generado diferentes tamaños de PCR amplicones tanto para el upstream (izquierda) y aguas abajo (derecha) de acogida de acogida junturas ( Figura 2 ]. El tamaño de un amplicón de PCR depende de la localización del motivo GTAC más cercano aguas arriba y aguas abajo de un integro. El ensayo también produjo amplicones de PCR de ADN interno: las secuencias retrovirales cerca del tracto polipurino y el sitio de unión del cebador s...

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Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Este manuscrito describe el procedimiento experimental y el análisis de software para un ensayo de sitio de integración bidireccional que puede analizar simultáneamente el ADN de unión vector-huésped aguas arriba y aguas abajo. Los productos de PCR bidireccionales pueden utilizarse para cualquier plataforma de secuenciación aguas abajo. Los datos resultantes son útiles para una comparación cuantitativa de alto rendimiento de dianas de ADN integradas.

Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

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Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Escaneo Retroviral: Mapeo de sitios de integración MLV para definir regiones reguladoras específicas de células

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Análisis informático de datos de la secuencia de lote levadura híbrida 2 pantallas

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-número Tándel-repetir Análisis de la Bacteria Patógena de Peces Yersinia ruckeri por Multiplex PCR y Electroforesis Capilar

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

RT-PCR cuantitativo de alto rendimiento en muestras de C. elegans individuales y a granel utilizando tecnología nanofluídica

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...