Name: determining the optimal inhibitory frequency for cancerous cells using tumor treating fields (ttfields)
Uploaded: 2017-05-04T15:00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields at JoVE.com

Forfattere har ingen anerkendelser.

1. TTFields In Vitro Application System - Base Plate og Skål Vedligeholdelse <ol><li> Skyl skål og fadebetræk under rindende vand fra vandet. Skyl derefter med deioniseret vand og lufttørret ansigt nedad. </li><li> Hvis et kemoterapeutisk middel / lægemiddel er blevet tilsat til retter i et tidligere eksperiment, skal hver fad fyldes med en 5% lysopvaskemiddelopløsning og efterlades natten over. <ol><li> Skyl skålene grundigt under rindende vand fra vandet for at undgå spild af vaske- og rengøringsmidler inde i fadet. Skyl skålene og skålene med deioniseret vand og lufttørret ansigt ned. </li></ol></li><li> Indsæt de rene og tørre retter med dækslerne i steriliseringsposer. Tæt og læg poserne i en autoklave, med retterne nedad. Autoklaver i 30 minutter, ikke højere end 121 ° C. </li><li> Sæt autoklaven på et tørt program, dels åbn autoklavedøren, og tørret op i 30 minutter. </li><li> Tør basispladen af ​​med en klud let fugtet med 70% ethanol. </li> &lt;/ Ol&gt; 2. Opsætning af forsøg BEMÆRK: Alt udstyr og materialer, der anvendes i denne protokol er beskrevet i List Materials. Alle nedenstående trin bør udføres i et laminar flow skab mens sterile betingelser opretholdes. <ol><li> Forberede rene og sterile TTFields retter og dæksler, som beskrevet i afsnit 1. Tør bundpladen med en klud fugtet med 70% ethanol. </li><li> Installere TTFields retter med dækslerne onto bundpladen ved at trykke forsigtigt ned på skålen og roterende med uret omkring 5 mm indtil randen af ​​skålen låse på de tre ben på bundpladen. Placer en steril 22-mm dækglas (behandlet plastik eller glas) på bunden af ​​hver skål. </li><li> Forberede cellesuspensionen i fuldstændigt vækstmedium (Dulbeccos modificerede Eagles medium for U-87 MG og F98, RPMI for A2780 og OVCAR-3; suppleret som beskrevet i Materialer List). BEMÆRK: ceLl koncentrationerne afhænger af celletyperne og forsøgsvarigheden, bør 80% -90% konfluent cellevækst ikke overskrides ved forsøgets afslutning. FORSIGTIG: Menneskelige cellelinier kan udgøre en biologisk fare og skal håndteres med de relevante sikkerhedsforanstaltninger. </li><li> Placer 200 μL cellesuspension (sædvanligvis 5.000-20.000 celler i 200 μL for et 72-timers forsøg afhængigt af fordoblingstiden) som en dråbe i midten af ​​hvert dækglas og dæksel med tallerkenåbningerne. </li><li> Inkuber ved 37 ° C i en CO 2 inkubator indtil cellerne klæber; En inkubation natten over er mulig på dette stadium. </li><li> Aspirer væskerne fra dråben ved hjælp af en 200- eller 1000 μl pipette. </li><li> Forsigtigt pipetter 2 ml komplet vækstmedium for at fylde hver skål. Brug en steril tip til pipetter og tryk let på afdækningskanterne for at frigøre luftboblerne lejlighedsvis fanget under diaset. </li><li> Dækk tallerkenerne med deres låg og læg dem indIde en CO 2 inkubator ved 37 ° C indtil starten af ​​TTFields behandling. </li></ol> 3. TTFields Application <ol><li> Overfør basispladerne med de vedhæftede TTFields-fade til en kølet CO 2- inkubator. BEMÆRK: In vitro TTFields applikation vil generere varme; Derfor kræves en kølet inkubator for at kompensere for opvarmning af opvasken. Højere TTFields intensiteter vil producere mere varme og vil kræve lavere temperaturer i inkubatoren (se tabel 1 ). Klinisk relevante TTFields intensiteter opnås, når inkubatortemperaturen for TTFields applikation er i området 18-30 ° C. </li><li> Tilslut den fladkabelhunnede stik til bundpladen. Tænd for TTFields generatoren. </li><li> Start TTFields in vitro applikationssystemsoftware og vælg eksperimentindstillingerne. <ol><li> Definer et nyt eksperiment. Indtast navnet på experiment og eksperimentet ejer i softwaren brugerinterface på computerskærmen. Justere frekvensen og måltemperatur for hver skål eller bundpladen. </li></ol></li><li> Start TTFields applikation ved hjælp af softwaren. </li><li> Kontroller, at alle retter er tilsluttet korrekt og vises lyseblå på skærmen. Hvis et fad er omgivet med en rød ramme (hvilket betyder, at det ikke er korrekt tilsluttet), tryk den forsigtigt ned, og drej langsomt frem og tilbage, indtil kontakterne er restaureret og skålen ser lyseblå. </li><li> Lad TTFields in vitro ansøgningssystem kører i op til 24 timer. </li><li> Hvis eksperimentet når sit slutpunkt, stoppe eksperimentet ved at klikke på Afslut eksperimentet knappen i softwaren og fortsæt til trin 5. Hvis ikke, skal du klikke på PAUSE eksperiment. </li><li> Afbryd fladkabel stik fra bundpladen. Fjern bundpladen med retter fra inkubatoren i en laminar strømning. </li><li> Udskift mediet i al fades hver 24 timer og returnere bundpladen til den kølede inkubator. Slut bundpladen til generatoren ved hjælp af den flade kabel. Fortsæt forsøget ved at klikke på knappen Fortsæt. </li></ol> 4. kontrolprøver Bemærk: Dyrk kontrolceller på tilsvarende vilkår TTFields-behandlede celler, undtagen TTFields ansøgning. <ol><li> Plade kontrolprøver med samme suspension og om en lignende overflade, der benyttes til plettering TTFields-behandlede prøver. </li><li> Placere kontrolskålene i en CO2-inkubator ved 37 ° C. </li><li> Udskift mediet i de retter hver 24 timer til at matche de TTFields-behandlede fad medium betingelser. </li></ol> 5. Forsøg End <ol><li> Når du har klikket på END eksperiment vente på software til at hente alle poster fra systemet og for at gemme journaler på computeren. </li><li> Brug knappen RAPPORTER at gennemgå temperatur, strøm og modstand log files af hver basisplade at verificere at alle retter blev behandlet ifølge den forsøgsplan. BEMÆRK: Alle rapporter og logs gemmes på computeren efter afslutningen af forsøget, og kan gennemses på ethvert tidspunkt. </li><li> Sluk for TTFields generator. </li><li> Afbryd fladkablet fra grundpladen og fjerne fra inkubatoren. </li><li> At fjerne en keramisk skål, trykke ned og dreje skålen mod uret for at låse den op fra bundpladen. </li><li> Tag servicet ind i en laminar strømning kabinet og aseptisk fjerne dækglas. Overføre dem til sterilt petriskåle indeholdende frisk medium eller phosphatbufret saltvand (PBS) for yderligere inspektion og evaluering. </li></ol> 6. Evaluering af virkningen af ​​TTFields BEMÆRK: TTFields&#39; effekter kan bestemmes på flere måder. Bruge en eller flere af følgende metoder til sammenligningen behandlede celler med ubehandlede kontrolceller: <ol><li> celletal<ol><li> Fjern mediet / PBS fra hver dækglas-indeholdende skål. </li><li> Tilsæt 0,5 ml 0,25% trypsin / EDTA til hver skål og inkuberes i op til 10 minutter (dvs. indtil cellerne begynder at løsne sig fra dækglasset overflade) ved 37 ° C i en CO2-inkubator. </li><li> Tilføj 0,5 ml af komplet vækstmedium for at neutralisere trypsin og re-suspendere cellerne ved forsigtigt at pipettere op og ned. </li><li> Tæl cellerne under anvendelse enhver standard celletælling teknik, der er forenelig med tælle lave cellekoncentrationer (dvs. omkring 20.000 celler / ml). </li></ol></li><li> klonogene bestemmelse <ol><li> Plate et tilsvarende antal celler (100-500 celler pr skål) fra hver skål på nye, sterile petriskåle eller 6-brønds plader indeholdende 2 ml frisk fuldstændigt vækstmedium. </li><li> Inkuber i en CO2-inkubator ved 37 ° C i 1-3 uger (afhængigt af egenskaberne af hver cellelinie) indtil kolonier bestående af ~ 50 celler dannes. Evaluer cellenantal pr koloni ved lysmikroskopi. </li><li> Fjern mediet og skyl med PBS. </li><li> Fjern PBS og tilføje iskold methanol (1 ml). Inkuber ved -20 ° C i 10 minutter eller længere. </li><li> Fjernelse af methanolen. </li><li> Tilføj krystalviolet-opløsning (0,1% vægt / volumen i 25% volumen / volumen methanol i vand) og inkuberes i 20 min. ADVARSEL: Crystal violet er et potentielt carcinogen; bruge handsker under arbejdet med krystalviolet. </li><li> Fjern krystalviolet, vaskes 3 gange med deioniseret vand og lufttørre. </li><li> Tæl kolonierne dannet i hver skål. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating+electric+fields+arrest+cell+proliferation+in+animal+tumor+models+and+human+brain+tumors.">Alternating electric fields arrest cell proliferation in animal tumor models and human brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (24), 10152-10157 (2007).</li><li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+cancer+cell+replication+by+alternating+electric+fields.">Disruption of cancer cell replication by alternating electric fields.</a> Cancer Res. 64 (9), 3288-3295 (2004).</li><li>Gera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+treating+fields+perturb+the+localization+of+septins+and+cause+aberrant+mitotic+exit.">Tumor treating fields perturb the localization of septins and cause aberrant mitotic exit.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li><li>Giladi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+disruption+and+reduced+clonogenicity+of+pancreatic+cancer+cells+in+vitro+and+in+vivo+by+tumor+treating+fields.">Mitotic disruption and reduced clonogenicity of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo by tumor treating fields.</a> Pancreatology. 14 (1), 54-63 (2014).</li><li>Giladi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+Spindle+Disruption+by+Alternating+Electric+Fields+Leads+to+Improper+Chromosome+Segregation+and+Mitotic+Catastrophe+in+Cancer+Cells.">Mitotic Spindle Disruption by Alternating Electric Fields Leads to Improper Chromosome Segregation and Mitotic Catastrophe in Cancer Cells.</a> Sci Rep. 5, 18046 (2015).</li><li>Giladi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating+electric+fields+(tumor-treating+fields+therapy)+can+improve+chemotherapy+treatment+efficacy+in+non-small+cell+lung+cancer+both+in+vitro+and+in+vivo.">Alternating electric fields (tumor-treating fields therapy) can improve chemotherapy treatment efficacy in non-small cell lung cancer both in vitro and in vivo.</a> Semin Oncol. 41, S35-S41 (2014).</li><li>Voloshin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating+electric+fields+(TTFields)+in+combination+with+paclitaxel+are+therapeutically+effective+against+ovarian+cancer+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Alternating electric fields (TTFields) in combination with paclitaxel are therapeutically effective against ovarian cancer cells in vitro and in vivo.</a> Int J Cancer. 139 (12), 2850-2858 (2016).</li><li>Pless, M., Droege, C., von Moos, R., Salzberg, M., Betticher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I/II+trial+of+Tumor+Treating+Fields+(TTFields)+therapy+in+combination+with+pemetrexed+for+advanced+non-small+cell+lung+cancer.">A phase I/II trial of Tumor Treating Fields (TTFields) therapy in combination with pemetrexed for advanced non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 81 (3), 445-450 (2013).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+therapy+with+tumor-treating+fields+plus+temozolomide+vs+temozolomide+alone+for+glioblastoma:+A+randomized+clinical+trial.">Maintenance therapy with tumor-treating fields plus temozolomide vs temozolomide alone for glioblastoma: A randomized clinical trial.</a> JAMA. 314 (23), 2535-2543 (2015).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NovoTTF-100A+versus+physician's+choice+chemotherapy+in+recurrent+glioblastoma:+a+randomised+phase+III+trial+of+a+novel+treatment+modality.">NovoTTF-100A versus physician's choice chemotherapy in recurrent glioblastoma: a randomised phase III trial of a novel treatment modality.</a> Eur J Cancer. 48 (14), 2192-2202 (2012).</li><li>Kanner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post+Hoc+analyses+of+intention-to-treat+population+in+phase+III+comparison+of+NovoTTF-100A+system+versus+best+physician's+choice+chemotherapy.">Post Hoc analyses of intention-to-treat population in phase III comparison of NovoTTF-100A system versus best physician's choice chemotherapy.</a> Semin Oncol. 41, S25-S34 (2014).</li><li>Miranda, P. C., Mekonnen, A., Salvador, R., Basser &amp;amp, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+electric+field+distribution+in+the+brain+for+the+treatment+of+glioblastoma.">Predicting the electric field distribution in the brain for the treatment of glioblastoma.</a> Phys Med Biol. 59 (15), 4137-4147 (2014).</li><li>Wong, E. T., Lok, E., Swanson &amp;amp, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Evidence-Based+Review+of+Alternating+Electric+Fields+Therapy+for+Malignant+Gliomas.">An Evidence-Based Review of Alternating Electric Fields Therapy for Malignant Gliomas.</a> Curr Treat Options Oncol. 16 (8), (2015).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+effect+of+an+alternating+electric+field+on+cell+proliferation+and+synergistic+antimitotic+effect+in+combination+with+ionizing+radiation.">Biological effect of an alternating electric field on cell proliferation and synergistic antimitotic effect in combination with ionizing radiation.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Kim, E. H., Song, H. S., Yoo, S. H., Yoon &amp;amp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+treating+fields+inhibit+glioblastoma+cell+migration,+invasion+and+angiogenesis.">Tumor treating fields inhibit glioblastoma cell migration, invasion and angiogenesis.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Pavesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+microfluidic+culture+platform+for+tumor-treating+field+application.">Engineering a 3D microfluidic culture platform for tumor-treating field application.</a> Sci Rep. 6, 26584 (2016).</li><li>Wong, E. T., Lok, E., Swanson &amp;amp, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+benefit+in+recurrent+glioblastoma+from+adjuvant+NovoTTF-100A+and+TCCC+after+temozolomide+and+bevacizumab+failure:+a+preliminary+observation.">Clinical benefit in recurrent glioblastoma from adjuvant NovoTTF-100A and TCCC after temozolomide and bevacizumab failure: a preliminary observation.</a> Cancer Med. , (2015).</li><li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+treatment+efficacy+and+sensitivity+are+increased+by+adjuvant+alternating+electric+fields+(TTFields).">Chemotherapeutic treatment efficacy and sensitivity are increased by adjuvant alternating electric fields (TTFields).</a> BMC Med Phys. 9, (2009).</li><li>Schneiderman, R. S., Shmueli, E., Kirson, E. D., Palti &amp;amp, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TTFields+alone+and+in+combination+with+chemotherapeutic+agents+effectively+reduce+the+viability+of+MDR+cell+sub-lines+that+over-express+ABC+transporters.">TTFields alone and in combination with chemotherapeutic agents effectively reduce the viability of MDR cell sub-lines that over-express ABC transporters.</a> BMC Cancer. 10, 229 (2010).</li><li>Connelly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planning+TTFields+treatment+using+the+NovoTAL+system-clinical+case+series+beyond+the+use+of+MRI+contrast+enhancement.">Planning TTFields treatment using the NovoTAL system-clinical case series beyond the use of MRI contrast enhancement.</a> BMC Cancer. 16 (1), (2016).</li></ol>

Porat Yaara, Giladi Moshe, Schneiderman S. Rosa, Blat Roni, Shteingauz Anna, Zeevi Einav, Munster Mijal, Voloshin Tali, Kaynan Noa, Tal Orna og Kirson D. Eilon D betales medarbejdere hos Novocure Ltd, Israel. Weinberg Uri er lønmodtager af Novocure GmbH, Luzern. Yoram Palti er aktionær hos Novocure Ltd, NY.

TTFields er en spirende antitumor-modalitet baseret på den fortsatte anvendelse af korrekt indstillede alternerende elektriske felter 1, 2, 8, 9, 10, 17. Maksimering antitumoreffektivitet er en ønskelig resultat for alle behandlingsmodaliteter. Således kan &quot;kæmper&quot; for hver ekstra procent af kræft cellevækst hæmning have en betydelig indvirkning på den langsigtede kliniske resultat for patienterne. Dette er på grund af den krævede vedvarende karakter TTFields ansøgning og den resulterende kumulative effekt. Maksimering TTFields ansøgning kan opnås på flere måder: (1) forøgelse af det elektriske felt intensitet 1, 7, (2) forlængelse behandlingsvarighed 5, (3) at finde den mest effektive combinatipå med andre behandlingsmodaliteter 18, 19 og (4), der definerer den optimale frekvens 1, 2, 4, 6, 7. Maksimering det elektriske felt intensitet på stedet for tumoren opnås ved at optimere placeringen af ​​arrays på patientens hud; dette giver mulighed for levering af den maksimale feltintensitet til tumoren baseret på den enkelte patientens anatomi 20. Forlængelse behandlingsvarighed meste afhængig af patientens overholdelse af behandlingen (i mindst 18 timer om dagen) 17. At finde den rigtige kombination med andre behandlinger og bestemme den optimale frekvens er stærkt afhængig in vitro-resultater, som ingen validerede markører for TTFields behandlingsresultater er i øjeblikket tilgængelige. I dette arbejde har vi skitseret den eksperimentelle pROCEDURER kræves for at bestemme den optimale TTFields frekvens for kræft cellelinier ved anvendelse af TTFields in vitro ansøgningssystemet. De her beskrevne metoder kan potentielt anvendes til at screene kombination af andre modaliteter cancer (fx kemoterapimidler eller bestråling) med TTFields og at bestemme den optimale frekvens for TTFields administration for hver specifik kombineret behandling. I overensstemmelse med tidligere publikationer, der er vist her resultater viser, at den optimale frekvens for behandling af både gliomceller og ovariecancerceller er 200 kHz 1, 7. I dette arbejde viste vi for første gang, at det optimale TTFields frekvens for at reducere klonogeniske potentiale er forbundet med den hyppighed, der fører til den maksimale cytotoksiske virkning. De i dette arbejde anvendte metoder til at kvantificere virkningen af TTFields (dvs. cytotoksiske og klonogene) enre kun to af mange mulige standard endpoint analyser for at vurdere behandlingsresultater. Yderligere udfald behandling test omfatter: (1) fastsættelse farvning, og montering dækglassene hvorpå cellerne udplades over et mikroskop til visualisering af intracellulære strukturer; (2) udførelse af assays af protein- og RNA-ekstrakter, enten fra TTFields retter selv eller efter overførsel dækglasset til en ny engangs skål; og (3) trypsinbehandling af celler farvet til flowcytometri analyse. Omhyggelig eksperimentel planlægning vil påvirke behandlingsresultater efter indlevering af TTFields. De vigtigste skridt indgår, at celleproliferation hele forsøget ikke fører til overvækst og anvendelse af det passende elektriske felt intensitet, som intensiteter, der er for høj, når den anvendes på følsomme cellelinjer vil resultere i for-få celler til de krævede assays til bestemmelse den optimale frekvens. Omvendt TTFields anvendt ved meget lave intensiteterPå mindre følsomme cellelinier vil det resultere i små effekter, som kan maskeres ved iboende variation. Behandlingslogfilerne bør undersøges for værdifulde oplysninger om temperaturstabilitet, elektriske strømme og modstand for hver enkelt parabol gennem hele eksperimentet. Udskiftning af defekte retter ved behandlingstart og udelukkelse af data fra en skål, der ikke opfyldte de ønskelige behandlingsparametre, minimerer variationen mellem replikater. Sammenfattende er TTFields en fremvækst mod cancerbehandling modalitet, der allerede har vist effekt og sikkerhed i kliniske indstillinger 8 , 9 , 10 . Testning af TTFields i en in vitro- indstilling ved hjælp af de her beskrevne protokoller kan muliggøre optimering af TTFields behandlingsparametre i den kliniske indstilling og kan udvide vores forståelse af den underliggende virkningsmekanisme.

Tumorbehandlingsfelter (TTFields) er en anti-mitotisk modalitet til behandling af glioblastom multiforme og potentielt andre kræftformer. Feltene leveres via kontinuerlig anvendelse af lavintensitet (1-3 V / cm), mellemfrekvens (100-500 kHz), vekslende elektriske felter til tumorområdet 1 , 2 . TTFields ansøgning in vitro og in vivo viste sig at hæmme både væksten af ​​forskellige cancercellelinier og tumorernes progression i flere dyrtumormodeller 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Pilot kliniske forsøg og større randomiserede undersøgelser hos patienter med solide tumorer, herunder glioblastom og ikke-småcellet lungekræft, har demonstrationbedømt sikkerheden og effekten af kontinuerlig TTFields ansøgning 8, 9, 10. Effektiviteten af TTFields viste sig at være: (1) frekvensafhængig, med specifikke optimale frekvenser fører til det største fald i celletallene af cellelinier fra forskellige oprindelser 1, 2, 4, 5, 6, 7; (2) elektrisk feltintensitet-afhængig, med en minimal tærskel for aktivitet på omkring 1 V / cm og mere potente højere intensiteter 1, 2, 7, 11; (3) forøget, når behandlingsvarigheden var længere 5; og (4) højere, når 2 retningsbestemte TTFields blev påført vinkelret på hver othEr, sammenlignet med elektriske felter påført fra en enkelt retning 1 . På baggrund af ovenstående fund kan TTFields anvendes til patienter i lang varighed ved anvendelse af 2 sæt transducer arrays lokaliseret på patientens hud for at maksimere de elektriske feltintensiteter i tumorlejet 12 , 13 . At studere virkningerne af TTFields på kræftceller in vitro giver i øjeblikket den eneste måde at bestemme den optimale frekvens til at anvende på en bestemt tumortype. Afprøvning af den optimale frekvens kræver en enhed, der muliggør anvendelse af forskellige frekvenser i området fra 100-500 kHz og ved intensiteter på op til 3 V / cm rotmiddelkvadrat (RMS) til cellekulturen. Da TTFields applikation producerer varme, kræver applikationssystemet evnen til at udlede overdreven varme, mens der opretholdes tæt kontrol over temperaturen. Flere enheder were udviklet gennem årene for at muliggøre TTFields ansøgning til cellekulturer 1, 2, 5, 14, 15, 16. I alle disse indretninger blev elektroderne anvendte isolerede for at undgå de forbehold forbundet med anvendelsen af ledende elektroder, såsom elektron udveksling på elektrodeoverfladen og frigivelsen af toksiske metalioner ind i mediet 1. Den væsentligste forskel mellem de forskellige TTFields ansøgning afprøvede systemer er den type elektrode isolering anvendt med enten elektroder fremstillet af metaltråde isoleret med en tynd film af isolatoren 2, 14, 15, 16 eller med en høj dielektrisk-konstant materiale (fx, bly magnesium niobate-bly titanatE (PMN-PT)) 6 . Selvom de isolerede ledningselektroder tilbyder en forholdsvis enkel og omkostningseffektiv løsning til TTFields applikation, er de ofte begrænset af den høje spænding, der kræves for at opnå effektive elektriske feltintensiteter over 1 V / cm tærsklen og af overfladen tilgængelig til celleplating, Da afstanden mellem elektroderne er forholdsvis lille. Systemer baseret på elektroder isoleret ved hjælp af et højt dielektrisk konstant materiale kræver specielle design- og fremstillingsevner, men de kræver ikke højspænding og kan tilbyde et større område til cellevækst mellem elektroderne. TTFields in vitro applikationssystem, der anvendes i dette værk, tilhører den sidstnævnte klasse af systemer, hvor kerneenheden er en petriskål (TTFields skål, se figur 1 ) sammensat af høj dielektrisk konstant keramik ( dvs. PMN-PT). To par elektroder udskrives vinkelret på den ydre valsLs af en TTFields skål for at tillade anvendelse af elektriske felter fra 2 retninger. Elektroderne er forbundet til en sinusformet bølgeformgenerator og en forstærker, som tillader TTFields-applikation i frekvensområdet 50-500 kHz. For at sprede den overdrevne varme opbevares TTFields-skålene inde i en nedkølet inkubator, idet middeltemperaturreguleringen udføres ved konstant overvågning af skåltemperaturen og justeringer af den spænding, som systemet anvender. I praksis vil indstillingen af ​​inkubatoren til en lavere temperatur føre til højere elektriske feltintensiteter, da systemet øger spændingen, indtil måltemperaturen inden for fadet opnås. Forskellen mellem temperaturen i skålen og inkubatortemperaturen kan føre til en vis fordampning afhængigt af temperaturgradienterne; Derfor skal kulturmediet udskiftes hver 24. time for at opretholde passende vækstbetingelser. Protokollen nedenforBeskriver den eksperimentelle procedure for at optimere anvendelsen af ​​TTFields frekvenser til kræftceller, således at der opnås en maksimal reduktion i celletælling og en reduktion i potentialet hos de overlevende celler til dannelse af kolonier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>inovitro system and software</td>
			<td>Novocure</td>
			<td>ITG1000 and IBP1000</td>
			<td>Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization bags</td>
			<td>Westfield medical</td>
			<td>24882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cover slides</td>
			<td>Thermo Scientific (NUNC)</td>
			<td>174977</td>
			<td>Pre treated and sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Thermo Scientific (Menzel-Gl&#228;ser)</td>
			<td>CB00220RA1</td>
			<td>Sterilize if necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep (10000 U/mL Penicillin, 10000 &#181;g/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate solution 100 mM&#160;</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer 1M</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insuline solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>03-050-1B</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06009.2511</td>
			<td>Cool to -20 &#176;C in the freezer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>120M1445</td>
			<td>Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light detergent</td>
			<td>Alcononx</td>
			<td>242985</td>
			<td>Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer&#39;s instrutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2780</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>93112519</td>
			<td>Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 &#181;g/Ml), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12mM).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F98</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2397</td>
			<td>Grow in&#160; Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 &#181;g/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovcar-3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep&#160; (100 U/mL / 100 &#181;g/Ml), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insuline (10 &#181;g/mL).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td>Grow in&#160; Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 &#181;g/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigirated CO2 incubator</td>
			<td>CARON</td>
			<td>7404-10-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow cabinet</td>
			<td>ADS Laminair</td>
			<td>Bio12 and VSM12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the optimal inhibitory frequency for cancerous cells using tumor treating fields (ttfields)

Tumorbehandlingsfelter (TTFields) er en effektiv behandlingsmodalitet leveret via den kontinuerlige, ikke-invasive anvendelse af lavintensitet (1-3 V / cm), vekslende elektriske felter i frekvensområdet på flere hundrede kHz. Undersøgelsen af ​​TTFields i vævskultur udføres ved anvendelse af TTFields in vitro applikationssystem, som muliggør anvendelse af elektriske felter med varierende frekvenser og intensiteter til keramiske petriskåle med en høj dielektrisk konstant (Ɛ&gt; 5000). Kræftcellelinjer udpladet på dækglas nederst på de keramiske petriskåle underkastes TTFields leveret i to ortogonale retninger ved forskellige frekvenser for at lette behandlingsafprøvningstests, såsom celletællinger og klonogene analyser. Resultaterne præsenteret i denne rapport viser, at den optimale frekvens af TTFields med hensyn til både celletællinger og klonogene analyser er 200 kHz for både æggestokke og gliomaceller.

<html> Resultater efter TTFields applikation ved scanning af forskellige frekvenser kan kvantificeres baseret på forskellige analyser, såsom celle tæller, kolorimetriske analyser, klonogene analyser og undersøgelser af ændringerne i antallet af invaderende celler ved anvendelse af et Boyden kammer placeret inden for en speciel højvæg TTFields Cellekulturskål. Omhyggelig eksperimentel planlægning baseret på forudbestemte cellefordoblingstider vil gøre det muligt for cellerne at nå det maksimale antal mitotiske hændelser under behandlingsvarigheden og dermed maksimere behandlingsresultater. Figur 2 illustrerer et typisk frekvens scanningsresultat for et gennemsnitligt celletal ( dvs. antal celler) og klonogent assay af A2780 ( dvs. humane ovariecancerceller; Figur 2A ) 7 og F-98 ( dvs. rottegliomaceller;&quot;&gt; Figur 2B) 1 behandlet med to retnings-TTFields (frekvensområde: 100-500 kHz, RMS: 1,7 V / cm og inkubatortemperatur: 18 ° C). Resultaterne viser en signifikant reduktion i celletællinger ved alle anvendte frekvenser , Med den maksimale reduktion ved 200 kHz for alle testede cellelinier (envejs ANOVA med multipel sammenligning). Den optimale frekvens, der førte til den højeste reduktion i det klonogene potentiale, var det samme for både A2780 og F98 celler ( figur 2B og C ) . Pearson-korrelationskoefficienten mellem celleantalet og den klonogene virkning ved hver frekvens var 0,967 (p = 0,002) og 0,755 (p = 0,083) for henholdsvis A2780 og F98. Figur 3 viser et frekvens scanningsresultat for gennemsnitscelletællingen for OVCAR-3 ( dvs. humane ovariecancerceller; Figur 3A ) og U-87 MG (dvs. humane gliomceller; Figur 3B) celler behandlet med to retninger af TTFields ved forskellige intensiteter (RMS: 1.7, 1.3, og 1,0 V / cm, henholdsvis og inkubator temperatur: 18 ° C, 24 ° C, og 28 ° C). Resultaterne viser, at mens der stadig er en betydelig reduktion i OVCAR-3 celletælling efter behandling med 1,3-V / cm TTFields (inkubator temperatur: 24 ° C), er effekten relativt lille sammenlignet med resultaterne opnået, når cellerne blev behandlet med 1,7 V / cm (inkubator temperatur: 18 ° C). U-87 MG-celler behandlet med 1,0-V / cm TTFields (inkubator temperatur: 28 ° C) viser også en lignende tendens i reduktionen af ​​celleantal, når de behandles med 1,7 V / cm, men effekten var ikke signifikant ved lavere intensiteter . <img alt="figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig1.jpg" /> FigurE 1 . TTFields skåle blev installeret på en bundplade enhed og forbundet til det fladt TTFields styrekabel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig2.jpg" /> Figur 2 . Frekvensscanning til bestemmelse af den optimale TTFields hæmmende frekvens for (A) A2780 og (B) F98 celler. Celler blev behandlet i 72 timer med TTFields med forskellige frekvenser (1,7 V / cm og 100-500 kHz). Virkningen af ​​TTFields-behandling blev estimeret under anvendelse af celleantal og klonogene analyser. Pilen angiver den optimale frekvens. Resultaterne repræsenterer gennemsnit ± SD baseret på mindst 6 replikater for hver testet frekvens. ( C ) Repræsentative billeder af den klonogene s<html> Urvival af A2780 celler efter TTFields behandling ved forskellige frekvenser. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig3.jpg" /> Figur 3 . Frekvensscanning til bestemmelse af den optimale TTFields hæmmende frekvens for (A) OVCAR-3 og (B) U-87 MG-celler. Celler blev behandlet i 72 timer med TTFields med forskellige frekvenser (100-500 kHz) og intensiteter (OVCAR-3: 1,3 og 1,7 V / cm; U-87 MG: 1,0 og 1,7 V / cm). Effekten af ​​TTFields-behandling blev estimeret ved anvendelse af celletællinger. Pilen angiver den optimale frekvens. Resultaterne repræsenterer gennemsnit ± SD baseret på mindst 6 replikater i hver testet frekvens.pg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Inkubator omgivelsestemperatur </td><td> Forventede TTFields intensiteter </td></tr><tr><td> (° C) </td><td> (V / cm RMS) </td></tr><tr><td> 18 </td><td> 1,62 </td></tr><tr><td> 19 </td><td> 1,55 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 1,48 </td></tr><tr><td> 21 </td><td> 1,41 </td></tr><tr><td> 22 </td><td> 1,33 </td></tr><tr><td> 23 </td><td> 1,26 </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 1,19 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 1.12 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 1,04 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 0,97 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 0,9 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 0,83 </td></tr><tr> &lt;td&gt; 30 </td><td> 0,76 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Inkubatoromgivelsestemperatur og forventede TTFields intensiteter inde i TTFields skålen.

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields at JoVE.com

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Tumorbehandlingsfelter (TTFields) er en effektiv antitumorbehandlingsmodalitet leveret via den kontinuerlige, ikke-invasive anvendelse af lavintensitets-, mellemfrekvens-, vekslende elektriske felter. TTFields applikation til cellelinjer ved anvendelse af et TTFields in vitro applikationssystem gør det muligt at bestemme den optimale frekvens, der fører til den højeste reduktion i celletællinger.

Bestemmelse af den optimale Inhibitorisk Frequency for kræftceller Brug Tumor Behandling Fields (TTFields)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Capture og Frigivelse af levedygtige Cirkulerende tumorceller fra Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakterisering af tumorceller ved hjælp af en medicinsk Wire for optager cirkulerende tumorceller: en 3D tilgang baseret på immunofluorescens og DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom ved hjælp af Li-Fraumeni syndrom Patient-afledte inducerede pluripotente stamceller-celler

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Den kliniske anvendelse af Tumor behandling af felter terapi i glioblastom

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Måling Bone Remodeling og genskabe Tumor-Bone Microenvironment Brug Calvaria Co-kultur og Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analyse af lungemetasase Efter Lateral Hale-Vene Injektion af tumorceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...