Name: determining the optimal inhibitory frequency for cancerous cells using tumor treating fields (ttfields)
Uploaded: 2017-05-04T15:00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields at JoVE.com

Forfattere har ingen bekreftelser.

1. TTFields In Vitro Application System - Baseplate og oppvask <ol><li> Skyll oppvasker og oppvaskdeksler under rennende vann fra springen. Skyll deretter med deionisert vann og lufttørk ansiktet ned. </li><li> Hvis et kjemoterapeutisk middel / legemiddel har blitt tilsatt til retter i et tidligere eksperiment, fyll hver tallerken med en 5% lett vaskemiddelløsning og la over natten. <ol><li> Skyll oppvasken grundig under rennende vann fra springen for å unngå spor av vaskemiddel inne i parabolen. Skyll oppvasken og dekselet med deionisert vann og lufttørret ansiktet ned. </li></ol></li><li> Sett de rene og tørre rettene med dekslene i steriliseringsposer. Tetning og plasser posene i en autoklav, med oppvaskene med forsiden ned. Autoklaver i 30 minutter, ikke høyere enn 121 ° C. </li><li> Sett autoklaven på et tørt program, delvis åpne autoklavdøren, og tørk opp i 30 minutter. </li><li> Tørk basisplaten med en klut fuktet med 70% etanol. </li> &lt;/ Ol&gt; 2. Eksperiment Setup MERK: Alt utstyr og materialer som brukes i denne protokollen er beskrevet i Materialer List. Alle trinnene nedenfor skal bli utført inne i en laminær strømningsskap mens sterile betingelser blir opprettholdt. <ol><li> Forbered rene og sterile TTFields retter og dekker, slik det er beskrevet i avsnitt 1. Tørk bunnplaten med en klut fuktet med 70% etanol. </li><li> Installer TTFields retter med deksler på basisplaten ved å trykke ned forsiktig på skålen, og roterer med urviseren med omtrent 5 mm til kanten av skålen låsene på de tre tappene på bunnplaten. Sett en steril 22 mm dekkglass (behandlet plast eller glass) på bunnen av hver skål. </li><li> Forbered cellesuspensjonen i fullstendig vekstmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium for U-87 MG og F98, RPMI for A2780 og OVCAR-3, supplert som beskrevet i Materialer List). MERK: ceLl konsentrasjoner avhenger av celletyper og forsøksvarighet, 80% -90% konfluent cellevekst bør ikke overskrides ved slutten av forsøket. FORSIKTIG: Menneskelige cellelinjer kan utgjøre en biologisk fare og skal håndteres med de nødvendige sikkerhetstiltak. </li><li> Plasser 200 μl cellesuspensjon (vanligvis 5000-20.000 celler i 200 μL for et 72-timers eksperiment, avhengig av fordoblingstiden) som en dråpe i midten av hver deksel og deksel med tallerkenlokkene. </li><li> Inkuber ved 37 ° C i en CO 2 inkubator inntil cellene kleber seg; En inkubasjon over natten er mulig på dette stadiet. </li><li> Aspirer væskene fra dråpet ved hjelp av en 200- eller 1000-l pipett. </li><li> Pett forsiktig 2 ml komplett vekstmedium for å fylle hver tallerken. Bruk en steril spiss til pipetter og trykk lett på dekselklippene for å slippe luftboblene av og til fanget under lysbildet. </li><li> Dekk dekkene med dekslene og legg dem innIde en CO2 inkubator ved 37 ° C inntil starten av TTFields behandling. </li></ol> 3. Anvendelse TTFields <ol><li> Overfør grunnplatene med de vedlagte TTFields retter til en nedkjølt CO2 inkubator. MERK: In vitro TTFields anvendelse for produksjon av damp; derfor en nedkjølt inkubator nødvendig for å kompensere for oppvarmingen av rettene. Høyere TTFields intensiteter vil produsere mer varme, og vil kreve lavere inkubatoromgivelsestemperaturer (se tabell 1). Klinisk relevante TTFields intensiteter oppnås når inkubator temperaturen for TTFields anvendelse er i området fra 18-30 ° C. </li><li> Kobler den flate kabelen hunkjønns-koblingsstykket til bunnplaten. Slå TTFields generator på. </li><li> Start TTFields in vitro søknad systemprogramvaren og velg eksperimentinnstillingene. <ol><li> Definer et nytt eksperiment. Skriv inn navnet på expEriment og eksperimentet eier i programvaren brukergrensesnitt på dataskjermen. Juster frekvensen og måltemperaturen for hver tallerken eller basisplate. </li></ol></li><li> Start programmet TTFields ved hjelp av programvaren. </li><li> Kontroller at alle rettene er riktig tilkoblet og lyse blått på skjermen. Hvis en tallerken er sirklet med en rød ramme (noe som betyr at den ikke er ordentlig tilkoblet), trykk den forsiktig ned og roter sakte frem og tilbake til kontaktene er gjenopprettet, og parabolen vises lyseblå. </li><li> La TTFields in vitro applikasjonssystem løpe i opptil 24 timer. </li><li> Hvis eksperimentet når sitt sluttpunkt, stopp eksperimentet ved å klikke på END EXPERIMENT-knappen i programvaren og fortsett til trinn 5. Hvis ikke, klikk på PAUSE-eksperiment. </li><li> Koble flatkabelkontakten fra grunnplaten. Fjern baseplaten med oppvasken fra inkubatoren i et laminar strømningsskap. </li><li> Bytt mediet i alle retteres hver 24 timer og returnerer basisplaten til kjøle inkubatoren. Koble baseplaten til generatoren ved hjelp av den flate kabel. Fortsett eksperimentet ved å klikke på Fortsett-knappen. </li></ol> 4. Kontrollprøver Merk: Grow kontrollceller i lignende forhold til TTFields-behandlede celler, unntatt TTFields søknad. <ol><li> Plate kontrollprøver med samme suspensjon og på et tilsvarende underlag som brukes for plette TTFields-behandlede prøver. </li><li> Plassere kontrollskålene i en CO2 inkubator ved 37 ° C. </li><li> Erstatte mediet i retter hver 24 timer for å matche TTFields-behandlede fatet mellom forhold. </li></ol> 5. Eksperimenter End <ol><li> Etter å ha klikket på END EKSPERIMENT, vent til programvare for å hente alle poster fra systemet og for å lagre poster til datamaskinen. </li><li> Bruk knappen RAPPORTER å vurdere temperatur, strøm og motstand log files av hver basisplate for å kontrollere at alle skålene ble behandlet i henhold til forsøksplan. MERK: Alle rapporter og logger er lagret på datamaskinen etter slutten av eksperimentet og kan bli vurdert når som helst. </li><li> Slå av TTFields generator. </li><li> Koble fra den flate kabelen fra bunnplaten og fjernes fra inkubatoren. </li><li> For å fjerne et keramisk skål, trykker ned og snu fatet mot urviseren for å låse opp fra bunnplaten. </li><li> Ta oppvasken i en laminær kabinett og aseptisk fjerne Dekk. Overføre dem til sterile petriskåler inneholdende friskt medium eller fosfat-bufret saltvann (PBS) for ytterligere inspeksjon og evaluering. </li></ol> 6. Evaluering av effekten av TTFields MERK: TTFields&#39; effekter kan bestemmes på flere måter. Bruke en eller flere av de følgende metoder for å sammenligne behandlede celler med ubehandlede kontrollceller: <ol><li> legemer<ol><li> Fjern medium / PBS fra hver dekkglass inneholdende tallerken. </li><li> Tilsett 0,5 ml av 0,25% trypsin / EDTA til hver skål og inkuberes i opp til 10 min (dvs. inntil cellene begynner å løsne fra dekkoverflaten) ved 37 ° C i en CO2 inkubator. </li><li> Tilsett 0,5 ml av hele vekstmedium for å nøytralisere trypsin og re-suspendere cellene ved forsiktig pipettering opp og ned. </li><li> Tell cellene ved hjelp av hvilken som helst standardcelletelling teknikk som er forenlig med telle lave cellekonsentrasjoner (dvs. i området rundt 20 000 celler / ml). </li></ol></li><li> klonogen analyse <ol><li> Plate et tilsvarende antall celler (100-500 celler pr skål) fra hver skål på ny, steril petriskåler eller 6-brønners plater inneholdende 2 ml friskt komplett vekstmedium. </li><li> Inkuber i en CO2 inkubator ved 37 ° C i 1-3 uker (avhengig av egenskapene til hver cellelinje) inntil kolonier bestående av ~ 50 celler blir dannet. Vurdere celleantall pr koloni ved hjelp av lysmikroskopi. </li><li> Fjern medium og skyll med PBS. </li><li> Fjern PBS og tilsett is-kald metanol (1 ml). Inkuber ved -20 ° C i 10 minutter eller lengre. </li><li> Ta av metanol. </li><li> Legg krystallfiolett-oppløsning (0,1% vekt / volum i 25% volum / volum metanol i vann) og inkuber i 20 min. FORSIKTIG: Krystallfiolett er et potensielt kreftfremkallende; bruke hansker når du arbeider med krystallfiolett. </li><li> Fjern krystallfiolett, vaskes 3 ganger med avionisert vann, og lufttørke. </li><li> Tell antall kolonier dannet på hver tallerken. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating+electric+fields+arrest+cell+proliferation+in+animal+tumor+models+and+human+brain+tumors.">Alternating electric fields arrest cell proliferation in animal tumor models and human brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (24), 10152-10157 (2007).</li><li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+cancer+cell+replication+by+alternating+electric+fields.">Disruption of cancer cell replication by alternating electric fields.</a> Cancer Res. 64 (9), 3288-3295 (2004).</li><li>Gera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+treating+fields+perturb+the+localization+of+septins+and+cause+aberrant+mitotic+exit.">Tumor treating fields perturb the localization of septins and cause aberrant mitotic exit.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li><li>Giladi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+disruption+and+reduced+clonogenicity+of+pancreatic+cancer+cells+in+vitro+and+in+vivo+by+tumor+treating+fields.">Mitotic disruption and reduced clonogenicity of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo by tumor treating fields.</a> Pancreatology. 14 (1), 54-63 (2014).</li><li>Giladi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+Spindle+Disruption+by+Alternating+Electric+Fields+Leads+to+Improper+Chromosome+Segregation+and+Mitotic+Catastrophe+in+Cancer+Cells.">Mitotic Spindle Disruption by Alternating Electric Fields Leads to Improper Chromosome Segregation and Mitotic Catastrophe in Cancer Cells.</a> Sci Rep. 5, 18046 (2015).</li><li>Giladi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating+electric+fields+(tumor-treating+fields+therapy)+can+improve+chemotherapy+treatment+efficacy+in+non-small+cell+lung+cancer+both+in+vitro+and+in+vivo.">Alternating electric fields (tumor-treating fields therapy) can improve chemotherapy treatment efficacy in non-small cell lung cancer both in vitro and in vivo.</a> Semin Oncol. 41, S35-S41 (2014).</li><li>Voloshin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating+electric+fields+(TTFields)+in+combination+with+paclitaxel+are+therapeutically+effective+against+ovarian+cancer+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Alternating electric fields (TTFields) in combination with paclitaxel are therapeutically effective against ovarian cancer cells in vitro and in vivo.</a> Int J Cancer. 139 (12), 2850-2858 (2016).</li><li>Pless, M., Droege, C., von Moos, R., Salzberg, M., Betticher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I/II+trial+of+Tumor+Treating+Fields+(TTFields)+therapy+in+combination+with+pemetrexed+for+advanced+non-small+cell+lung+cancer.">A phase I/II trial of Tumor Treating Fields (TTFields) therapy in combination with pemetrexed for advanced non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 81 (3), 445-450 (2013).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+therapy+with+tumor-treating+fields+plus+temozolomide+vs+temozolomide+alone+for+glioblastoma:+A+randomized+clinical+trial.">Maintenance therapy with tumor-treating fields plus temozolomide vs temozolomide alone for glioblastoma: A randomized clinical trial.</a> JAMA. 314 (23), 2535-2543 (2015).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NovoTTF-100A+versus+physician's+choice+chemotherapy+in+recurrent+glioblastoma:+a+randomised+phase+III+trial+of+a+novel+treatment+modality.">NovoTTF-100A versus physician's choice chemotherapy in recurrent glioblastoma: a randomised phase III trial of a novel treatment modality.</a> Eur J Cancer. 48 (14), 2192-2202 (2012).</li><li>Kanner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post+Hoc+analyses+of+intention-to-treat+population+in+phase+III+comparison+of+NovoTTF-100A+system+versus+best+physician's+choice+chemotherapy.">Post Hoc analyses of intention-to-treat population in phase III comparison of NovoTTF-100A system versus best physician's choice chemotherapy.</a> Semin Oncol. 41, S25-S34 (2014).</li><li>Miranda, P. C., Mekonnen, A., Salvador, R., Basser &amp;amp, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+electric+field+distribution+in+the+brain+for+the+treatment+of+glioblastoma.">Predicting the electric field distribution in the brain for the treatment of glioblastoma.</a> Phys Med Biol. 59 (15), 4137-4147 (2014).</li><li>Wong, E. T., Lok, E., Swanson &amp;amp, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Evidence-Based+Review+of+Alternating+Electric+Fields+Therapy+for+Malignant+Gliomas.">An Evidence-Based Review of Alternating Electric Fields Therapy for Malignant Gliomas.</a> Curr Treat Options Oncol. 16 (8), (2015).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+effect+of+an+alternating+electric+field+on+cell+proliferation+and+synergistic+antimitotic+effect+in+combination+with+ionizing+radiation.">Biological effect of an alternating electric field on cell proliferation and synergistic antimitotic effect in combination with ionizing radiation.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Kim, E. H., Song, H. S., Yoo, S. H., Yoon &amp;amp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+treating+fields+inhibit+glioblastoma+cell+migration,+invasion+and+angiogenesis.">Tumor treating fields inhibit glioblastoma cell migration, invasion and angiogenesis.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Pavesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+microfluidic+culture+platform+for+tumor-treating+field+application.">Engineering a 3D microfluidic culture platform for tumor-treating field application.</a> Sci Rep. 6, 26584 (2016).</li><li>Wong, E. T., Lok, E., Swanson &amp;amp, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+benefit+in+recurrent+glioblastoma+from+adjuvant+NovoTTF-100A+and+TCCC+after+temozolomide+and+bevacizumab+failure:+a+preliminary+observation.">Clinical benefit in recurrent glioblastoma from adjuvant NovoTTF-100A and TCCC after temozolomide and bevacizumab failure: a preliminary observation.</a> Cancer Med. , (2015).</li><li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+treatment+efficacy+and+sensitivity+are+increased+by+adjuvant+alternating+electric+fields+(TTFields).">Chemotherapeutic treatment efficacy and sensitivity are increased by adjuvant alternating electric fields (TTFields).</a> BMC Med Phys. 9, (2009).</li><li>Schneiderman, R. S., Shmueli, E., Kirson, E. D., Palti &amp;amp, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TTFields+alone+and+in+combination+with+chemotherapeutic+agents+effectively+reduce+the+viability+of+MDR+cell+sub-lines+that+over-express+ABC+transporters.">TTFields alone and in combination with chemotherapeutic agents effectively reduce the viability of MDR cell sub-lines that over-express ABC transporters.</a> BMC Cancer. 10, 229 (2010).</li><li>Connelly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planning+TTFields+treatment+using+the+NovoTAL+system-clinical+case+series+beyond+the+use+of+MRI+contrast+enhancement.">Planning TTFields treatment using the NovoTAL system-clinical case series beyond the use of MRI contrast enhancement.</a> BMC Cancer. 16 (1), (2016).</li></ol>

Porat Yaara, Giladi Moshe, Schneiderman S. Rosa, Blat Roni, Shteingauz Anna, Zeevi Einav, Munster Mijal, Voloshin Tali, Kaynan Noa, Tal Orna og Kirson D. Eilon D er betalt ansatte hos Novocure Ltd, Israel. Weinberg Uri er en betalt ansatt hos Novocure GmbH, Luzern. Yoram Palti er aksjonær hos Novocure Ltd, NY.

TTFields er en fremvoksende antitumormodalitet basert på kontinuerlig anvendelse av ordentlige avstemte alternerende elektriske felt 1 , 2 , 8 , 9 , 10 , 17 . Maksimering av antitumor-effekt er et ønskelig resultat for alle behandlingsmodaliteter. Dermed kan &quot;slåss&quot; for hver ytterligere prosent av kreftcelleveksthemming ha en signifikant effekt på det langsiktige kliniske utfallet for pasienter. Dette skyldes den nødvendige kontinuerlige naturen til TTFields applikasjon og den resulterende kumulative effekten. Maksimering av TTFields-applikasjonen kan oppnås på flere måter: (1) øke den elektriske feltintensiteten 1 , 7 , (2) lengre behandlingsvarighet 5 , (3) finne den mest effektive kombinasjonenvidere med andre behandlingsformer 18, 19, og (4) som definerer den optimale frekvens 1, 2, 4, 6, 7. Maksimering den elektriske feltstyrke på stedet av tumoren er oppnådd ved å optimalisere plasseringen av gruppene på pasientens hud; Dette gjør det mulig for levering av den maksimale feltstyrke til tumoren basert på den enkelte anatomien til pasienten 20. Forlengelse behandlingsvarighet for det meste avhengig av pasientens etterlevelse av behandling (i minst 18 timer per dag) 17. Å finne den riktige kombinasjon med andre behandlinger, og å bestemme den optimale frekvens er sterkt avhengig av in vitro-resultater som ikke validerte markører for TTFields behandlingsresultatene er for tiden tilgjengelige. I dette arbeidet har vi skissert den eksperimentelle pRutiner som kreves for å bestemme den optimale TTFields-frekvensen for kreftcellelinjer ved bruk av TTFields in vitro- applikasjonssystemet. Metodene beskrevet her kan potensielt brukes til å skjerme kombinasjonen av andre kreftbehandlingsmodaliteter ( f.eks. Kjemoterapimidler eller bestråling) med TTFields og å bestemme den optimale frekvensen for TTFields administrering for hver spesifikk kombinert behandling. I tråd med tidligere publikasjoner viser resultatene som vises her at den optimale frekvensen for behandling av både gliomceller og eggstokkreftceller er 200 kHz 1 , 7 . I dette arbeidet viste vi for første gang at den optimale TTFields frekvensen for å redusere det klonogene potensialet er forbundet med frekvensen som fører til den maksimale cytotoksiske effekten. Metodene som brukes i dette arbeidet for å kvantifisere effektene av TTFields ( dvs. cytotoksisk og klonogen) aRe bare to av mange mulige standard endpoint-analyser for å evaluere behandlingsresultater. Ytterligere behandlingsresultat tester inkluderer: (1) fiksering, farging og montering av dekselene på hvilke cellene er belagt over et mikroskop for visualisering av intracellulære strukturer; (2) utføre analyser av protein- og RNA-ekstrakter, enten fra TTFieldsene seg selv eller etter overføring av dekslet til en ny engangsskål; Og (3) trypsiniserende celler farget for strømningscytometrianalyse. Forsiktig eksperimentell planlegging vil påvirke behandlingsresultatene etter levering av TTFields. Nøkkeltrinnene inkluderer å sikre at celleproliferasjonen i hele forsøket ikke fører til overgrov og ved bruk av den riktige elektriske feltintensiteten, da intensiteter som er for høye når de påfølsomme cellelinjer, vil resultere i for få celler for de nødvendige analysene for å bestemme Den optimale frekvensen. Omvendt ble TTFields anvendt ved svært lave intensiteterPå mindre følsomme cellelinjer vil det resultere i små effekter som kan maskeres av iboende variasjon. Behandlingsloggene bør undersøkes for verdifull informasjon om temperaturstabilitet, elektriske strømmer og motstand for hver tallerken gjennom hele forsøket. Bytte feilte retter ved behandlingsstart og ekskludering av data fra en tallerken som ikke oppfyller de ønskelige behandlingsparametrene, vil minimere variabiliteten mellom replikater. Oppsummert er TTFields en fremvoksende anticancerbehandlingsmodalitet som allerede har vist effekt og sikkerhet i kliniske innstillinger 8 , 9 , 10 . Testing av TTFields i en in vitro- innstilling ved hjelp av protokollene beskrevet her kan muliggjøre optimalisering av TTFields behandlingsparametere i den kliniske innstillingen og kan utvide vår forståelse av den underliggende virkningsmekanismen.

Tumorbehandlingsfelt (TTFields) er en anti-mitotisk modalitet for behandling av glioblastom multiforme og potensielt andre krefttyper. Feltene leveres via kontinuerlig applikasjon med lav intensitet (1-3 V / cm), mellomfrekvens (100-500 kHz), vekslende elektriske felter til tumorområdet 1 , 2 . TTFields applikasjon in vitro og in vivo ble vist å hemme både veksten av forskjellige kreftcellelinjer og fremdriften av svulstene i flere dyrtumormodeller 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Pilot kliniske studier og større randomiserte studier hos pasienter med solide tumorer, inkludert glioblastom og ikke-småcellet lungekreft, har demonstrasjonvurdert sikkerheten og effektiviteten av kontinuerlig TTFields søknad 8, 9, 10. Effektiviteten av TTFields ble funnet å være: (1) frekvensavhengig, med bestemte optimale frekvenser som fører til den høyeste reduksjon i legemer på cellelinjer fra forskjellige steder for 1, 2, 4, 5, 6, 7; (2) elektrisk feltintensitetsavhengig, med en minimal terskel for aktivitet på rundt 1 V / cm og mer potente høyere intensitet 1, 2, 7, 11; (3) øket når den behandlingstid var lengre 5; og (4) høyere når 2 retnings TTFields ble påført vinkelrett på hver OTHEr, sammenlignet med elektriske felter påført fra en enkelt retning 1 . Basert på de ovennevnte funnene, kan TTFields brukes til pasienter i lang varighet ved å bruke 2 sett med transduserarrayer lokalisert på pasientens hud for å maksimere de elektriske feltintensiteter i svulstesengen 12 , 13 . Å studere effektene av TTFields på kreftceller in vitro, gir for øyeblikket den eneste måten å bestemme den optimale frekvensen som skal gjelde for en bestemt svulstype. Testing for optimal frekvens krever en enhet som muliggjør bruk av forskjellige frekvenser i området 100-500 kHz og ved intensiteter på opptil 3 V / cm rotmiddelkvadrat (RMS) til cellekulturen. Når TTFields applikasjon produserer varme, krever applikasjonssystemet muligheten til å utløse overdreven varme samtidig som det opprettholdes tett kontroll over temperaturen. Flere enheter were er utviklet gjennom årene for å tillate TTFields påføring på cellekulturer 1, 2, 5, 14, 15, 16. I alle disse anordninger ble de elektroder som benyttes isolert for å unngå de begrensninger som er involvert ved bruk av ledende elektroder, slik som elektronutveksling ved elektrodeoverflaten og frigjøring av toksiske metallioner i mediet 1. Hovedforskjellen mellom de forskjellige TTFields påføringssystemer som ble testet er den type elektrode isolasjon brukes, enten med elektroder fremstilt av metalltråder, isolert med en tynn film av isolatoren 2, 14, 15, 16 eller med en høy dielektrisk konstant materiale (f.eks, bly magnesium niobat-bly-titanate (PMN-PT)) 6. Mens isolert-trådelektroder har en relativt enkel og kostnadseffektiv løsning for TTFields anvendelse, er de ofte begrenses av den høye spenning som er nødvendig for å oppnå effektive elektriske feltstyrker over 1 V / cm terskel og ved den overflate tilgjengelig for celleplettering, som avstanden mellom elektrodene er forholdsvis liten. Systemer basert på elektroder isolert ved hjelp av en høy dielektrisk konstant materiale krever spesielle design og produksjon evner, men de krever ikke høy spenning og kan tilby et større område for cellevekst mellom elektrodene. Den TTFields in vitro anvendelse som brukes i dette arbeidet tilhører den sistnevnte klasse av systemer, med kjerneenheten være en petriskål (TTFields skål, se figur 1) som består av høy dielektrisk konstant keramikk (dvs. PMN-PT). To par elektroder er trykt vinkelrett på den ytre walls av en TTFields skål for å tillate påføring av elektriske felt fra 2 retninger. Elektrodene er forbundet med en sinusformet bølgeformgenerator og en forsterker, som gir mulighet for TTFields anvendelse i frekvensområdet 50-500 kHz. For å spre den overdreven varme, er TTFields retter holdt inne i en nedkjølt inkubator, med det mellomtemperaturkontroll utføres ved bruk av konstant overvåking av fatet temperatur og tilpasninger til den spenning som påtrykkes av systemet. I praksis vil sette kuvøse til en lavere temperatur fører til høyere elektriske feltstyrker, som det systemet øker spenningen til ønsket temperatur innenfor fatet er oppnådd. Forskjellen mellom temperaturen inne i fatet og inkubatoren temperatur kan føre til en viss fordampning, avhengig av temperaturgradientene; dermed må kulturmediet må byttes hver 24 timer for å opprettholde tilstrekkelig vekstvilkår. Protokollen nedenforbeskriver den eksperimentelle fremgangsmåte for å optimalisere anvendelsen av TTFields frekvenser til kreftceller, slik at en maksimal reduksjon i celletall og en reduksjon i potensialet av de overlevende celler til å danne kolonier blir oppnådd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>inovitro system and software</td>
			<td>Novocure</td>
			<td>ITG1000 and IBP1000</td>
			<td>Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization bags</td>
			<td>Westfield medical</td>
			<td>24882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cover slides</td>
			<td>Thermo Scientific (NUNC)</td>
			<td>174977</td>
			<td>Pre treated and sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Thermo Scientific (Menzel-Gl&#228;ser)</td>
			<td>CB00220RA1</td>
			<td>Sterilize if necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep (10000 U/mL Penicillin, 10000 &#181;g/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate solution 100 mM&#160;</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer 1M</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insuline solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>03-050-1B</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06009.2511</td>
			<td>Cool to -20 &#176;C in the freezer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>120M1445</td>
			<td>Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light detergent</td>
			<td>Alcononx</td>
			<td>242985</td>
			<td>Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer&#39;s instrutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2780</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>93112519</td>
			<td>Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 &#181;g/Ml), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12mM).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F98</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2397</td>
			<td>Grow in&#160; Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 &#181;g/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovcar-3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep&#160; (100 U/mL / 100 &#181;g/Ml), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insuline (10 &#181;g/mL).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td>Grow in&#160; Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 &#181;g/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigirated CO2 incubator</td>
			<td>CARON</td>
			<td>7404-10-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow cabinet</td>
			<td>ADS Laminair</td>
			<td>Bio12 and VSM12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the optimal inhibitory frequency for cancerous cells using tumor treating fields (ttfields)

Tumor Behandling Felt (TTFields) er en effektiv behandlingsform leveres via kontinuerlige, ikke-invasiv påføring av lav-intensitet (1-3 V / cm), vekslende elektrisk felt i frekvensområdet på flere hundre kHz. Studiet av TTFields i vevskultur blir utført ved hjelp av TTFields in vitro anvendelse system, som gjør det mulig for påføring av elektriske felt av varierende frekvenser og intensiteter til keramiske Petri-skåler med en høy dielektrisk konstant (Ɛ&gt; 5000). Cancerøse cellelinjer belagt på dekkglass i bunnen av de keramiske petriskåler utsettes for TTFields levert i to ortogonale retninger ved forskjellige frekvenser for å lette behandlingsresultat tester, for eksempel celletellinger og klonogene analyser. Resultatene presentert i denne rapport viser at den optimale frekvens av den TTFields både med hensyn til celletellinger og klonogene analyser er 200 kHz for begge ovarier og glioma-celler.

<html> Utfall etter TTFields-applikasjon når man skanner forskjellige frekvenser kan kvantifiseres basert på forskjellige analyser, som celleteller, kolorimetriske analyser, klonogene analyser og undersøkelser på endringene i antall invaderende celler ved bruk av et Boyden-kammer plassert i en spesiell høyvegg TTFields Cellekulturrett. Forsiktig eksperimentell planlegging basert på forhåndsbestemte cellefordoblingstider vil tillate at cellene når det maksimale antall mitotiske hendelser i løpet av behandlingsvarigheten, og maksimerer behandlingsresultatene. Figur 2 illustrerer et typisk frekvensskanningsresultat for en gjennomsnittlig celletall ( dvs. antall celler) og klonogen analyse av A2780 ( dvs. humane eggstokkreftceller, Figur 2A ) 7 og F-98 ( dvs. rottegliomceller;&quot;&gt; Figur 2B) 1 behandlet med to retnings-TTFields (frekvensområde: 100-500 kHz, RMS: 1,7 V / cm og inkubatortemperatur: 18 ° C). Resultatene viser en signifikant reduksjon i celletallene ved alle påførte frekvenser , Med den maksimale reduksjonen ved 200 kHz for alle testede cellelinjer (enveis ANOVA med flere sammenligninger). Den optimale frekvensen som førte til den høyeste reduksjonen i det klonogene potensialet var det samme for både A2780 og F98 celler ( figur 2B og C ) Pearson-korrelasjonskoeffisienten mellom celletallet og den klonogene effekten ved hver frekvens var 0,967 (p = 0,002) og 0,755 (p = 0,083) for henholdsvis A2780 og F98. Figur 3 viser et frekvensskanningsresultat for gjennomsnittlig celletall for OVCAR-3 ( dvs. humane eggstokkreftceller, Figur 3A ) og U-87 MG (dvs. humane gliomceller; figur 3B) celler behandlet med to retninger av TTFields ved forskjellige intensiteter (RMS: 1,7, 1,3 og 1,0 V / cm, henholdsvis, og inkubatoren temperatur: 18 ° C, 24 ° C, og 28 ° C, henholdsvis). Resultatene viser at mens det fremdeles er et betydelig reduksjon i OVCAR-3 celletall etter behandling med 1,3 V / cm TTFields (inkubator temperatur: 24 ° C), er virkningen forholdsvis liten sammenlignet med de resultater som ble oppnådd når cellene ble behandlet med 1,7 V / cm (inkubator temperatur: 18 ° C). U-87 MG-celler ble behandlet med 1,0-V / cm TTFields (inkubator temperatur: 28 ° C) viser også en lignende trend i reduksjon av celleantallet som når den ble behandlet med 1,7 V / cm, men virkningen var ikke signifikant ved lavere intensiteter . <img alt="Figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig1.jpg" /> FigurE 1 . TTFields retter ble installert på en base plate enhet og koblet til den flate TTFields styrekabel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig2.jpg" /> Figur 2 . Frekvenssøk for bestemmelse av optimal TTFields hemmende frekvens for (A) A2780 og (B) F98 celler. Celler ble behandlet i 72 timer med TTFields med forskjellige frekvenser (1,7 V / cm og 100-500 kHz). Effekten av TTFields-behandling ble estimert ved bruk av celletall og klonogene analyser. Pilen indikerer optimal frekvens. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SD basert på minst 6 replikater for hver testet frekvens. ( C ) Representative bilder av klonogen s<html> urvival av A2780-celler etter behandling TTFields ved forskjellige frekvenser. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55820/55820fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig3.jpg" /> Figur 3. Frekvens skanner for bestemmelse av den optimale TTFields hemmende frekvens for (A), OVCAR-3, og (B) U-87 MG-celler. -Celler ble behandlet i 72 timer med TTFields med forskjellige frekvenser (100 til 500 kHz) og intensitet (OVCAR-3: 1,3 og 1,7 V / cm, U-87 MG: 1,0 og 1,7 V / cm). Effekten av TTFields behandling ble beregnet ved hjelp av celleantallet. Pilen angir den optimale frekvens. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SD basert på minst 6 replikater på hver frekvens testet.Pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Inkubatoromgivelsestemperatur </td><td> Forventet TTFields intensiteter </td></tr><tr><td> (° C) </td><td> (V / cm RMS) </td></tr><tr><td> 18 </td><td> 1,62 </td></tr><tr><td> 19 </td><td> 1,55 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 1,48 </td></tr><tr><td> 21 </td><td> 1,41 </td></tr><tr><td> 22 </td><td> 1,33 </td></tr><tr><td> 23 </td><td> 1,26 </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 1,19 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 1.12 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 1,04 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 0,97 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 0,83 </td></tr><tr> &lt;td&gt; 30 </td><td> 0,76 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Inkubatorens omgivelsestemperatur og forventede TTFields intensiteter inne i TTFields parabolen.

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields at JoVE.com

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Tumor Behandling felter (TTFields) er et effektivt antitumorbehandling modalitet leveres via kontinuerlige, ikke-invasiv påføring av lav intensitet, mellomfrekvens, vekslende elektriske felt. TTFields påføring på cellelinjer ved hjelp av en TTFields in vitro anvendelse system gjør det mulig for bestemmelse av den optimale frekvens som fører til den høyeste reduksjon i celletall.

Bestemme Optimal Hemmende Frekvens for kreftceller Bruke Tumor Behandling av Fields (TTFields)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Capture and Release av Levedyktige Sirkulasjonstumorceller fra Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakteristikk av tumorceller bruke en medisinsk ledning for å fange sirkulerende kreftceller: en 3D tilnærming basert på Immunofluorescence og DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellering Osteosarcoma bruker Li-Fraumeni syndrom pasient-avledede Induced Pluripotent stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Klinisk anvendelse av svulst behandling av feltene terapi i glioblastom

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Måle beinremodellering og gjenskape tumor-bone mikromiljøet ved hjelp av Calvaria co-kultur og histomorfometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analyse av lungemetastase etter lateral hale-vene injeksjon av tumorceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...