Name: monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+
Uploaded: 2017-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+ at JoVE.com

Diese Arbeit wurde gefördert von NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B &amp; B Seed Grant und einem NIH Supplemental Grant an FR, BB-Stipendium an CM, CDT-Stipendium an RG.

1. Folienvorbereitung <ol><li> Platzieren Sie 22 mm x 40 mm Glasmikroskop-Objektträger in 6 cm Zellkulturschalen, 1 Folie pro Teller. </li><li> Setzen Sie jede Seite jeder Folie sowie die 6 cm Schale zu ultraviolettem (UV) Licht für 15-20 min, um in einer sterilen Kapuze zu sterilisieren. </li><li> Decken Sie das Geschirr mit Folien innen mit Parafilm und lagern bei 4 ° C bis zum Gebrauch. </li></ol> 2. Vorbereitung von Medien, Puffern, Lösungen und Reagenzien <ol><li> 1 l Hanks ausgeglic...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).</li><li>Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+signaling+and+sensor.">Fast kinetics of calcium signaling and sensor.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).</li><li>Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+of+intracellular+Ca2+:+Molecular+determinants+and+functional+consequences.">Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences.</a> Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum:+a+multifunctional+signaling+organelle.">The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle.</a> Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-chloro-m-cresol,+a+potent+and+specific+activator+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).</li><li>Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+receptor:+phosphorylation+by+protein+kinase+C+and+calcium+calmodulin-dependent+protein+kinases+in+reconstituted+lipid+vesicles.">Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).</li><li>Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+via+P2-purinergic+receptors+for+extracellular+ATP+and+other+nucleotides.">Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides.</a> Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).</li><li>Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+increases+intracellular+calcium+in+supraoptic+neurons+by+activation+of+both+P2X+and+P2Y+purinergic+receptors.">ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Pumps+in+Health+and+Disease.">Calcium Pumps in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).</li><li>Michelangeli, F., East, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diversity+of+SERCA+Ca2++pump+inhibitors.">A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors.</a> Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).</li><li>Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dynamics+measured+in+agonist-sensitive+stores+of+single+living+intact+cells:+a+new+look+at+the+refilling+process.">Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process.</a> Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+For+InSitu+Measurement+of+Calcium+in+Intracellular+Inositol+1,4,5-Trisphosphate-Sensitive+Stores+Using+The+Fluorescent+Indicator+Mag-Fura-2.">Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).</li><li>Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+indicator+for+measuring+cytosolic+free+magnesium.">A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium.</a> Am J Physiol. 256, (1989).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li><li>Heim, N., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Indicators+of+Cellular+Calcium+Dynamics+Based+on+Troponin+C+and+Green+Fluorescent+Protein.">Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein.</a> J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+C-based+biosensors:+A+new+family+of+genetically+encoded+indicators+for+in+vivo+calcium+imaging+in+the+nervous+system.">Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system.</a> Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).</li><li>Carlson, H. J., Campbell, R. 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Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2++dynamics+in+high+Ca2++concentration+cellular+compartments.">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+sensors+for+real-time+measurement+of+high+Ca2++concentrations.">Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations.</a> Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).</li><li>Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++concentration+after+Ca2++release+in+skeletal+myofibers+from+young+adult+and+old+mice.">Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice.</a> Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+suppress+the+thermosensitivity+of+green+fluorescent+protein.">Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).</li><li>Reddish, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).</li><li>Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+endoplasmic+reticulum+stored+calcium+regulation+by+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+ryanodine+receptors.">Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).</li><li>Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium signaling protocols. , (1999).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).</li></ol>

Live-Einzelzell-Bildgebung von fluoreszierenden Sonden wie CatchER + ist eine effektive Technik zur Analyse komplizierter ER / SR Ca 2+ -Signalisierungsprozesse in jeder Zelle als Reaktion auf Rezeptor-Agonisten oder -Antagonisten. Diese Technik eignet sich auch für die Bildgebung unter Verwendung von mehreren Wellenlängen gleichzeitig, wie sie für Fura-2 benötigt werden, oder um Catcher + und Rhod-2 zusammen zu bilden, um sowohl ER- als auch cytosolische Calciumänderungen zu überw...

Die räumlich-zeitlichen Attribute von intrazellulären Calcium (Ca 2+ ) transienten aktivieren verschiedene biologische Funktionen 1 . Diese Ca 2+ -Signalisierungsereignisse werden extrazellulär durch verschiedene Reize ausgelöst und intrazellulär durch die Haupt-Ca 2+ -Speicherorganelle und durch zahlreiche Ca 2+ -Pumpen, Kanäle und Ca 2+ -bindende Proteine ​​kontrolliert. Ca 2+ -Transienten können durch Defekte mit Signalmodulation signifikant verändert werden, was zu unterschiedlichen Erkrankungen führt 2 . Aufgrund der Geschwindigkeit und Kompliziertheit des Ca 2+ -Signalisierungssystems werden mit dem endo- (ER) und dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) im Zentrum genetisch kodierte Ca 2+ -Sonden benötigt, die für die Expression von Säugetieren mit schneller Kinetik optimiert wurden Um globale und lokale Ca 2+ Veränderungen in verschiedenen Zellen zu beobachten 3 . Die ER und die SR, Sein Gegenstück in Muskelzellen, sind die wichtigsten intrazellulären Ca 2+ -Speicherorganellen und wirken als Ca 2+ -Senken, die zur Verstärkung des Ca 2+ -Signals 4 beitragen. Das ER / SR ist ein integraler Bestandteil der Ca 2+ -Signalisierung mit Doppelrollen als Sender und Empfänger von Signalen 5 . Der Ryanodinrezeptor (RyR) und der Inositol-1,4,5-Triphosphatrezeptor (IP 3 R) sind Ca 2+ -Auslösungsrezeptoren, die sich auf den Membranen des ER / SR befinden, die durch Ca 2+ 6 reguliert werden. Andere Wirkstoffe stimulieren direkt oder indirekt die Funktion dieser Rezeptoren. 4-Chlor-m-cresol (4-cmc) ist ein starker Agonist des RyR mit einer 10fach höheren Empfindlichkeit als Koffein zur Induktion der SR Ca 2+ -Ausgabe, bei der beide regelmäßig zur Untersuchung der RyR-vermittelten Ca 2+ -Ausgabe eingesetzt werden Gesunde und kranke Zellen 7 . ATP erhöht IP 3- vermittelte Ca 2+ reLeasing durch die IP 3 R 8 . ATP bindet an den purinergischen Rezeptor P2YR, einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), der die Produktion von IP 3 auslöst, die an die IP 3 R bindet, um Ca 2+ aus dem ER 9 , 10 freizusetzen. Die Sacco-endoplasmatische Retikulum-Calcium-ATPase-Pumpe (SERCA) ist eine PP-ATPase-Pumpe, die sich ebenfalls auf der ER / SR-Membran befindet, die das zytosolische Ca 2+ reduziert und das ER / SR durch ein aktives Pumpen des Ions in das ER / SR-Lumen auffüllt 11 Spezifische Inhibitoren der SERCA-Pumpe umfassen Thapsigargin, von Thapsia garganica und Cyclopiazonsäure (CPA), von Aspergillus und Penicillium . CPA hat eine geringe Affinität für die Pumpe und blockiert den Ca 2+ Zugangspunkt 12 reversibel. Thapsigargin hingegen bindet irreversibel an die Ca 2+ freie Pumpe am Rest F256 in der M3-Helix mit NanomolAr affinität 11 Die Analyse und Quantifizierung der Veränderungen in Ca 2+ stimulierten Ereignissen war und bleibt eine Herausforderung. Da das ER / SR das wichtigste subzelluläre Ca 2+ -haltige Kompartiment mit einer zentralen Funktion bei der Ausbreitung des Ca 2+ -Signals ist, wurde viel Arbeit auf das Verständnis der ER / SR Ca 2+ -Signalisierung 5 konzentriert. Die Schaffung von synthetischen Ca 2+ -Farbstoffen hat dazu beigetragen, das Feld und die Praxis der Ca 2+ -Bildgebung voranzutreiben. Obwohl Farbstoffe wie Mag-Fura-2 weit verbreitet sind, um kompartimentiertes Ca 2+ in verschiedenen Zellen, 13 , 14 , 15 zu messen , haben sie Einschränkungen wie unebene Farbstoffbeladung, Photobleichung und die Unfähigkeit, auf spezifische Organellen gerichtet zu sein . Die Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und die Weiterentwicklung von fluoreszierendem Protein-Basierte Ca 2+ - Sonden hat das Feld der Ca 2+ - Bildgebung vorangetrieben 16 . Einige der vorhandenen GECIs sind Förster-Resonanz-Energieübertragungs- (FRET-) Paare mit gelbem Fluoreszenzprotein (YFP), Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP), Calmodulin und dem M13-Bindungspeptid 17 , 18 . Troponin C-basierte GECIs sind auch als FRET-Paare von CFP und Citrin und als einzelne Fluorophor-Sonden 19 , 20 , 21 erhältlich. Andere, wie GCaMP2 und R-GECO sind einzelne Fluorophore-Sensoren mit Calmodulin 22 , 23 . Um die Einschränkungen der engen Abstimmung von K d &#39;s und kooperativer Bindung zu überwinden, die mit mehreren Ca 2+ Bindungsstellen assoziiert sind, die in ihren Ca 2+ -Bindungsdomänen 24 gefunden wurden , wurde eine neue Klasse von Calcium senSors wurde durch die Konstruktion einer Ca 2+ -Bindungsstelle auf der Oberfläche des Beta-Fasses in einer chromophoreempfindlichen Stelle von verstärktem grün fluoreszierendem Protein (EGFP) 25 , 26 hergestellt. Dieser hochgeladene Sensor, genannt CatchER, hat eine Kd von ~ 0,18 mM, ak in der Nähe der Diffusionsgrenze und ak off von 700 s -1 . Catcher wurde verwendet, um die Rezeptor-vermittelte ER / SR-Calciumfreisetzung in verschiedenen Säugetierzelllinien wie HeLa, HEK293 und C2C12 25 zu überwachen. Wegen seiner schnellen Kinetik wurde CatchER in den Flexor digitorum brevis (FDB) Muskelfasern der jungen und alten Freund Virus B NIH Jackson (FVB) Mäuse verwendet, um zu zeigen, dass mehr Ca 2+ im SR nach 2 s Depolarisation in der FDB bleibt Fasern von alten Mäusen im Vergleich zu denen junger Mäuse 27 . Um seine niedrige Fluoreszenz bei 37 ° C zu überwinden, was seine Anwendungen bei der Calcium-Bildgebung von Säugetieren behindertZellen haben wir eine verbesserte Version von Catcher namens CatchER + entwickelt. Catcher + zeigt eine verbesserte Fluoreszenz bei 37 ° C für eine bessere Anwendung in Säugetierzellen. Zusätzliche Mutationen wurden in CatchER integriert, um die Thermostabilität und Fluoreszenz bei 37 ° C 28 , 29 zu verbessern, um CatchER + zu erzeugen. Catcher + zeigt eine sechsseitige Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) gegenüber CatchER 30 . Hier werden die Protokolle für die Kultur und Transfektion von HEK293- und C2C12-Zellen mit CatchER + und deren Anwendung zur Überwachung von ER / SR-Rezeptor-vermittelten Calcium-Transienten vorgestellt. Repräsentative Ergebnisse sind für CatchER + gezeigt, die in HEK293-Zellen exprimiert wurden, die mit 4-cmc, CPA und ATP behandelt wurden. Wir liefern auch ein Protokoll zur Bestimmung der in situ Kd von CatchER + in C2C12 Myoblastenzellen und quaNtifizierung von basal [Ca 2+ ].

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C55402</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515DCXR dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>NC338059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>102382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopiazonic Acid (CPA)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>239805</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>41095-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning 111 Valve Lubricant &#38; Sealant</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) 
			tetraacetic Acid (EGTA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>409911000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140087</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;12-544B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4891</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>391340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil without autofluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11513859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Free Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-230-5804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26GLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51985034</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Dibasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1565</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterivex-GV 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SVGVB1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Till Polychrome V Xenon lamp</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red (10X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15090046</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+

Intrazelluläre Calcium (Ca 2+ ) -Transienten, die durch extrazelluläre Reize hervorgerufen werden, initiieren eine Vielzahl biologischer Prozesse in lebenden Organismen. Im Zentrum der intrazellulären Calciumfreisetzung befinden sich die wichtigsten intrazellulären Calciumlagerorganellen, das endoplasmatische Retikulum (ER) und das spezialisierte sarkoplasmatische Retikulum (SR) in Muskelzellen. Die dynamische Freisetzung von Calcium aus diesen Organellen wird durch den Ryanodinrezeptor (RyR) und den Inositol-1,4,5-Triphosphat-Rezeptor (IP 3 R) vermittelt, wobei das Nachfüllen durch die Sacco / endoplasmatische Retikulum-Calcium-ATPase (SERCA) -Pumpe erfolgt. Ein genetisch kodierter Kalziumsensor (GECI) namens CatchER wurde erstellt, um die schnelle Kalziumfreisetzung aus dem ER / SR zu überwachen. Hier sind die detaillierten Protokolle für die Transfektion und Expression des verbesserten ER / SR-zielgerichteten GECI CatchER + in HEK293 und C2C12 Zellen und deren Anwendung bei der Überwachung von IP 3 R, RyR und SERCA pumpenvermittelter Calcium transientS in HEK293-Zellen mit Fluoreszenzmikroskopie ist umrissen. Der Rezeptor-Agonist oder Inhibitor der Wahl wird in der Kammerlösung dispergiert und die Intensitätsänderungen werden in Echtzeit aufgezeichnet. Bei dieser Methode wird bei RyR-Aktivierung mit 4-Chlor-m-cresol (4-cmc), der indirekten Aktivierung von IP 3 R mit Adenosintriphosphat (ATP) und Hemmung der SERCA-Pumpe mit Cyclopiazon eine Abnahme von ER-Calcium beobachtet Säure (CPA). Wir diskutieren auch Protokolle zur Bestimmung der in situ K d und quantifizierenden basalen [Ca 2+ ] in C2C12-Zellen. Zusammenfassend können diese Protokolle, die in Verbindung mit CatchER + verwendet werden, eine Rezeptor-vermittelte Calciumfreisetzung aus dem ER mit einer zukünftigen Anwendung beim Studium von ER / SR-Calcium-verwandten Pathologien hervorrufen.

Dieser Abschnitt veranschaulicht die Ergebnisse, die mit den zuvor beschriebenen Methoden unter Verwendung des optimierten ER / SR-zielgerichteten GECI CatchER + erreicht wurden, um Änderungen in ER / SR Ca 2+ durch verschiedene Rezeptor-vermittelte Wege zu überwachen. Abbildung 1 zeigt die ER-Entleerung durch den mit 200 μM 4-cmc stimulierten RyR. 4-cmc ist ein Agonist de...

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Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Wir präsentieren Protokolle für die Anwendung unseres gezielten genetisch codierten Calciumindikators (GECI) CatchER + zur Überwachung von schnellen Calcium-Transienten im endoplasmatischen / sarkoplasmatischen Retikulum (ER / SR) von HEK293 und Skelettmuskel-C2C12-Zellen mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie. Ein Protokoll für die in situ K d Messung und Kalibrierung wird ebenfalls diskutiert.

Monitoring ER / SR Calcium Release mit dem gezielten Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor Catcher<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Überwachung Aktin Demontage mit Zeitraffer-Mikroskopie

Forschung

Biologie

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Loading Drosophila Nerve Terminals mit Calcium-Indikatoren

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

Funktionelle Bildgebung mit Verstärkung, Eyetracking und Physiologische Überwachung

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

Freisetzung von Dopamin an den einzelnen präsynaptischen visualisiert FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

Whole-Cell Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in menschlichen T-Lymphozyten

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...