Name: monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+
Uploaded: 2017-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+ at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato da NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B &amp; B Seed Grant e un Supplemental Grant NIH a FR, borsa di BB a CM, borsa CDT a RG.

1. Preparazione delle diapositive <ol><li> Porre vetrini da microscopio da 22 mm x 40 mm in piatti da coltura a cellule da 6 cm, 1 vetrino per piatto. </li><li> Esporre ogni lato di ciascuna diapositiva come pure il piatto da 6 cm a luce ultravioletta (UV) per 15-20 minuti per sterilizzare in un cappuccio sterile. </li><li> Coprire i piatti con diapositive all&#39;interno con parafilm e conservare a 4 ° C fino a quando non sarà pronto per l&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione di supporti, buffe...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).</li><li>Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+signaling+and+sensor.">Fast kinetics of calcium signaling and sensor.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).</li><li>Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+of+intracellular+Ca2+:+Molecular+determinants+and+functional+consequences.">Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences.</a> Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum:+a+multifunctional+signaling+organelle.">The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle.</a> Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-chloro-m-cresol,+a+potent+and+specific+activator+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).</li><li>Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+receptor:+phosphorylation+by+protein+kinase+C+and+calcium+calmodulin-dependent+protein+kinases+in+reconstituted+lipid+vesicles.">Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).</li><li>Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+via+P2-purinergic+receptors+for+extracellular+ATP+and+other+nucleotides.">Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides.</a> Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).</li><li>Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diversity+of+SERCA+Ca2++pump+inhibitors.">A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors.</a> Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).</li><li>Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dynamics+measured+in+agonist-sensitive+stores+of+single+living+intact+cells:+a+new+look+at+the+refilling+process.">Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process.</a> Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+For+InSitu+Measurement+of+Calcium+in+Intracellular+Inositol+1,4,5-Trisphosphate-Sensitive+Stores+Using+The+Fluorescent+Indicator+Mag-Fura-2.">Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).</li><li>Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+indicator+for+measuring+cytosolic+free+magnesium.">A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium.</a> Am J Physiol. 256, (1989).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. 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Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+C-based+biosensors:+A+new+family+of+genetically+encoded+indicators+for+in+vivo+calcium+imaging+in+the+nervous+system.">Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system.</a> Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).</li><li>Carlson, H. J., Campbell, R. 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Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2++dynamics+in+high+Ca2++concentration+cellular+compartments.">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+sensors+for+real-time+measurement+of+high+Ca2++concentrations.">Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations.</a> Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).</li><li>Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++concentration+after+Ca2++release+in+skeletal+myofibers+from+young+adult+and+old+mice.">Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice.</a> Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+suppress+the+thermosensitivity+of+green+fluorescent+protein.">Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).</li><li>Reddish, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).</li><li>Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. 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L&#39;imaging a cellule singole di sonde fluorescenti, come CatchER + , è una tecnica efficace per analizzare i processi di segnalazione intrinsecamente ER / SR Ca 2+ in ogni cellula in risposta a agonisti o antagonisti del recettore. Questa tecnica è utile anche per l&#39;imaging utilizzando più lunghezze d&#39;onda contemporaneamente, come è necessario per Fura-2 o per l&#39;immagine CatchER + e Rhod-2 insieme per monitorare rispettivamente i cambiamenti di calcio ER e citosolici. ...

Gli attributi spazio-temporali dei transitori intracellulari del calcio (Ca 2+ ) attivano varie funzioni biologiche 1 . Questi eventi di segnalazione Ca 2+ vengono scatenati extracellulari attraverso diversi stimoli e controllati intracellulariamente dalle principali organelle di stoccaggio Ca 2+ e da numerose Ca 2+ pompe, canali e proteine ​​leganti Ca 2+ . I transitori Ca 2+ possono essere alterati in modo significativo a causa di difetti con la modulazione del segnale, portando a diverse malattie 2 . A causa della velocità e dell&#39;intricacy del sistema di segnalazione Ca 2+ , con il reticolo endo- (ER) e sarcoplasmatico (SR) al centro, sono necessarie sonde Ca 2+ geneticamente codificate che sono state ottimizzate per l&#39;espressione dei mammiferi con una rapida cinetica Per osservare i cambiamenti globali e locali di Ca 2+ in cellule diverse 3 . L&#39;ER e la SR, La sua controparte nelle cellule muscolari, sono i principali organoli di storage Ca 2+ intracellulari e fungono da pozzetti Ca 2+ che aiutano ad amplificare il segnale Ca 2+ 4 . L&#39;ER / SR è parte integrante della segnalazione Ca 2+ con doppio ruolo come trasmettitore e ricevitore di segnali 5 . Il recettore del ryanodine (RyR) e il recettore inositolo 1,4,5-trifosfato (IP 3 R) sono recettori di rilascio Ca 2+ situati sulle membrane del ER / SR regolate da Ca 2+ 6 . Altri agenti stimolano direttamente o indirettamente la funzione di questi recettori. 4-cloro-m-cresolo (4-cmc) è un potente agonista della RyR, con una sensibilità più alta di 10 volte rispetto alla caffeina per indurre la liberazione di SR Ca 2+, dove entrambi sono regolarmente impiegati per studiare la rilascio Ca 2+ mediata da RyR Cellule sane e malate 7 . ATP aumenta il Ca 2+ re mediato da IP 3Leasing attraverso il IP 3 R 8 . ATP si lega al recettore purinergico P2YR, un recettore accoppiato a proteine ​​G (GPCR), innescando la produzione di IP 3 che si lega all&#39;IP 3 R per rilasciare Ca 2+ dalla ER 9 , 10 . La pompa di calcio ATPase (SERCA) di tipo reticolare sarco-endoplasmatico è una pompa ATPasi tipo P, situata anche sulla membrana ER / SR che riduce la Ca 2+ citosolica e ricarica l&#39;ER / SR attivamente pompando lo ione nel lumen ER / SR 11 . Gli inibitori specifici della pompa SERCA includono thapsigargin, da Thapsia garganica e acido ciclopiazonico (CPA), da Aspergillus e Penicillium . La CPA ha una bassa affinità per la pompa e reversibilmente blocca il punto di accesso Ca 2+ 12 . Thapsigargin, d&#39;altro canto, si lega irreversibilmente alla pompa libera Ca 2+ al residuo F256 nell&#39;elica M3 con nanomoloAffinità 11 . Analizzare e quantificare i cambiamenti coinvolti negli eventi stimolati da Ca 2+ è stato e rimane una sfida. Dal momento che l&#39;ER / SR è il principale contenitore subcellulare Ca 2+ contenente una funzione centrale nella propagazione del segnale Ca 2+ , molti lavori sono stati focalizzati sulla comprensione del segnale ER / SR Ca 2+ 5 . La creazione di coloranti sintetici Ca 2+ ha contribuito a promuovere il campo e la pratica dell&#39;immagine Ca 2+ . Anche se i coloranti, come Mag-Fura-2, sono stati ampiamente utilizzati per misurare Ca 2+ compartimentalizzati in diverse cellule, 13 , 14 , 15 hanno limitazioni quali il caricamento di tinte non uniformi, la fotolibrazione e l&#39;incapacità di essere destinati a specifici organelli . La scoperta della proteina fluorescente verde (GFP) e l&#39;avanzamento delle proteine ​​fluorescenti-Sonde Ca 2+ ha spinto il campo di Ca 2+ in avanti 16 . Alcuni dei GECI esistenti sono coppie di trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) che coinvolgono la proteina fluorescente gialla (YFP), la proteina fluorescente cianica (CFP), il calmodulina e il peptide legante M13 17 , 18 . I GECI a base di Troponin C sono disponibili anche come coppia FRET di CFP e Citrine e come singole sonde di fluoroforo 19 , 20 , 21 . Altri, come GCaMP2 e R-GECO, sono singoli sensori fluorofori coinvolgenti la calmodulina 22 , 23 . Per superare le limitazioni della sintonizzazione stretta di K d e di legame cooperativo associato a più siti di legame Ca 2+ trovati nei loro domini 24 legati alla Ca 2+ , una nuova classe di calcio senI disordini sono stati creati progettando un sito di legame Ca 2+ sulla superficie del barile beta in una posizione sensibile al cromoforo di proteine ​​fluorescenti verde avanzate (EGFP) 25 , 26 . Questo sensore altamente protetto, chiamato CatchER, ha un K d di ~ 0,18 mM, ak vicino al limite di diffusione e ak off di 700 s -1 . CatchER è stato usato per monitorare il rilascio di calcio ER / SR mediato dal recettore in diverse linee cellulari di mammiferi come HeLa, HEK293 e C2C12 25 . A causa della sua rapida cinetica, CatchER è stato utilizzato in fibre muscolari flexor digitorum brevis (FDB) di topi giovani e vecchi Friend Virus B NIH Jackson (FVB) per rivelare che più Ca 2+ rimane nella SR dopo 2 s di depolarizzazione nella FDB Fibre di vecchi topi rispetto a quelli dei giovani topi 27 . Per superare la sua bassa fluorescenza a 37 ° C, che ostacola le sue applicazioni nell&#39;immagine del calcio di mammiferiAbbiamo sviluppato una versione migliorata di CatchER chiamata CatchER + . CatchER + mostra una migliore fluorescenza a 37 ° C per una migliore applicazione nelle cellule dei mammiferi. Ulteriori mutazioni sono state incorporate in CatchER per migliorare la termostabilità e la fluorescenza a 37 ° C 28 , 29 , per creare CatchER + . CatchER + mostra un aumento del suo rapporto segnale / rumore (SNR) di sei volte rispetto a CatchER 30 . Qui vengono presentati i protocolli per la cultura e la trasfezione delle cellule HEK293 e C2C12 con CatchER + e la sua applicazione per il monitoraggio dei transienti di calcio mediati dal recettore ER / SR. I risultati rappresentativi sono mostrati per CatchER + espresso in cellule HEK293 trattate con 4-cmc, CPA e ATP. Inoltre forniamo un protocollo per la determinazione del in situ K d di CatchER + in cellule miooblasto C2C12 e quaDi basale [Ca 2+ ].

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C55402</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515DCXR dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>NC338059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>102382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopiazonic Acid (CPA)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>239805</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>41095-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning 111 Valve Lubricant &#38; Sealant</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) 
			tetraacetic Acid (EGTA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>409911000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140087</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;12-544B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4891</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>391340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil without autofluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11513859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Free Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-230-5804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26GLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51985034</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Dibasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1565</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterivex-GV 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SVGVB1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Till Polychrome V Xenon lamp</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red (10X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15090046</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+

I transitori intracellulari di calcio (Ca 2+ ) evocati da stimoli extracellulari iniziano una moltitudine di processi biologici negli organismi viventi. Al centro del rilascio di calcio intracellulare sono i principali organici intracellulari di stoccaggio del calcio, il reticolo endoplasmatico (ER) e il reticolo sarcoplasmatico più specializzato (SR) nelle cellule muscolari. La liberazione dinamica del calcio da questi organelli è mediata dal recettore del ryanodine (RyR) e dall&#39;inositolo 1,4,5-trifosfato (IP 3 R) con ricarico che si verificano attraverso la pompa sarco / endoplasmatica calcio ATPase (SERCA). Un sensore di calcio geneticamente codificato (GECI) chiamato CatchER è stato creato per monitorare il rilascio rapido del calcio dalla ER / SR. Ecco i protocolli dettagliati per la trasfezione e l&#39;espressione del migliorato GECI CatchER + targeting ER / SR nelle cellule HEK293 e C2C12 e la sua applicazione nel monitoraggio del transitorio di calcio mediato dalla pompa IP 3 R, RyR e SERCAIn cellule HEK293 utilizzando microscopia a fluorescenza è descritto. L&#39;agonista del recettore o l&#39;inibitore della scelta è disperso nella soluzione della camera e i cambiamenti di intensità sono registrati in tempo reale. Con questo metodo si osserva una diminuzione del calcio ER con attivazione di RyR con 4-cloro-m-cresolo (4-cmc), l&#39;attivazione indiretta di IP 3 R con adenosina trifosfato (ATP) e l&#39;inibizione della pompa SERCA con ciclopiazonico Acido (CPA). Discutiamo anche i protocolli per la determinazione del K d in situ e la quantificazione basale [Ca 2+ ] nelle cellule C2C12. In sintesi, questi protocolli, usati in combinazione con CatchER + , possono elicitare il rilascio di calcio mediato dal recettore dalla ER con applicazione futura nello studio delle patologie correlate al calcio ER / SR.

Questa sezione illustrerà i risultati ottenuti utilizzando i metodi precedentemente descritti usando il GECI CatchER + mirato ER / SR mirato per monitorare i cambiamenti in ER / SR Ca 2+ attraverso diversi percorsi mediati dal recettore. La figura 1 illustra lo svuotamento ER attraverso il RyR stimolato con 200 μM di 4 cm. 4-cmc è un agonista del RyR. L&#39;aggiunta del fa...

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Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Presentiamo protocolli per l&#39;applicazione del nostro indicatore di calcio (GECI) CatchER + per il monitoraggio dei rapidi transitori di calcio nel reticolo endoplasmatico / sarcoplasmatico (ER / SR) di HEK293 e delle cellule del muscolo scheletrico C2C12 utilizzando microscopia a fluorescenza in tempo reale. Viene inoltre discusso un protocollo per la misura e la calibrazione in K d in situ .

Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensore CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia

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Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasi SERCaMP

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