Name: monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+
Uploaded: 2017-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+ at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B &amp; B Seed Grant, og en NIH Supplementary Grant til FR, BB fellesskap til CM, CDT fellesskap til RG.

1. Skyv forberedelse <ol><li> Plasser 22 mm x 40 mm glassmikroskopriller i 6 cm cellekulturretter, 1 lysbilde per fat. </li><li> Utsett hver side av hvert lysbilde samt 6 cm tallerken til ultrafiolett (UV) lys i 15-20 minutter for sterilisering i en steril hette. </li><li> Tørk opp servantene med lysbilder på innsiden med parafilm og lagre ved 4 ° C til bruksklar. </li></ol> 2. Fremstilling av medier, buffere, løsninger og reagenser <ol><li> Forbered 1 L av Hank balansert saltløsning (HB...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).</li><li>Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+signaling+and+sensor.">Fast kinetics of calcium signaling and sensor.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).</li><li>Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+of+intracellular+Ca2+:+Molecular+determinants+and+functional+consequences.">Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences.</a> Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum:+a+multifunctional+signaling+organelle.">The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle.</a> Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-chloro-m-cresol,+a+potent+and+specific+activator+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).</li><li>Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+receptor:+phosphorylation+by+protein+kinase+C+and+calcium+calmodulin-dependent+protein+kinases+in+reconstituted+lipid+vesicles.">Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).</li><li>Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+via+P2-purinergic+receptors+for+extracellular+ATP+and+other+nucleotides.">Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides.</a> Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).</li><li>Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+increases+intracellular+calcium+in+supraoptic+neurons+by+activation+of+both+P2X+and+P2Y+purinergic+receptors.">ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Pumps+in+Health+and+Disease.">Calcium Pumps in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).</li><li>Michelangeli, F., East, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diversity+of+SERCA+Ca2++pump+inhibitors.">A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors.</a> Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).</li><li>Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dynamics+measured+in+agonist-sensitive+stores+of+single+living+intact+cells:+a+new+look+at+the+refilling+process.">Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process.</a> Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+For+InSitu+Measurement+of+Calcium+in+Intracellular+Inositol+1,4,5-Trisphosphate-Sensitive+Stores+Using+The+Fluorescent+Indicator+Mag-Fura-2.">Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).</li><li>Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+indicator+for+measuring+cytosolic+free+magnesium.">A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium.</a> Am J Physiol. 256, (1989).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li><li>Heim, N., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Indicators+of+Cellular+Calcium+Dynamics+Based+on+Troponin+C+and+Green+Fluorescent+Protein.">Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein.</a> J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+C-based+biosensors:+A+new+family+of+genetically+encoded+indicators+for+in+vivo+calcium+imaging+in+the+nervous+system.">Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system.</a> Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).</li><li>Carlson, H. J., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+a+Red+Fluorescent+Protein-Based+Calcium+Ion+Indicator.">Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator.</a> Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).</li><li>Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+Calcium+Sensing+by+GCaMP2.">Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2.</a> Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).</li><li>Koldenkova, V. P., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2++dynamics+in+high+Ca2++concentration+cellular+compartments.">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+sensors+for+real-time+measurement+of+high+Ca2++concentrations.">Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations.</a> Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).</li><li>Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++concentration+after+Ca2++release+in+skeletal+myofibers+from+young+adult+and+old+mice.">Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice.</a> Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+suppress+the+thermosensitivity+of+green+fluorescent+protein.">Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).</li><li>Reddish, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).</li><li>Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+endoplasmic+reticulum+stored+calcium+regulation+by+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+ryanodine+receptors.">Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).</li><li>Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium signaling protocols. , (1999).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).</li></ol>

Levende enkeltcellet bildebehandling av fluorescerende prober, som CatchER + , er en effektiv teknikk for å analysere intrikate ER / SR Ca 2+ signalprosesser i hver celle som respons på reseptoragonister eller antagonister. Denne teknikken er også nyttig for avbildning ved bruk av flere bølgelengder samtidig, slik som nødvendig for Fura-2 eller til bilde CatchER + og Rhod-2 sammen for å overvåke henholdsvis henholdsvis ER- og cytosolisk kalsiumforandringer. Det er flere kritiske s...

De spatio-temporale egenskapene til intracellulære kalsium (Ca 2+ ) transienter aktiverer ulike biologiske funksjoner 1 . Disse Ca 2+ signaleringshendelsene utløses ekstracellulært gjennom forskjellige stimuli og kontrolleres intracellulært av den store Ca 2+ lagringsorganelle og ved en rekke Ca 2+ pumper, kanaler og Ca 2+ bindingsproteiner. Ca 2+ transienter kan endres vesentlig som følge av defekter med signalmodulasjon, som fører til forskjellige sykdommer 2 . På grunn av hastigheten og kompleksiteten til Ca 2+ -signaleringssystemet, med endo- (ER) og sarkoplasmisk retikulum (SR) i midten, er det nødvendig med genetisk kodede Ca 2+ -prober som er optimalisert for pattedyrsuttrykk med hurtig kinetikk. Å observere globale og lokale Ca 2+ endringer i forskjellige celler 3 . ER og SR, Dens motstykke i muskelceller, er de viktigste intracellulære Ca 2+ lagringsorganeller og fungerer som Ca 2+ vasker som bidrar til å forsterke Ca 2+ -signalet 4 . ER / SR er en integrert del i Ca 2+ -signalering med to roller som en sender og mottaker av signaler 5 . Ryanodinreseptoren (RyR) og inositol 1,4,5-trifosfatreceptoren (IP 3 R) er Ca 2+ -frigjøringsreceptorer lokalisert på membranene i ER / SR som er regulert av Ca 2+ 6 . Andre midler stimulerer direkte eller indirekte funksjonen til disse reseptorene. 4-klor-m-kresol (4-cmc) er en kraftig agonist av RyR, som har en 10 ganger høyere følsomhet enn koffein for å indusere SR Ca 2+ -frigjøring der begge regelmessig benyttes til å studere RyR-mediert Ca 2+ -frigjøring i Friske og syke celler 7 . ATP øker IP 3- mediert Ca 2+ reLeie gjennom IP 3 R 8 . ATP binder til den purinergreceptor P2YR, en G-proteinkoblet reseptor (GPCR), som utløser produksjonen av IP 3 som binder til IP 3 R for å frigjøre Ca 2+ fra ER 9 , 10 . Seraco-endoplasmatisk retikulumkalsium ATPase (SERCA) -pumpen er en P-type ATPase-pumpe, også lokalisert på ER / SR-membranen som reduserer cytosolisk Ca 2+ og fyller ER / SR ved aktivt å pumpe ionet i ER / SR lumen 11 . Spesifikke hemmere av SERCA-pumpen inkluderer thapsigargin, fra Thapsia garganica , og cyklopiazonsyre (CPA), fra Aspergillus og Penicillium . CPA har lav affinitet for pumpen og blokkerer reversibelt Ca 2+ tilgangspunktet 12 . Thapsigargin, derimot, binder irreversibelt til Ca 2+ fri pumpe ved rest F256 i M3-helixen med nanomolAr affinitet 11 . Analysere og kvantifisere endringene som er involvert i Ca 2+ stimulerte hendelser har vært og forblir en utfordring. Siden ER / SR er det store subcellulære Ca 2+ -holdige rommet med en sentral funksjon i utbredelsen av Ca 2+ -signalet, har mye arbeid vært fokusert på å forstå ER / SR Ca 2+ -signalering 5 . Opprettelsen av syntetiske Ca 2+ fargestoffer bidro til å fremme feltet og praksis av Ca 2+ -bildebehandling. Selv om fargestoffer, som Mag-Fura-2, har vært mye brukt til å måle compartmentalized Ca 2+ i forskjellige celler, har 13 , 14 , 15 de begrensninger som ujevn fargestoffbelastning, fotoblekking og manglende evne til å målrettes mot bestemte organeller . Oppdagelsen av det grønne fluorescerende protein (GFP) og fremskriden av fluorescerende protein-Baserte Ca 2+ -prober har drevet feltet Ca 2+ avbildning fremover 16 . Noen av de eksisterende GECIene er Förster resonans energioverføring (FRET) par som involverer gul fluorescerende protein (YFP), cyan fluorescerende protein (CFP), calmodulin og M13 bindende peptid 17 , 18 . Troponin C-baserte GECI er også tilgjengelige som FRET-par CFP og Citrine og som enkeltfluoroforprober 19 , 20 , 21 . Andre, som GCaMP2 og R-GECO, er single fluorophore sensorer som involverer calmodulin 22 , 23 . For å overvinne begrensningene for smal innstilling av Kd &#39;s og kooperativ binding assosiert med flere Ca2 + bindingssteder funnet i deres Ca2 + bindende domener 24 , en ny klasse av kalsium senSors ble opprettet ved å designe et Ca 2+ bindingssted på overflaten av beta-fatet i en kromofore-følsom plassering av forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) 25 , 26 . Denne høyt opplyste sensoren, kalt CatchER, har en Kd på ~ 0,18 mM, ak på nær diffusjonsgrensen, og ak off av 700 s -1 . CatchER har blitt brukt til å overvåke reseptormediert ER / SR kalsiumfrigivelse i forskjellige pattedyrcellelinjer som HeLa, HEK293 og C2C12 25 . På grunn av sin hurtige kinetikk ble CatchER brukt i flexor digitorum brevis (FDB) muskelfibre av unge og gamle Friend Virus B NIH Jackson (FVB) mus for å avsløre at mer Ca 2+ forblir i SR etter 2 s av depolarisering i FDB Fibre av gamle mus sammenlignet med unges mus 27 . For å overvinne sin lave fluorescens ved 37 ° C, som hindrer dets anvendelser ved kalsiumbilding av pattedyrCeller, har vi utviklet en forbedret versjon av CatchER kalt CatchER + . CatchER + utviser forbedret fluorescens ved 37 ° C for bedre anvendelse i pattedyrceller. Ytterligere mutasjoner ble innlemmet i CatchER for å forbedre termostabiliteten og fluorescensen ved 37 ° C 28 , 29 , for å skape CatchER + . CatchER + utviser en seks ganger økning i signal-støy-forholdet (SNR) over CatchER 30 . Her presenteres protokollene for kulturen og transfeksjonen av HEK293- og C2C12-celler med CatchER + og dens anvendelse for overvåking av ER / SR-reseptormedierte kalsiumtransienter. Representative resultater vises for CatchER + uttrykt i HEK293-celler behandlet med 4-cmc, CPA og ATP. Vi gir også en protokoll for å bestemme in situ K d av CatchER + i C2C12 myoblastceller og quaNtifisering av basal [Ca 2+ ].

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C55402</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515DCXR dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>NC338059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>102382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopiazonic Acid (CPA)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>239805</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>41095-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning 111 Valve Lubricant &#38; Sealant</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) 
			tetraacetic Acid (EGTA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>409911000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140087</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;12-544B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4891</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>391340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil without autofluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11513859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Free Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-230-5804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26GLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51985034</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Dibasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1565</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterivex-GV 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SVGVB1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Till Polychrome V Xenon lamp</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red (10X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15090046</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+

Intracellulære kalsium (Ca 2+ ) transienter fremkalt av ekstracellulære stimuli initierer en rekke biologiske prosesser i levende organismer. I midten av intracellulær kalsiumfrigivelse er de viktigste intracellulære kalsiumlagringsorganeller, endoplasmatisk retikulum (ER) og mer spesialisert sarkoplasmisk retikulum (SR) i muskelceller. Den dynamiske frigjøringen av kalsium fra disse organeller formidles av ryanodinreseptoren (RyR) og inositol 1,4,5-trifosfatreceptor (IP 3 R) med påfylling som skjer via sarco / endoplasmatisk retikulumkalsium ATPase (SERCA) -pumpen. En genetisk kodet kalsiumsensor (GECI), kalt CatchER, ble opprettet for å overvåke hurtig kalsiumfrigivelse fra ER / SR. Her er de detaljerte protokollene for transfeksjon og ekspresjon av den forbedrede, ER / SR-målrettede GECI CatchER + i HEK293- og C2C12-celler og dens anvendelse i overvåking av IP 3 R, RyR og SERCA-pumpemidlet kalsiumtransientS i HEK293-celler ved bruk av fluorescensmikroskopi er skissert. Reseptoragonisten eller inhibitoren som er valgt, dispergeres i kammerløsningen, og intensitetsendringene registreres i sanntid. Med denne metoden blir en reduksjon i ER-kalsium sett med RyR-aktivering med 4-klor-m-kresol (4 cm), den indirekte aktiveringen av IP 3 R med adenosintrifosfat (ATP) og inhibering av SERCA-pumpen med cyklopiazon Syre (CPA). Vi diskuterer også protokoller for å bestemme in situ K d og kvantifisere basal [Ca 2+ ] i C2C12-celler. I sammendraget kan disse protokollene, brukt i forbindelse med CatchER + , fremkalle reseptormediert kalsiumfrigivelse fra ER med fremtidig anvendelse ved å studere ER / SR kalsiumrelaterte patologier.

Denne delen vil illustrere resultatene som ble oppnådd ved hjelp av de tidligere beskrevne metodene ved å bruke den optimaliserte ER / SR-målrettede GECI CatchER + for å overvåke endringer i ER / SR Ca 2+ gjennom forskjellige reseptormedierte veier. Figur 1 illustrerer ER tømming gjennom RyR stimulert med 200 μM 4 cmc. 4-cmc er en agonist av RyR. Tilsetning av medikame...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+ at JoVE.com

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Vi presenterer protokoller for bruk av vår målrettede, genetisk kodede kalsiumindikator (GECI) CatchER + for overvåkning av hurtige kalsiumtransienter i det endoplasmatiske / sarkoplasmiske retikulum (ER / SR) av HEK293 og skjelettmuskulatur C2C12-celler ved bruk av sanntids fluorescensmikroskopi. En protokoll for in situ K d måling og kalibrering diskuteres også.

Overvåking av ER / SR-kalsiumfrigivelse med målrettet Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langsiktig Dødelig toksisitet Test med krepsdyret Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Direkte Imaging av ER Kalsium med målrettet-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Overvåking endoplasmic nettet kalsiumhomeostase Ved hjelp av en<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...