Name: monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+
Uploaded: 2017-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+ at JoVE.com

Эта работа финансировалась NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B &amp; B Seed Grant и дополнительным грантом NIH для FR, стипендиями BB для CM, стипендиями CDT для RG.

1. Подготовка слайдов <ol><li> Поместите стеклянные микроскопы размером 22 мм х 40 мм в чашки для культивирования клеток размером 6 см, по 1 слайду на блюдо. </li><li> Выставляйте каждую сторону каждого слайда, а также чашку 6 см до ультрафиолетового (УФ) света в течение 15-20 мин для стерилизации в ст?...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).</li><li>Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+signaling+and+sensor.">Fast kinetics of calcium signaling and sensor.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).</li><li>Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+of+intracellular+Ca2+:+Molecular+determinants+and+functional+consequences.">Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences.</a> Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum:+a+multifunctional+signaling+organelle.">The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle.</a> Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-chloro-m-cresol,+a+potent+and+specific+activator+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).</li><li>Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+receptor:+phosphorylation+by+protein+kinase+C+and+calcium+calmodulin-dependent+protein+kinases+in+reconstituted+lipid+vesicles.">Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).</li><li>Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+via+P2-purinergic+receptors+for+extracellular+ATP+and+other+nucleotides.">Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides.</a> Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).</li><li>Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+increases+intracellular+calcium+in+supraoptic+neurons+by+activation+of+both+P2X+and+P2Y+purinergic+receptors.">ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Pumps+in+Health+and+Disease.">Calcium Pumps in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).</li><li>Michelangeli, F., East, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diversity+of+SERCA+Ca2++pump+inhibitors.">A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors.</a> Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).</li><li>Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dynamics+measured+in+agonist-sensitive+stores+of+single+living+intact+cells:+a+new+look+at+the+refilling+process.">Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process.</a> Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+For+InSitu+Measurement+of+Calcium+in+Intracellular+Inositol+1,4,5-Trisphosphate-Sensitive+Stores+Using+The+Fluorescent+Indicator+Mag-Fura-2.">Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).</li><li>Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+indicator+for+measuring+cytosolic+free+magnesium.">A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium.</a> Am J Physiol. 256, (1989).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li><li>Heim, N., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Indicators+of+Cellular+Calcium+Dynamics+Based+on+Troponin+C+and+Green+Fluorescent+Protein.">Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein.</a> J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+C-based+biosensors:+A+new+family+of+genetically+encoded+indicators+for+in+vivo+calcium+imaging+in+the+nervous+system.">Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system.</a> Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).</li><li>Carlson, H. J., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+a+Red+Fluorescent+Protein-Based+Calcium+Ion+Indicator.">Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator.</a> Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).</li><li>Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+Calcium+Sensing+by+GCaMP2.">Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2.</a> Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).</li><li>Koldenkova, V. P., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2++dynamics+in+high+Ca2++concentration+cellular+compartments.">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+sensors+for+real-time+measurement+of+high+Ca2++concentrations.">Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations.</a> Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).</li><li>Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++concentration+after+Ca2++release+in+skeletal+myofibers+from+young+adult+and+old+mice.">Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice.</a> Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+suppress+the+thermosensitivity+of+green+fluorescent+protein.">Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).</li><li>Reddish, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).</li><li>Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+endoplasmic+reticulum+stored+calcium+regulation+by+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+ryanodine+receptors.">Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).</li><li>Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium signaling protocols. , (1999).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).</li></ol>

Живая одноячеечная визуализация флуоресцентных зондов, таких как CatchER + , является эффективным методом анализа сложных сигнальных процессов ER / SR Ca 2+ в каждой клетке в ответ на агонисты или антагонисты рецепторов. Этот метод также полезен для визуализации одновременно с исп?...

Пространственно-временные характеристики внутриклеточных кальциевых (Са 2+ ) переходных процессов активируют различные биологические функции 1 . Эти сигнальные события Ca 2+ запускаются внеклеточно через различные стимулы и контролируются внутриклеточно основными органоидами хранения Ca 2+ и многочисленными насосами Ca 2+ , каналами и Ca 2+ -связывающими белками. Переходные процессы Ca 2+ могут быть значительно изменены в результате дефектов с модуляцией сигнала, приводящих к различным заболеваниям 2 . Из-за скорости и сложности системы сигнализации Ca 2+ , с эндо- (ER) и саркоплазматическим ретикулумом (SR) в центре, необходимы генетически кодированные Ca 2+ -пробы, оптимизированные для экспрессии млекопитающих с быстрой кинетикой Наблюдать глобальные и локальные изменения Са 2+ в разных клетках 3 . ER и SR, Его аналог в мышечных клетках, являются основными внутриклеточными органоидами хранения Ca 2+ и действуют как поглотители Ca 2+, которые помогают усилить сигнал Ca 2+ 4 . ER / SR является неотъемлемой частью передачи сигналов Ca 2+ с двойными функциями в качестве передатчика и приемника сигналов 5 . Рецепторы рианодина (RyR) и 1,4,5-трифосфатного рецептора инозитола (IP 3 R) являются рецепторами высвобождения Ca 2+, расположенными на мембранах ER / SR, которые регулируются Ca 2+ 6 . Другие агенты прямо или косвенно стимулируют функцию этих рецепторов. 4-хлор-м-крезол (4 см) является сильным агонистом RyR, имеющим чувствительность в 10 раз выше, чем кофеин, для индуцирования высвобождения SR Ca 2+, где оба препарата регулярно используются для изучения RyR-опосредованного выделения Ca 2+ в Здоровые и больные клетки 7 . ATP повышает степень защиты от IP 3 Ca 2+ reАренды через IP 3 R 8 . АТФ связывается с пуринергическим рецептором P2YR, рецептором, связанным с G-белком (GPCR), вызывая выработку IP 3 , который связывается с IP 3 R для высвобождения Ca 2+ из ER 9 , 10 . Насос SARCO-эндоплазматический ретикулум кальция ATPase (SERCA) представляет собой насос АТФазы Р-типа, также расположенный на мембране ER / SR, которая уменьшает цитозольный Ca 2+ и наполняет ER / SR активным насосом иона в просвет ER / SR 11 . Конкретные ингибиторы насоса SERCA включают тапсигаргин, из Thapsia garganica и циклопиазоновую кислоту (CPA), от Aspergillus и Penicillium . CPA имеет низкое сродство к насосу и обратимо блокирует точку доступа Ca 2+ 12 . Thapsigargin, с другой стороны, необратимо связывается с Ca 2+ свободным насосом на остатке F256 в спирали M3 с наномоломAr affinity 11 . Анализ и количественная оценка изменений, связанных с стимулированными Ca 2+ событиями, была и остается проблемой. Поскольку ER / SR является основным субклеточным Ca 2+ -содержащим отделением с центральной функцией в распространении сигнала Ca 2+ , большая работа была сосредоточена на понимании передачи сигналов ER / SR Ca 2+ 5 . Создание синтетических Ca 2+ красителей помогло продвинуть область и практику получения Ca 2+ . Хотя красители, такие как Mag-Fura-2, широко использовались для измерения компартенсированного Ca 2+ в разных клетках, 13 , 14 , 15 они имеют такие ограничения, как неравномерная погрузка красителя, фотообесцвечивание и невозможность нацеливаться на определенные органеллы , Открытие зеленого флуоресцентного белка (GFP) и продвижение флуоресцентного белка-Основанные на Ca 2+ , продвинули поле изображения Ca 2+ вперед 16 . Некоторые из существующих GECI являются парами FERT (резонансная энергия) (FRET), включающими желтый флуоресцентный белок (YFP), голубой флуоресцентный белок (CFP), кальмодулин и связывающий пептид M13 17,18 . GECI на основе тропонина C также доступны в виде FRET пар CFP и цитрина и в качестве однофлуорофорных зондов 19 , 20 , 21 . Другие, такие как GCaMP2 и R-GECO, являются одними флуорофорными сенсорами, включающими кальмодулин 22 , 23 . Чтобы преодолеть ограничения узкой настройки K d и кооперативного связывания, связанные с множеством сайтов связывания Ca 2+, обнаруженных в их связывающих доменах Ca 2+ 24 , новый класс кальциевых сенSors был создан путем создания участка связывания Ca 2+ на поверхности бета-бочки в чувствительном к хромофорам участке усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) 25 , 26 . Этот датчик с высокой разрешающей способностью, называемый CatchER, имеет K d ~ 0,18 мМ, ak - около диффузионного предела и ak off 700 с -1 . CatchER использовался для контроля рецептор-опосредованного высвобождения кальция ER / SR в различных линиях клеток млекопитающих, таких как HeLa, HEK293 и C2C12 25 . Из-за быстрой кинетики CatchER использовался в мышечных волокнах flexor digitorum brevis (FDB) молодых и старых мышей Friend Virus B NIH Jackson (FVB), ​​чтобы показать, что большее количество Ca 2+ остается в SR после 2 сек деполяризации в FDB Волокон старых мышей по сравнению с волокнами старых мышей 27 . Для преодоления его низкой флуоресценции при 37 ° С, что затрудняет ее применение при кальциевых изображениях млекопитающихКлеток, мы разработали улучшенную версию CatchER под названием CatchER + . CatchER + обладает повышенной флуоресценцией при 37 ° C для лучшего применения в клетках млекопитающих. Дополнительные дополнительные мутации были включены в CatchER для улучшения термостабильности и флуоресценции при 37 ° С 28 , 29 , чтобы создать CatchER + . CatchER + демонстрирует шестикратное увеличение отношения сигнал / шум (SNR) по сравнению с CatchER 30 . Здесь представлены протоколы культивирования и трансфекции клеток HEK293 и C2C12 с CatchER + и его применение для мониторинга ER / SR рецептор-опосредованных кальциевых транзиентов. Представительные результаты показаны для CatchER +, экспрессированного в клетках НЕК293, обработанных 4 см, CPA и ATP. Мы также предоставляем протокол для определения in situ K d CatchER + в клетках миобластов C2C12 и quaОпределение базального [Са 2+ ].

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C55402</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515DCXR dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>NC338059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>102382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopiazonic Acid (CPA)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>239805</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>41095-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning 111 Valve Lubricant &#38; Sealant</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) 
			tetraacetic Acid (EGTA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>409911000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140087</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;12-544B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4891</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>391340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil without autofluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11513859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Free Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-230-5804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26GLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51985034</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Dibasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1565</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterivex-GV 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SVGVB1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Till Polychrome V Xenon lamp</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red (10X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15090046</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+

Внутриклеточные кальциевые (Ca 2+ ) переходные процессы, вызванные внеклеточными стимулами, инициируют множество биологических процессов в живых организмах. В центре внутриклеточного высвобождения кальция находятся основные внутриклеточные органоиды хранения кальция, эндоплазматический ретикулум (ER) и более специализированный саркоплазматический ретикулум (SR) в мышечных клетках. Динамическое высвобождение кальция из этих органелл опосредуется рианодиновым рецептором (RyR) и 1,4,5-трифосфатным рецептором инозитолом (IP 3 R) с повторным наполнением через насос кальциевой АТФазы sarco / эндоплазматический ретикулум (SERCA). Был создан генетически кодированный датчик кальция (GECI) под названием CatchER для контроля быстрого высвобождения кальция из ER / SR. Здесь подробные протоколы для трансфекции и экспрессии улучшенного EREC-SR-нацеленного GecI CatchER + в клетках HEK293 и C2C12 и его применение в контроле за транзитом кальция, опосредованным насосом IP 3 R, RyR и SERCAС в клетках НЕК293 с использованием флуоресцентной микроскопии. Агонист рецептора или ингибитор выбора диспергируют в растворе в камере, и изменения интенсивности регистрируют в реальном времени. С помощью этого метода снижение ER-кальция наблюдается с активацией RyR с помощью 4-хлор-м-крезола (4 см), косвенной активацией IP 3 R с аденозинтрифосфатом (АТФ) и ингибированием насоса SERCA циклопиазоном Кислота (СРА). Мы также обсуждаем протоколы для определения in situ K d и количественного определения базального [Ca 2+ ] в клетках C2C12. Таким образом, эти протоколы, используемые в сочетании с CatchER + , могут вызывать опосредуемое рецепторами высвобождение кальция из ER с последующим применением при исследовании патологий, связанных с кальцием ER / SR.

В этом разделе будут проиллюстрированы результаты, которые были достигнуты с использованием ранее описанных методов с использованием оптимизированного ER / SR-ориентированного GECI CatchER + для мониторинга изменений ER / SR Ca 2+ с помощью различных рецепторно-опос?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+ at JoVE.com

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Мы представляем протоколы для применения нашего целевого генетически кодированного индикатора кальция (GECI) CatchER + для мониторинга быстрых переходных процессов кальция в эндоплазматическом / саркоплазматическом ретикулуме (ER / SR) HEK293 и клетках C2C12 скелетной мышцы с использованием флуоресцентной микроскопии в режиме реального времени. Обсуждается также протокол измерения и калибровки in situ K d .

Мониторинг высвобождения кальция ER / SR с помощью целевого Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Сенсорный CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Мониторинг актина Разборка с покадровой микроскопии

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Загрузка дрозофилы нервными окончаниями с кальцием Индикаторы

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

Функциональные Формирование изображений с помощью арматуры, движения глаз, и физиологические мониторинга

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

Высвобождение дофамина в пресинаптические терминалы Индивидуальные Визуализированные с FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

Всего-Cell Запись Кальций Release-активированный кальций (CRAC) Токи в лимфоцитах человека Т

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Мониторинг динамических изменений в митохондриальной уровня кальция во время апоптоза Использование генетически закодированные Кальций датчика

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Живая изображений Кальций сотовый В сочетании с миРНК Отключение гена опосредованного Идентифицирует Ca 2 + Утечка каналов в мембране ЭР и их регулирующих механизмов

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Долгосрочные Смертельное испытания токсичности с ракообразных Артемия franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Прямое изображение ЭР кальция с целевыми-эстеразы Индуцированные красителем (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Мониторинг эндоплазматической сети кальциевого гомеостаза Использование защитного<em&gt; Gaussia</em&gt; Люциферазы SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...