Name: monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+
Uploaded: 2017-05-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+ at JoVE.com

Detta arbete finansierades av NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B &amp; B Seed Grant och ett NIH Supplementary Grant till FR, BB-fellesskap till CM, CDT-fellesskap till RG.

1. Slide Preparation <ol><li> Placera 22 mm x 40 mm glasmikroskopskivor i 6 cm cellodlingsdiskar, 1 bildskiva per skål. </li><li> Utsätt varje sida av varje bild och 6 cm-skålen till ultraviolett (UV) ljus i 15-20 minuter för att sterilisera i en steril huva. </li><li> Täck disken med diabilder inuti med parafilm och lagra vid 4 ° C tills det är klart att använda. </li></ol> 2. Framställning av media, buffertar, lösningar och reagenser <ol><li> Förbered 1 liter av Hanks balanserade...

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).</li><li>Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+signaling+and+sensor.">Fast kinetics of calcium signaling and sensor.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).</li><li>Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+of+intracellular+Ca2+:+Molecular+determinants+and+functional+consequences.">Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences.</a> Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum:+a+multifunctional+signaling+organelle.">The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle.</a> Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-chloro-m-cresol,+a+potent+and+specific+activator+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).</li><li>Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+receptor:+phosphorylation+by+protein+kinase+C+and+calcium+calmodulin-dependent+protein+kinases+in+reconstituted+lipid+vesicles.">Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).</li><li>Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+via+P2-purinergic+receptors+for+extracellular+ATP+and+other+nucleotides.">Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides.</a> Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).</li><li>Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+increases+intracellular+calcium+in+supraoptic+neurons+by+activation+of+both+P2X+and+P2Y+purinergic+receptors.">ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Pumps+in+Health+and+Disease.">Calcium Pumps in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).</li><li>Michelangeli, F., East, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diversity+of+SERCA+Ca2++pump+inhibitors.">A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors.</a> Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).</li><li>Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dynamics+measured+in+agonist-sensitive+stores+of+single+living+intact+cells:+a+new+look+at+the+refilling+process.">Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process.</a> Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+For+InSitu+Measurement+of+Calcium+in+Intracellular+Inositol+1,4,5-Trisphosphate-Sensitive+Stores+Using+The+Fluorescent+Indicator+Mag-Fura-2.">Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).</li><li>Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+indicator+for+measuring+cytosolic+free+magnesium.">A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium.</a> Am J Physiol. 256, (1989).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li><li>Heim, N., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Indicators+of+Cellular+Calcium+Dynamics+Based+on+Troponin+C+and+Green+Fluorescent+Protein.">Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein.</a> J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+C-based+biosensors:+A+new+family+of+genetically+encoded+indicators+for+in+vivo+calcium+imaging+in+the+nervous+system.">Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system.</a> Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).</li><li>Carlson, H. J., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+a+Red+Fluorescent+Protein-Based+Calcium+Ion+Indicator.">Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator.</a> Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).</li><li>Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+Calcium+Sensing+by+GCaMP2.">Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2.</a> Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).</li><li>Koldenkova, V. P., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2++dynamics+in+high+Ca2++concentration+cellular+compartments.">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+sensors+for+real-time+measurement+of+high+Ca2++concentrations.">Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations.</a> Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).</li><li>Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++concentration+after+Ca2++release+in+skeletal+myofibers+from+young+adult+and+old+mice.">Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice.</a> Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+suppress+the+thermosensitivity+of+green+fluorescent+protein.">Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).</li><li>Reddish, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).</li><li>Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+endoplasmic+reticulum+stored+calcium+regulation+by+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+ryanodine+receptors.">Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).</li><li>Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium signaling protocols. , (1999).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).</li></ol>

Levande enkelcellsavbildning av fluorescerande sonder, såsom CatchER + , är en effektiv teknik för att analysera invecklade ER / SR Ca 2+ -signaleringsprocesser i varje cell som svar på receptoragonister eller antagonister. Denna teknik är också användbar för avbildning med användning av flera våglängder samtidigt, såsom behövs för Fura-2 eller till bild CatchER + och Rhod-2 tillsammans för att övervaka både ER och cytosolisk kalciumförändringar. Det finns flera kritis...

De rumsliga egenskaperna hos intracellulära kalcium (Ca 2+ ) transienter aktiverar olika biologiska funktioner 1 . Dessa Ca 2+ -signaleringshändelser utlöses extracellulärt genom olika stimuli och regleras intracellulärt av den stora Ca 2+ -lagringsorganellen och av många Ca 2+ -pumpar, kanaler och Ca 2+ -bindande proteiner. Ca 2+ transienter kan förändras signifikant som ett resultat av defekter med signalmodulation, vilket leder till olika sjukdomar 2 . På grund av hastigheten och invecklingen av Ca 2+ -signaleringssystemet, med endo- (ER) och sarkoplasmisk retikulum (SR) i mitten behövs genetiskt kodade Ca 2+ -prober som har optimerats för däggdjursuttryck med snabb kinetik Att observera globala och lokala Ca 2+ förändringar i olika celler 3 . ER och SR, Dess motsvarighet i muskelceller, är de huvudsakliga intracellulära Ca 2+ lagringsorganellerna och fungerar som Ca 2+ sänkor som hjälper till att förstärka Ca 2+ -signalen 4 . ER / SR är en integrerad del i Ca2 + -signalering med dubbla roller som en sändare och mottagare av signaler 5 . Ryanodinreceptorn (RyR) och inositol-1,4,5-trifosfatreceptorn (IP3R) är Ca2 + -frisättningsreceptorer belägna på membranen i ER / SR som regleras av Ca2 + 6 . Andra medel stimulerar direkt eller indirekt funktionen hos dessa receptorer. 4-klor-m-kresol (4-cmc) är en potent agonist av RyR som har en 10-faldig högre känslighet än koffein för att inducera SR Ca 2+ -frisättning där båda regelbundet används för att studera RyR-medierad Ca 2+ -frisättning i Friska och sjuka celler 7 . ATP ökar IP3-medierad Ca2 + reHyra via IP 3 R 8 . ATP binder till den purinerga receptorn P2YR, en G-proteinkopplad receptor (GPCR), som utlöser produktionen av IP3 som binder till IP3R för att frigöra Ca2 + från ER 9 , 10 . Sarko-endoplasmatisk retikulumkalcium ATPas (SERCA) -pumpen är en P-typ ATPaspump, som också är lokaliserad på ER / SR-membranet som reducerar cytosolisk Ca2 + och fyller ER / SR genom att aktivt pumma jonen i ER / SR-lumenet 11 . Specifika inhibitorer av SERCA-pumpen inkluderar thapsigargin, från Thapsia garganica och cyklopiazonsyra (CPA), från Aspergillus och Penicillium . CPA har en låg affinitet för pumpen och blockerar reversibelt Ca 2+ åtkomstpunkten 12 . Thapsigargin binder däremot irreversibelt till Ca 2+ fri pump vid rest F256 i M3-helixen med nanomolAr affinitet 11 . Analysera och kvantifiera förändringarna i Ca 2+ stimulerade händelser har varit och förblir en utmaning. Eftersom ER / SR är det huvudsakliga subcellulära Ca 2+ innehållande facket med en central funktion vid propagationen av Ca 2+ -signalen har mycket arbete fokuserats på att förstå ER / SR Ca 2+ -signalering 5 . Skapandet av syntetiska Ca 2+ färgämnen bidrog till att utveckla fältet och övningen av Ca 2+ bildbehandling. Även om färgämnen, såsom Mag-Fura-2, har använts i stor utsträckning för att mäta uppdelad Ca 2+ i olika celler, har de 13 , 14 , 15 begränsningar såsom ojämn färgning, fotobildning och oförmågan att riktas mot specifika organeller . Upptäckten av det gröna fluorescerande proteinet (GFP) och framsteg av fluorescerande protein-Baserade Ca 2+ -prober har drivit fältet Ca 2+ avbildning framåt 16 . Några av de befintliga GECI: erna är Förster resonans energiöverföring (FRET) -par som involverar gult fluorescerande protein (YFP), cyan-fluorescerande protein (CFP), kalmodulin och M13-bindande peptid 17 , 18 . Troponin C-baserade GECIs finns också som FRET-par CFP och Citrin och som enskilda fluoroforprober 19 , 20 , 21 . Andra, såsom GCaMP2 och R-GECO, är enskilda fluorofor-sensorer som involverar kalmodulin 22 , 23 . För att övervinna begränsningarna för smal inställning av Kd &#39;s och kooperativ bindning associerad med flera Ca2 + bindningsställen som finns i deras Ca2 + bindningsdomäner 24 , en ny klass av kalcium senSors skapades genom att designa en Ca 2+ bindningsplats på ytan av beta-tunneln i en kromoforkänslig plats för förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP) 25 , 26 . Den här högstartade sensorn, kallad CatchER, har en Kd av ~ 0,18 mM, ak nära diffusionsgränsen och ak off av 700 s -1 . CatchER har använts för att övervaka receptormedierat ER / SR-kalciumfrigöring i olika däggdjurscellinjer, såsom HeLa, HEK293 och C2C12 25 . På grund av sin snabba kinetik användes CatchER i flexor digitorum brevis (FDB) muskelfibrer hos unga och gamla Friend Virus B NIH Jackson (FVB) möss för att avslöja att mer Ca 2+ förblir i SR efter 2 s av depolarisering i FDB Fibrer av gamla möss jämfört med hos unga möss 27 . För att övervinna dess låga fluorescens vid 37 ° C, vilket hindrar dess tillämpningar vid kalciumbildning av däggdjurCeller har vi utvecklat en förbättrad version av CatchER som heter CatchER + . CatchER + uppvisar förbättrad fluorescens vid 37 ° C för bättre applicering i däggdjursceller. Ytterligare mutationer inkorporerades i CatchER för att förbättra termostabiliteten och fluorescensen vid 37 ° C 28 , 29 , för att skapa CatchER + . CatchER + uppvisar en sexfaldig ökning av dess signal-brusförhållande (SNR) över CatchER 30 . Här presenteras protokollen för kulturen och transfektionen av HEK293- och C2C12-celler med CatchER + och dess tillämpning för övervakning av ER / SR-receptormedierade kalciumtransienter. Representativa resultat visas för CatchER + uttryckt i HEK293-celler behandlade med 4-cmc, CPA och ATP. Vi tillhandahåller också ett protokoll för att bestämma in situ K d av CatchER + i C2C12 myoblastceller och quaNtifiering av basal [Ca2 + ].

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C55402</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515DCXR dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>NC338059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>102382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopiazonic Acid (CPA)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>239805</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>41095-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning 111 Valve Lubricant &#38; Sealant</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) 
			tetraacetic Acid (EGTA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>409911000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140087</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;12-544B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4891</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>391340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil without autofluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11513859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Free Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-230-5804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26GLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51985034</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Dibasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1565</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterivex-GV 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SVGVB1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Till Polychrome V Xenon lamp</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red (10X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15090046</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+

Intracellulära kalcium (Ca 2+ ) transienter framkallade av extracellulära stimuli initierar en mängd biologiska processer i levande organismer. I centrum för intracellulärt kalciumfrigörande är de huvudsakliga intracellulära kalciumlagringsorganellerna, endoplasmatisk retikulum (ER) och mer specialiserad sarkoplasmisk retikulum (SR) i muskelceller. Den dynamiska frisättningen av kalcium från dessa organeller medieras av ryanodinreceptorn (RyR) och inositol 1,4,5-trifosfatreceptorn (IP 3 R) med påfyllning som sker genom sarco / endoplasmatisk retikulumkalcium ATPas (SERCA) -pumpen. En genkodad kalciumsensor (GECI) kallad CatchER skapades för att övervaka det snabba kalciumfrigörandet från ER / SR. Här beskrivs de detaljerade protokollen för transfektion och uttryck av den förbättrade, ER / SR-riktade GECI CatchER + i HEK293- och C2C12-celler och dess tillämpning vid övervakning av IP 3 R-, RyR- och SERCA-pumpmedierad kalciumtransientS i HEK293-celler med användning av fluorescensmikroskopi skisseras. Den föredragna receptoragonisten eller hämmaren dispergeras i kammarlösningen och intensitetsförändringarna registreras i realtid. Med denna metod ses en minskning av ER-kalcium med RyR-aktivering med 4-klor-m-kresol (4-cmc), indirekt aktivering av IP 3 R med adenosintrifosfat (ATP) och inhibition av SERCA-pumpen med cyklopiazon Syra (CPA). Vi diskuterar också protokoll för att bestämma in situ K d och kvantifiera basal [Ca 2+ ] i C2C12-celler. Sammanfattningsvis kan dessa protokoll, som används i samband med CatchER + , framkalla receptormedierat kalciumfrigörande från ER med framtida tillämpning vid studier av ER / SR-kalciumrelaterade patologier.

Detta avsnitt kommer att illustrera resultaten som uppnåddes med användning av de tidigare beskrivna metoderna med användning av den optimerade ER / SR-riktade GECI CatchER + för att övervaka förändringar i ER / SR Ca 2+ genom olika receptormedierade vägar. Figur 1 illustrerar ER tömning genom RyR stimulerad med 200 | iM 4 cmc. 4 cmc är en agonist för RyR. Tillsats...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+ at JoVE.com

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Vi presenterar protokoll för tillämpningen av vår målmedicinsk kodade kalciumindikator (GECI) CatchER + för övervakning av snabba kalciumtransienter i endoplasmatisk / sarkoplasmisk retikulum (ER / SR) hos HEK293 och skelettmuskel C2C12-celler med användning av realtids fluorescensmikroskopi. Ett protokoll för mätningen och kalibreringen in situ K d diskuteras också.

Övervakning av ER / SR-kalciumfrisättning med den riktade Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Övervakning Actin demontering med Time-lapse Mikroskopi

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Laddar Drosophila nervterminaler med kalcium indikatorer

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

Funktionell avbildning med armering, Eyetracking och fysiologiska övervakning

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

Dopamin Släpp på enskilda Presynaptiska Terminaler visualiseras med FFNS

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

Helcells-inspelning av Calcium Release-Aktivt Kalcium (CRAC) Strömmar i Human T-lymfocyter

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Övervakning dynamiska förändringar i mitokondriernas kalciumnivåer under apoptos Använda en genetiskt kodade Kalcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Levande cell Kalcium Imaging Kombinerat med siRNA Medierad geners uttryck Identifierar Ca 2 + Läckage kanaler i ER membranet och deras regleringsmekanismer

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Långsiktig Dödligt toxicitetstest med Crustacean Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Direkt avbildning av ER Kalcium med riktade-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Övervakning endoplasmanätet kalciumhomeostas med hjälp av en<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferas SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...