Name: light-mediated reversible modulation of the mitogen-activated protein kinase pathway during cell differentiation and xenopus embryonic development
Uploaded: 2017-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der University of Illinois bei Urbana-Champaign (UIUC) und den National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816) unterstützt.

Die Tierforschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und der University of Illinois Department of Animal Resources (DAR) durchgeführt. 1. Optogenetische Induktion der Protein-Lokalisation in BHK21 Säugetierzellkultur HINWEIS: Die Schritte 1.1-1.3 stellen eine Methode zur Zusammenstellung einer Zellkulturkammer zur Bildgebung mit hochvergrößerten Objektiven ( zB 63X oder 100X) z...

Beim Bau des Lichtkastens sollte die Leistung einzelner LEDs gemessen werden. Basierend auf bisherigen Erfahrungen kann die Leistung zwischen einzelnen LEDs aufgrund der Fertigungsvarianz variieren. Wählen Sie einen Satz von LEDs, die eine Leistungsabgabe innerhalb von 10% voneinander haben. Die Anzahl der LEDs, der Strombegrenzungswiderstand und die Leistungsaufnahme können für verschiedene Arten von Zellkulturbehältern ( zB eine 6-Well- oder 24-Well-Platte) modifiziert werden. Eine 24 h Lichtbeleuchtung b...

Wachstumsfaktoren sind an einem breiten Spektrum von Zellfunktionen beteiligt, darunter Proliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose und spielen in vielen biologischen Ereignissen, einschließlich embryonaler Entwicklung, Alterung und Regulierung des mentalen Status 1 , 2 , 3 , 4 , 5 Viele Wachstumsfaktoren signalisieren durch komplexe intrazelluläre Signalkaskaden. Diese Signalisierungsereignisse werden oft durch reversible Proteinphosphorylierung präzise geregelt 6 , 7 betrieben. So ist ein Verständnis der Signalisierungsergebnisse von Proteinkinasen, die für die Proteinphosphorylierung verantwortlich sind, von grundlegender Bedeutung. Unterschiedliche Wachstumsfaktoren wirken durch ein relativ häufiges intrazelluläres Signalisierungsnetzwerk, obwohl sie dist anregenInct zelluläre Reaktionen 8 , 9 . Häufige intrazelluläre Mediatoren von Rezeptortyrosinkinasen umfassen Ras, Raf, extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK), mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) / ERK-Kinase (MEK), Phosphoinositid-3-kinase (PI3K), Akt und Phospholipase C gamma (PLC &amp; gamma;) 10 , 11 . Die akkumulierende Evidenz deutet darauf hin, dass die Signalisierungsvielfalt und die Spezifität von der räumlichen und zeitlichen Regulierung der Signalisierungsaktivität abhängen. Zum Beispiel aktiviert bei Ratten-Pheochromozytomzellen (PC12) die epidermale Wachstumsfaktor (EGF) -Stimulation, die zu einer Zellproliferation führt, den ERK-Weg 9 vorübergehend. Auf der anderen Seite aktiviert die Stimulation mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF), die zur Zelldifferenzierung führt, den ERK-Weg nachhaltig 9 , 13 . In kultivierten rBei hippocampalen Neuronen fördert die transiente Signalisierung durch den vom Gehirn abgeleiteten neurotrophischen Faktor (BDNF) das primäre Neuritenwachstum, während die anhaltende Signalisierung zu einer erhöhten Neuritenverzweigung führt. Während der frühen embryonalen Entwicklung ist die phosphorylierte ERK-Aktivität zeitlich dynamisch und weit verbreitet im Embryo 6 . Ein aktueller genetischer Screen während der frühen Xenopus- Embryogenese zeigte, dass ERK- und Akt-Signalkaskaden, zwei nachgeschaltete primäre Wachstumsfaktorwege, bühnenspezifische Aktivierungsprofile zeigen 7 . So verlangt ein Verständnis der Kinase-Signalisierungsergebnisse Werkzeuge, die die räumlichen und zeitlichen Merkmale der Kinaseaktivität mit ausreichender Auflösung untersuchen können. Konventionelle experimentelle Ansätze, die dynamische Natur der Signaltransduktion während der Entwicklung zu untersuchen, fehlt der wünschenswerten räumlichen und zeitlichen Auflösung. Zum Beispiel verwenden pharmakologische Ansätze kleine chemIcal oder biologischen Molekülen zur Stimulierung oder Unterdrückung der Signaltransduktion in Zellen und Geweben. Die diffuse Natur dieser kleinen Moleküle macht es schwierig, ihre Handlung auf eine bestimmte Region von Interesse zu beschränken 15 . Genetische Ansätze ( zB Transgenese, Cre-Lox-System oder Mutagenese) führen häufig zur irreversiblen Aktivierung oder Repression der Zielgenexpression bzw. Proteinaktivität 16 , 17 , 18 . Das Tet-On / Tet-Off-System 19 bietet eine verbesserte zeitliche Kontrolle der Gentranskription, aber es fehlt eine strikte räumliche Kontrolle, da es auf der Diffusion von Tetracyclin beruht. Jüngste Entwicklungen in der chemisch induzierten Proteindimerisierung 20 oder photo-uncaging 21 , 22 , 23 , 24 haben stark verbessertDie zeitliche Steuerung von Signalisierungsnetzwerken. Die räumliche Kontrolle bleibt jedoch aufgrund der diffusen Beschaffenheit der eingesperrten Chemikalien anspruchsvoll. Jüngste aufkommende optogenetische Ansätze, die die Kraft des Lichts nutzen, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu kontrollieren, erlauben die Modulation von Signalwegen mit hoher räumlich-zeitlicher Präzision sowie Reversibilität. Kurz nach ihrem anfänglichen Erfolg bei der Kontrolle des neuronalen Brennens 25 , 26 , 27 wurde die Optogenetik erweitert, um andere zelluläre Prozesse wie die Gentranskription, Translation, Zellmigration, Differenzierung und Apoptose 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 zu kontrollieren , 34 . Eine Strategie mit dem pHotoaktivierbares Proteinpaar Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) -Protein und die N-terminale Domäne von Cryptochrom-interagierenden Basic-Helix-Loop-Helix (CIBN) wurde kürzlich entwickelt, um die Raf1-Kinase-Aktivität in Säugetierzellen und Xenopus- Embryonen 35 zu kontrollieren. CRY2 bindet an CIBN bei Blue-Light-Stimulation, und der CRY2 / CIBN-Proteinkomplex dissoziiert spontan im Dunkeln 34 . Blaues Licht erregt den CRY2-Cofaktor, Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), was zu einer Konformationsänderung in CRY2 und dessen anschließender Bindung an CIBN führt. Konstitutiv aktive (W374A) und Flavin-defiziente (D387A) -Mutanten von CRY2 können durch Mutationen in der FAD-Bindungstasche produziert werden : Die CRY2 W374A- Mutante bindet an CIBN unabhängig von Licht, während die CRY2 D387A- Mutante nicht an CIBN unter blau bindet Leichte Stimulation 36 , 37 . Das optogenetische System beschrieben iN dieses Protokoll verwendet Wildtyp-CRY2 und CIBN, um die Protein-Translokation-vermittelte Raf1-Aktivierung in lebenden Zellen zu induzieren. Es ist bekannt, dass die Membranrekrutierung von Raf1 seine Aktivität verstärkt. In diesem System ist ein Tandem-CIBN-Modul an der Plasmamembran verankert und CRY2-mCherry ist an den N-Terminus von Raf1 35 fusioniert. In Abwesenheit von blauem Licht bleibt CRY2-mCherry-Raf1 im Zytoplasma und Raf1 ist inaktiv. Die Blaulichtstimulation induziert die CRY2-CIBN-Bindung und rekrutiert Raf1 an die Plasmamembran, wo Raf1 aktiviert wird. Die Raf-Aktivierung stimuliert eine Raf / MEK / ERK-Signalkaskade. Sowohl CRY2- als auch CIBN-Fusionsproteine ​​sind in einem bikistronischen genetischen System codiert. Diese Strategie kann verallgemeinert werden, um andere Kinasen, wie zB Akt, zu kontrollieren, deren Aktivierungszustand auch durch Protein-Translokation in Zellen 39 eingeschaltet werden kann. Diese Arbeit stellt detaillierte Protokolle für die Umsetzung dieser optogenetischen Strategie in Säugetierzellkultur darRes und multizellulären Organismen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Glass coverslip&#160;</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:188px;">48393 230</td>
			<td style="width:167px;">Substrate for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Coverslip holder&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Newcomer Supply</td>
			<td style="width:188px;">6817B</td>
			<td style="width:167px;">Holder for coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Detergent&#160;</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">16 000 104</td>
			<td style="width:167px;">For cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Boric acid&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">B6768-500G</td>
			<td style="width:167px;">For making PLL buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Disodium tetraborate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">71996-250G</td>
			<td style="width:167px;">For making&#160; PLL buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Plastic beaker</td>
			<td style="width:175px;">Nalgene</td>
			<td style="width:188px;">1201-1000</td>
			<td style="width:167px;">For cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">221465-2.5KG</td>
			<td style="width:167px;">For adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">P1274-500MG</td>
			<td style="width:167px;">For coating coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:188px;">750024</td>
			<td style="width:167px;">For DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Cover Glass Forceps</td>
			<td style="width:175px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:188px;">5645</td>
			<td style="width:167px;">Cover glass handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Tissue cutlure dish</td>
			<td style="width:175px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:188px;">12565321</td>
			<td style="width:167px;">Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Sterile centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">12-565-271</td>
			<td style="width:167px;">Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Transfection Reagent</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">R0534</td>
			<td style="width:167px;">Transfection</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:219px;">CO2-independent medium</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">18045088</td>
			<td style="width:167px;">For live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:175px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:188px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:167px;">Form make cell chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td style="width:175px;">Qiagen</td>
			<td style="width:188px;">12965</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;">Cell culturing medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">F12K medium</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">21127022</td>
			<td style="width:167px;">Cell culturing medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Horse serum</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">16050122</td>
			<td style="width:167px;">Cell culturing medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:175px;">Signa-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">12303C-500 mL</td>
			<td style="width:167px;">Cell culturing medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">10378016</td>
			<td style="width:167px;">Cell culturing medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Trypsin (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:188px;">15050065&#160;</td>
			<td style="width:167px;">For mammalian cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Agarose</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:188px;">BP1356-100</td>
			<td style="width:167px;">For DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Ficoll PM400</td>
			<td style="width:175px;">GE Heathcare Life Sciences</td>
			<td style="width:188px;">17-5442-02</td>
			<td style="width:167px;">For embryo buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">1.02839.0025</td>
			<td style="width:167px;">Oocyte preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">ApaI</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td>FD1414</td>
			<td style="width:167px;">For linearization of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:219px;">Dnase I</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">AM2222</td>
			<td style="width:167px;">For removing DNA template in the in vitro transcription assay</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:219px;">Index-match materials (immersion oil)</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td>MOIL-20LN</td>
			<td style="width:167px;">For matching the index between sample substrate and objective</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Blue LED</td>
			<td style="width:175px;">Adafruit</td>
			<td style="width:188px;">301</td>
			<td style="width:167px;">Light source for optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Resistor kit</td>
			<td style="width:175px;">Amazon</td>
			<td style="width:188px;">EPC-103</td>
			<td style="width:167px;">current-limiting resistor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Aluminum boxes</td>
			<td style="width:175px;">BUD Industries</td>
			<td style="width:188px;">AC-401</td>
			<td style="width:167px;">light box&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">BreadBoard</td>
			<td style="width:175px;">Jekewin</td>
			<td style="width:188px;">837654333686</td>
			<td style="width:167px;">For making LED array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hook up Wire</td>
			<td style="width:175px;">Electronix Express</td>
			<td style="width:188px;">27WK22SLD25</td>
			<td style="width:167px;">For making LED array</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Relay Module</td>
			<td style="width:175px;">Jbtek</td>
			<td style="width:188px;">SRD-05VDC-SL-C</td>
			<td style="width:167px;">For intermittent light control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">DC Power Supply&#160;</td>
			<td style="width:175px;">TMS</td>
			<td style="width:188px;">DCPowerSupply-LW-(PS-305D)</td>
			<td style="width:167px;">Power supply for LED</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Silicon&#160;Power&#160;Head</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:188px;">S121C</td>
			<td style="width:167px;">For light intensity measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Power meter</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:188px;">PM100D&#160;</td>
			<td style="width:167px;">For light intensity measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:188px;">DMI8</td>
			<td style="width:167px;">For live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">BioSafety Cabinet</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">1300 Series A2</td>
			<td style="width:167px;">For mammalian cell handling</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">Isotemp</td>
			<td style="width:167px;">For mammalian cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:188px;">M60</td>
			<td style="width:167px;">For embryo micro-manipulation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Microinjector</td>
			<td style="width:175px;">Narishige</td>
			<td style="width:188px;">IM300</td>
			<td style="width:167px;">For embryo microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:175px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:188px;">P87</td>
			<td style="width:167px;">Needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:219px;">in vitro transcription kit</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;">For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA&#160; Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:219px;">RNA purfication kit</td>
			<td style="width:175px;">Qiagen</td>
			<td style="width:188px;">74104</td>
			<td style="width:167px;">Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Convection oven</td>
			<td style="width:175px;">MTI corporation</td>
			<td style="width:188px;">&#160;EQ-DHG-9015</td>
			<td style="width:167px;">PDMS curing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Centrifugal mixer and teflon container</td>
			<td style="width:175px;">THINKY</td>
			<td style="width:188px;">AR310</td>
			<td style="width:167px;">For mixing PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:175px;">UniversityWafer</td>
			<td style="width:188px;">452</td>
			<td style="width:167px;">Base for making PDMS&#160; devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Blade</td>
			<td style="width:175px;">Techni Edge</td>
			<td style="width:188px;">01-801</td>
			<td style="width:167px;">For cutting PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Capillary glass</td>
			<td style="width:175px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:188px;">BF100-58-10</td>
			<td style="width:167px;">For fabrication of injecting needles.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-mediated reversible modulation of the mitogen-activated protein kinase pathway during cell differentiation and xenopus embryonic development

Kinase-Aktivität ist entscheidend für eine Fülle von zellulären Funktionen, einschließlich Zellproliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose. Während der frühen embryonalen Entwicklung ist die Kinase-Aktivität hochdynamisch und weit verbreitet im Embryo. Pharmakologische und genetische Ansätze werden häufig verwendet, um Kinaseaktivitäten zu untersuchen. Leider ist es schwierig, mit diesen Strategien eine überlegene räumliche und zeitliche Auflösung zu erreichen. Weiterhin ist es nicht möglich, die Kinaseaktivität reversibel in lebenden Zellen und multizellulären Organismen zu kontrollieren. Eine solche Einschränkung bleibt ein Engpass für ein quantitatives Verständnis der Kinaseaktivität während der Entwicklung und Differenzierung. Diese Arbeit präsentiert eine optogenetische Strategie, die ein bicistronisches System mit photoaktivierbaren Proteinen Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) und der N-terminalen Domäne von Cryptochrom-interagierenden Basis-Helix-Loop-Helix (CIBN) nutzt. ReversiDie Aktivierung des mitogen-aktivierten Proteinkinase- (MAPK-) Signalisierungsweges wird durch lichtvermittelte Proteintranslokation in lebenden Zellen erreicht. Dieser Ansatz kann auf Säugetierzellkulturen angewendet werden und lebende Wirbeltierembryonen. Dieses bicistronische System kann verallgemeinert werden, um die Aktivität anderer Kinasen mit ähnlichen Aktivierungsmechanismen zu kontrollieren und kann auf andere Modellsysteme angewendet werden.

Ratiometrische Expression von photoaktivierbaren Proteinpaaren: Abbildung 1A zeigt den Entwurf eines bicistronischen optogenetischen Konstrukts, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (bezeichnet als CRY2-2A-2CIBN), basierend auf dem Schweine-Teschovirum- 1 2A (P2A) -Peptid, das die höchste Ribosomen-überspringende Effizienz unter den Säugerzelllinien 42 zeigt . In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass das optimale Verhält...

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Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Dieses Protokoll beschreibt eine optogenetische Strategie zur Modulation der mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) Aktivität während der Zelldifferenzierung und der Xenopus embryonalen Entwicklung. Diese Methode ermöglicht die reversible Aktivierung des MAPK-Signalwegs in der Säugerzellkultur und in multizellulären Lebendorganismen wie Xenopus- Embryonen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Lichtvermittelte reversible Modulation des mitogenaktivierten Proteinkinase-Pathways während der Zelldifferenzierung und<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Entwicklung

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Unit 1

Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Differenzierung der SH-SY5Y humanen Neuroblastom-Zelllinie

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom Profilieren<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Vorhersage und Validierung von Gen-regulatorischen Elementen Activated Während Retinsäure Induced Embryonic Stem Zelldifferenzierung

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...