Name: light-mediated reversible modulation of the mitogen-activated protein kinase pathway during cell differentiation and xenopus embryonic development
Uploaded: 2017-06-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development at JoVE.com

Bu çalışma, Urbana-Champaign&#39;deki Illinois Üniversitesi (UIUC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIGMS R01GM111816) tarafından desteklendi.

Hayvan araştırmaları, Illinois Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Illinois Üniversitesi Hayvan Kaynakları Departmanı (DAR) tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yürütülmüştür. 1. BHK21 Memeli Hücre Kültüründe Protein Lokalizasyonunun Optogenetik İndüksiyonu NOT: Adım 1.1-1.3, tipik olarak kısa çalışma mesafelerine sahip yüksek büyütme hedeflerine ( örneğin, 63X veya 100X) sahip görüntüleme için...

Işık kutusunu oluştururken, tek tek LED&#39;lerin gücü ölçülmelidir. Daha önceki tecrübelere dayanarak, güç çıkışı, üretim varyansına bağlı olarak tek tek LED&#39;ler arasında değişiklik gösterebilir. Birbirinden% 10&#39;luk bir güç çıkışı olan bir dizi LED seçin. LED&#39;lerin sayısı, akım sınırlayıcı direnç ve güç girişi, farklı hücre kültürü kapları tipleri ( örn., 6 kuyucuklu veya 24 kuyulu bir plaka) için değiştirilebilir. 0,2 mW / cm2&#39;lik bir güce...

Büyüme faktörleri, çoğalma, farklılaşma, göç ve apoptoz gibi geniş bir hücre fonksiyonları yelpazesinde yer alır ve embriyonik gelişme, yaşlanma ve mental durumun düzenlenmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik olayda önemli roller oynamaktadır 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Birçok büyüme faktörü, karmaşık hücreiçi sinyalleme kaskadları aracılığıyla sinyal verir. Bu sinyal olayları sıklıkla, tersine çevrilebilir protein fosforilasyonu ile tam olarak düzenlenmiş bir şekilde çalıştırılır ( 6 , 7) . Bu nedenle, protein fosforilasyonundan sorumlu olan protein kinazların sinyal verme sonuçlarının anlaşılması temel olarak önemlidir. Farklı büyüme faktörleri, oldukça yaygın bir hücre içi sinyal ağı vasıtasıyla etkinken distInt hücresel tepkiler 8 , 9 . Reseptör tirozin kinazların yaygın intraselüler mediatörler arasında Ras, Raf, hücre dışı sinyalle düzenlenmiş kinaz (ERK), mitojen ile aktive olan protein kinaz (MAPK) / ERK kinaz (MEK), fosfoinositid 3-kinaz (PI3K), Akt ve fosfolipaz C gama (PLCγ) 10 , 11 . Biriken kanıtlar, sinyal çeşitliliği ve özgünlüğün, sinyal faaliyetinin mekânsal ve zamansal düzenlenişine bağlı olduğunu gösterir 12 . Örneğin, fare feokromasitoma hücrelerinde (PC12), hücre proliferasyonuyla sonuçlanan epidermal büyüme faktörü (EGF) uyarımı, geçici olarak ERK yolunu 9 harekete geçirir. Öte yandan, hücre farklılaşmasına yol açan sinir büyüme faktörü (NGF) ile uyarılması, sürekli bir şekilde ERK yolunu aktive eder 9,13. Kültürlü rHipokampal nöronlarda, beyin türevi nörotrofik faktör (BDNF) ile geçici sinyalizasyon primer nevrit büyümesini arttırırken, sürekli sinyalizasyon da artmış nevrit dallanmasına yol açar 14 . Erken embriyonik gelişim sırasında fosforile ERK aktivitesi geçici olarak dinamiktir ve embriyo 6 boyunca yaygındır. Erken Xenopus embriyogenezisindeki yeni bir genetik ekran, iki alt başlıca büyüme faktörü yolağı olan ERK ve Akt sinyalleme kaskadlarının, aşamaya özgü aktivasyon profilleri 7&#39;yi gösterdiğini ortaya koymuştur. Dolayısıyla, kinaz sinyalleme sonuçlarının anlaşılması, yeterli özünürlükle kinaz aktivitesinin mekansal ve zamansal özelliklerini inceleyebilen araçlar için çağrıda bulunur. Gelişim sırasında sinyal iletiminin dinamik doğasını araştırmaya yönelik geleneksel deneysel yaklaşımlar arzu edilen uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip değildir. Örneğin, farmakolojik yaklaşımlar küçük kimyasal kullanırHücrelerdeki ve dokulardaki sinyal transdüksiyonunu uyarmak veya bastırmak için biyolojik veya moleküler moleküller. Bu küçük moleküllerin dağınık doğası, eylemlerini belirli bir ilgi alanı 15 ile sınırlandırmayı zorlaştırıyor. Genetik yaklaşımlar ( örn., Transgenez, Cre-Lox sistemi veya mutagenez) hedef gen ekspresyonunun veya protein aktivitesinin 16 , 17 , 18&#39;in geri döndürülemez aktivasyonu veya baskılamasına neden olur. Tet-On / Tet-Off sistemi 19 , gen transkripsiyonunun zamana göre daha iyi kontrolünü sağlar, ancak tetrasiklinin difüzyonuna dayandığı için sıkı uzamsal kontrollerden yoksundur. Kimyasal olarak indüklenen protein dimerizasyonu 20 veya foto-kovaj 21 , 22 , 23 , 24&#39;teki son gelişmeler ,Sinyalizasyon ağlarının zamansal kontrolü. Bununla birlikte, mekansal kontrol, kafesli kimyasalların dağılışı nedeniyle zorlayıcı olmaya devam etmektedir. Protein-protein etkileşimlerini kontrol etmek için ışığın gücünden yararlanan son ortaya çıkan optogenetik yaklaşımlar, yüksek zaman-zamanlı hassaslığın yanısıra reversibilite ile sinyal yollarının modülasyonuna izin verir. Nöronal ateşlemeyi kontrol etme konusundaki ilk başarısının kısa bir süre sonra 25 , 26 , 27 , optogenetics gen transkripsiyonu, translasyon, hücre göçü, farklılaşma ve apoptoz gibi diğer hücresel işlemleri kontrol etmek için genişletildi. 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . P kullanan bir stratejiHitoaktivatüre protein çifti Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) proteini ve kriptokrom etkileşen bazik-helezon-döngüsel helezon (CIBN) &#39;nin N-terminal bölgesi, yakın zamanda memeli hücrelerinde ve Xenopus embriyolarında Raf1 kinaz aktivitesini kontrol etmek için geliştirildi. CRY2, mavi ışık uyarıldığında CIBN&#39;ye bağlanır ve CRY2 / CIBN protein kompleksi, karanlıkta kendiliğinden ayrılır 34 . Mavi ışık, CRY2 kofaktörü, flavin adenin dinükleotidi (FAD) uyandırır ve CRY2&#39;de konformasyonel değişikliğe ve ardından CIBN&#39;ye bağlanmasına yol açar. CRY2&#39;nin yapısal olarak aktif (W374A) ve flavin eksikliği olan (D387A) mutantları, FAD bağlayıcı cebindeki mutasyonlar yoluyla üretilebilir: CRY2 W374A mutantı ışıktan bağımsız olarak CIBN&#39;ye bağlanırken CRY2 D387A mutantı, mavi altında CIBN&#39;ye bağlanmaz Işık uyarımı 36 , 37 . I tanımlanan optogenetik sistemBu protokol canlı hücrelerde protein translokasyon aracılı Rafl aktivasyonunu başlatmak için vahşi tip CRY2 ve CIBN kullanır. Rafl&#39;in zar alımının etkinliğini arttırdığı bilinmektedir 38 . Bu sistemde, tandem bir CIBN modülü plazma zarına bağlanır ve CRY2-mCherry, Rafl 35&#39;in N-terminaline kaynaştırılır. Mavi ışığın yokluğunda, CRY2-mCherry-Raf1, sitoplazmada kalır ve Raf1 inaktiftir. Mavi ışık uyarımı, CRY2-CIBN bağlanmaya neden olur ve Raf1&#39;in aktive edildiği plazma membranına Rafl&#39;i işe alır. Raf aktivasyonu, bir Raf / MEK / ERK sinyalleme kaskadını uyarır. Hem CRY2 hem de CIBN füzyon proteinleri, bir bisistronik genetik sistemde kodlanır. Bu strateji, aktivasyon durumu aynı zamanda hücrelerdeki protein translokasyonu ile de etkinleştirilebilen Akt gibi diğer kinazları kontrol etmek üzere genelleştirilebilir 39 . Bu çalışma memeli hücre kültüründe bu optogenetik stratejinin uygulanması için ayrıntılı protokoller sunmaktadırRes ve çok hücreli organizmalar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Glass coverslip&#160;</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:188px;">48393 230</td>
			<td style="width:167px;">Substrate for live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Coverslip holder&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Newcomer Supply</td>
			<td style="width:188px;">6817B</td>
			<td style="width:167px;">Holder for coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Detergent&#160;</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">16 000 104</td>
			<td style="width:167px;">For cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Boric acid&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">B6768-500G</td>
			<td style="width:167px;">For making PLL buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Disodium tetraborate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">71996-250G</td>
			<td style="width:167px;">For making&#160; PLL buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Plastic beaker</td>
			<td style="width:175px;">Nalgene</td>
			<td style="width:188px;">1201-1000</td>
			<td style="width:167px;">For cleaning coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">221465-2.5KG</td>
			<td style="width:167px;">For adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">P1274-500MG</td>
			<td style="width:167px;">For coating coverslip</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:188px;">750024</td>
			<td style="width:167px;">For DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Cover Glass Forceps</td>
			<td style="width:175px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:188px;">5645</td>
			<td style="width:167px;">Cover glass handling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Tissue cutlure dish</td>
			<td style="width:175px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:188px;">12565321</td>
			<td style="width:167px;">Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Sterile centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">12-565-271</td>
			<td style="width:167px;">Buffer storage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Transfection Reagent</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">R0534</td>
			<td style="width:167px;">Transfection</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:219px;">CO2-independent medium</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">18045088</td>
			<td style="width:167px;">For live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:175px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:188px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:167px;">Form make cell chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td style="width:175px;">Qiagen</td>
			<td style="width:188px;">12965</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;">Cell culturing medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">F12K medium</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">21127022</td>
			<td style="width:167px;">Cell culturing medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Horse serum</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">16050122</td>
			<td style="width:167px;">Cell culturing medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:175px;">Signa-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">12303C-500 mL</td>
			<td style="width:167px;">Cell culturing medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">10378016</td>
			<td style="width:167px;">Cell culturing medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Trypsin (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:188px;">15050065&#160;</td>
			<td style="width:167px;">For mammalian cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Agarose</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:188px;">BP1356-100</td>
			<td style="width:167px;">For DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Ficoll PM400</td>
			<td style="width:175px;">GE Heathcare Life Sciences</td>
			<td style="width:188px;">17-5442-02</td>
			<td style="width:167px;">For embryo buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">1.02839.0025</td>
			<td style="width:167px;">Oocyte preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">ApaI</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td>FD1414</td>
			<td style="width:167px;">For linearization of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:219px;">Dnase I</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">AM2222</td>
			<td style="width:167px;">For removing DNA template in the in vitro transcription assay</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:219px;">Index-match materials (immersion oil)</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td>MOIL-20LN</td>
			<td style="width:167px;">For matching the index between sample substrate and objective</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Blue LED</td>
			<td style="width:175px;">Adafruit</td>
			<td style="width:188px;">301</td>
			<td style="width:167px;">Light source for optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Resistor kit</td>
			<td style="width:175px;">Amazon</td>
			<td style="width:188px;">EPC-103</td>
			<td style="width:167px;">current-limiting resistor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Aluminum boxes</td>
			<td style="width:175px;">BUD Industries</td>
			<td style="width:188px;">AC-401</td>
			<td style="width:167px;">light box&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">BreadBoard</td>
			<td style="width:175px;">Jekewin</td>
			<td style="width:188px;">837654333686</td>
			<td style="width:167px;">For making LED array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Hook up Wire</td>
			<td style="width:175px;">Electronix Express</td>
			<td style="width:188px;">27WK22SLD25</td>
			<td style="width:167px;">For making LED array</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Relay Module</td>
			<td style="width:175px;">Jbtek</td>
			<td style="width:188px;">SRD-05VDC-SL-C</td>
			<td style="width:167px;">For intermittent light control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">DC Power Supply&#160;</td>
			<td style="width:175px;">TMS</td>
			<td style="width:188px;">DCPowerSupply-LW-(PS-305D)</td>
			<td style="width:167px;">Power supply for LED</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Silicon&#160;Power&#160;Head</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:188px;">S121C</td>
			<td style="width:167px;">For light intensity measurement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Power meter</td>
			<td style="width:175px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:188px;">PM100D&#160;</td>
			<td style="width:167px;">For light intensity measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:188px;">DMI8</td>
			<td style="width:167px;">For live cell imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">BioSafety Cabinet</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">1300 Series A2</td>
			<td style="width:167px;">For mammalian cell handling</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">Isotemp</td>
			<td style="width:167px;">For mammalian cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:188px;">M60</td>
			<td style="width:167px;">For embryo micro-manipulation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Microinjector</td>
			<td style="width:175px;">Narishige</td>
			<td style="width:188px;">IM300</td>
			<td style="width:167px;">For embryo microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:175px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:188px;">P87</td>
			<td style="width:167px;">Needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:219px;">in vitro transcription kit</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:188px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;">For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA&#160; Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:219px;">RNA purfication kit</td>
			<td style="width:175px;">Qiagen</td>
			<td style="width:188px;">74104</td>
			<td style="width:167px;">Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Convection oven</td>
			<td style="width:175px;">MTI corporation</td>
			<td style="width:188px;">&#160;EQ-DHG-9015</td>
			<td style="width:167px;">PDMS curing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Centrifugal mixer and teflon container</td>
			<td style="width:175px;">THINKY</td>
			<td style="width:188px;">AR310</td>
			<td style="width:167px;">For mixing PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:175px;">UniversityWafer</td>
			<td style="width:188px;">452</td>
			<td style="width:167px;">Base for making PDMS&#160; devices</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Blade</td>
			<td style="width:175px;">Techni Edge</td>
			<td style="width:188px;">01-801</td>
			<td style="width:167px;">For cutting PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Capillary glass</td>
			<td style="width:175px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:188px;">BF100-58-10</td>
			<td style="width:167px;">For fabrication of injecting needles.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-mediated reversible modulation of the mitogen-activated protein kinase pathway during cell differentiation and xenopus embryonic development

Kinaz aktivitesi, hücre proliferasyonu, farklılaşma, göç ve apoptoz dahil olmak üzere bir dizi hücresel işlev için çok önemlidir. Erken embriyonik gelişim sırasında, kinaz aktivitesi son derece dinamik ve embriyo boyunca yaygındır. Farmakolojik ve genetik yaklaşımlar, kinaz aktivitelerini saptamak için sıklıkla kullanılır. Ne yazık ki, bu stratejileri kullanarak üstün uzaysal ve zamansal çözünürlüğü elde etmek zor. Dahası, canlı hücreler ve çok hücreli organizmalarda kinaz aktivitesini tersine çevrilebilir bir tarzda kontrol etmek uygun değildir. Böyle bir sınırlama, gelişme ve farklılaşma sırasında kinaz aktivitesinin niceliksel bir şekilde anlaşılabilmesi için bir tıkanıklık olarak kalmaktadır. Bu çalışma, Fotactevatable protein Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) ve kriptokrom etkileşimli bazik-helis-loop-helezon (CIBN) &#39;nin N-terminal alanını içeren bir bisistronik sistemden yararlanan bir optogenetik strateji sunmaktadır. ReversiAktif protein kinaz (MAPK) sinyal yolağının etkinliği, canlı hücrelerdeki ışık aracılı protein translokasyonu yoluyla sağlanır. Bu yaklaşım, memeli hücre kültürlerine ve canlı omurgalı embriyolarına uygulanabilir. Bu bisistronik sistem benzer aktivasyon mekanizmaları ile diğer kinazların aktivitesini kontrol etmek üzere genelleştirilebilir ve diğer model sistemlerine uygulanabilir.

Fotoaktive edilebilir protein çiftlerinin rasimetrik ekspresyonu: Şekil 1A , domuz teshovirum-protein çiftlerine dayanan bir bisistronik optogenetik yapı CRY2-mCherry-Rafl-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (CRY2-2A-2CIBN olarak anılacaktır) 1 2A (P2A) peptidi, memeli hücre hatları 42 arasında en yüksek ribozom atlama verimliliğini gösterir. Daha önceki çalışmalarda, CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCherry-Raf1 için optimal oranın 2: 1 <sup...

Watch this Scientific Journal Video about Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development at JoVE.com

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Unit 1

Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

SH-SY5Y İnsan Nöroblastom Hücre Hattı Farklılaşma

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Tahmin ve Gen Düzenleme Elementlerin Doğrulama Retinoik Asit Kaynaklı Embriyonik sırasında Aktif Hücre Farklılaşma Kök

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...