Name: screening assays to characterize novel endothelial regulators involved in the inflammatory response
Uploaded: 2017-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Economía y competitividade (MINECO) e o Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (número de concessão IERPY 1149/16 para A.L.; MPY 1410/09 para S. Hortelano); pelo MINECO através do Fondo de Investigación en Salud (FIS) (subvenções números PI11.0036 e PI14.0055 para S. Hortelano). S. Herranz foi apoiado por IERPY 1149/16 de ISCIII.

1. cultura de células endoteliais <ol><li>cultura de tecido Tratado placas <ol><li>placas de cultura de tecido casaco 100 mm com gelatina de 2,5 mL de solução (autoclavados, 0,1% de gelatina em água destilada) por 30 min a 37 ° C; esse pode ser extrapolada para o formato exigido bem. Aspirar a solução de gelatina e deixe placas para secar ao ar livre do bairro de cultura de tecidos.</li>
	</ol></li> <li>As condições de cultura de tecido <ol><li>cultivar as MLEC-04 células de...

<ol>
	<li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+disease.">Crohn's disease.</a> Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li><li>Skeoch, S., Bruce, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+in+rheumatoid+arthritis:+is+it+all+about+inflammation?.">Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?.</a> Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).</li><li>Gerhardt, T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+across+the+vessel+wall.">Monocyte trafficking across the vessel wall.</a> Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).</li><li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+that+exclusively+express+TLR4+on+endothelial+cells+can+efficiently+clear+a+lethal+systemic+Gram-negative+bacterial+infection.">Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection.</a> J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).</li><li>McDonald, B., Jenne, C. 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SuperScript&#174; III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf</a> (2013)</li><li>Livak, K. J., Schmittge, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>. Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf</a> (2017)</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li><li>. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf</a> (2017)</li><li>Hohsfield, L. 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H., Stani&#353;i&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+correlation+between+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+in+chronic+subdural+hematoma+patients+assessed+with+factor+analysis.">The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis.</a> PloS One. 9 (2), e90149 (2014).</li><li>Guha, M., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+induction+of+gene+expression+in+human+monocytes.">LPS induction of gene expression in human monocytes.</a> Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).</li><li>Tabas, I., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+therapy+in+chronic+disease:+challenges+and+opportunities.">Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities.</a> Science. 339 (6116), 166-172 (2013).</li></ol>

Este protocolo endotelial descreve uma tecnologia gradual que estabelece as bases para explorar novos mecanismos envolvidos na regulação da resposta inflamatória. Essas abordagens baseiam-se no estudo da atividade endotelial estimulado por LPS e avaliar os passos críticos envolvidos no recrutamento de leucócitos durante a resposta inflamatória, especificamente: liberação de citocinas endotelial, adesão endotelial adesão de expressão e leucócitos moléculas para a camada vascular. Uma vez que os parâmetros en...

A inflamação é uma resposta biológica benéfica contra agentes infecciosos, com o objectivo principal de eliminar o patógeno e reparar o tecido danificado. Sob certas condições, tais como infecções crônicas ou doenças auto-imunes, inflamação não resolve. Em vez disso, há uma reação anormal com a contínua infiltração de leucócitos, resultando em uma resposta imune prolongada que leva a danos nos tecidos, fibrose, perda de função e em geral, deficiência e em alguma morte de casos do paciente. Estes distúrbios humanos, catalogados como doenças inflamatórias, todos envolvem os vasos sanguíneos para o controle de extravasamento de leucócitos1,2.
As células endoteliais desempenham um papel fundamental na regulação da resposta inflamatória, controlando o tráfico de leucócitos. Quando a camada endotelial é exposta aos mediadores inflamatórios tais como LPS, o endotélio descanso ativa e expressa as citocinas pró-inflamatórias (Cxcl10 Cxcl5, Cxcl1, etc) e moléculas de adesão (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) esse favor recrutamento de leucócitos para o local de infecção em circulação. Leucócitos aprontados pelas citocinas lançadas depois mediam rolando e interação com a camada endotelial através as contrapartes adesivas correspondentes: PSGL-1 e selectina α4β1 integrina a VCAM-1 e αLβ2 integrina a ICAM-1. Finalmente, os leucócitos migram da vasculatura para o foco da inflamação3.
O papel essencial do endotélio na regulação da resposta inflamatória tem sido demonstrado em ratos que foram geneticamente modificados para expressar o receptor de LPS, receptores do tipo toll 4 (TLR4), apenas sobre as células endoteliais. Estes animais endotelial-TLR4 foram capazes de responder a uma inflamação mediada por LPS e detectar a infecção gerada após a inoculação de bactérias e, consequentemente, alcançar a resolução de infecção e sobrevivência a níveis semelhantes, como o tipo selvagem ratos4 , 5.
Para o caminho de resposta inflamatória endotélio-regulado, foi postulado que a inibição em algumas fases da interação leucócito-endotélio resultaria na redução da migração trans-endotelial e um prognóstico melhor para doenças inflamatórias-relacionados. Na verdade, várias estratégias visando a interação de ativação e leucócito-endotélio endotelial foram projetadas para impedir o extravasamento de células do sistema imunológico como um tratamento para disorders inflammatory6,7.
Neste relatório, descrevemos um grupo completo de técnicas em vitro para caracterizar plenamente a atividade endotelial em resposta para os estímulo inflamatório LPS e seu papel na ativação de leucócitos e adesão à camada vascular. O modelo de célula endotelial usado neste manuscrito foi a linha de endothelial da pilha do pulmão de rato (MLEC-04), conforme descrito por Hortelano et al 8. o MLEC-04 linha de celular foi validada na literatura para ser um sistema adequado para estudar a ativação endotelial9,10. Com base em interesses de pesquisa, essas abordagens podem ser facilmente extrapoladas para qualquer endoteliais ou sistemas de leucócitos e perfil inflamatório. Uma vez que são definidos os parâmetros endoteliais nas condições selecionados, o sistema pode testar novos medicamentos sobre a experimentação proposto para avaliar a ativação vascular. Neste contexto inflamatório, as células do endotélio testadas com o composto de interesse podem ser comparadas com as condições de controle das células, e quaisquer diferenças resultantes podem informar resultado de prognóstico da droga no desenvolvimento e progressão da inflamação. Para concluir, propomos um sistema relevante para caracterizar novos alvos de drogas às células endoteliais, que podem influenciar a concepção de romance vasculares específicas terapias contra doenças inflamatórias relacionadas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="820">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Gelatin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">G9391</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-160E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9424</td>
			<td>RNA extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol absoluto</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1,310,861,612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Pure H2O</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1017979</td>
			<td>RNAse free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Pronadisa</td>
			<td>8020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stain for agarose gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>s33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperScript III First-Strand Synth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td height="21" style="height:21px;width:116px;">18080051</td>
			<td>Reagents for RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Fast SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td align="left">4385610</td>
			<td>Fluorescent stain for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp Fast Optical 96-Well</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346906</td>
			<td>Plates for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-bottom 96 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytometry tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TX100</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>212314</td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCl</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1,319,401,211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,064,041,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td>sigma</td>
			<td>13721-39-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents for bicinchoninic acid assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>merck</td>
			<td align="left">805,740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">PVDF Transfer Membrane, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Panreac</td>
			<td align="left">1,623,121,611</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-515Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>c8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic acid</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1,310,081,611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1,310,911,612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Crystal violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 96%</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1,410,851,212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFSE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-115F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infinite M200</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>M200</td>
			<td>Multi mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Doc 2000</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2000</td>
			<td>Gel documentation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StepOnePlus</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>StepOnePlus</td>
			<td>qPCR system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSQuant Analyzer 10</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Analyzer 10</td>
			<td>Cytometry equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChemiDoc MP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MP</td>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PECAM-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ICAM-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1054602</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">E-selectin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553749</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">VCAM-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553330</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ICAM-1</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553250</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rat IgG-FITC</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-095-006</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti armenian hamster-FITC</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>127-095-160</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG isotyope control</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:116px;">10700</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Armenian hamster IgG isotype control</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-33220</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P-I&#954;&#914;-&#945;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2859</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5441</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P-ERK</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse HRP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>LNXA931/AE</td>
			<td>Use at 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit HRP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>LNA934V/AG</td>
			<td>Use at 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-3823</td>
			<td>Use at 1:10000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening assays to characterize novel endothelial regulators involved in the inflammatory response

A camada endotelial é essencial para manter a homeostase do corpo, controlando muitas funções diferentes. Regulação da resposta inflamatória pela camada endotelial é crucial para lutar eficientemente contra entradas prejudiciais e ajuda na recuperação de áreas danificadas. Quando as células endoteliais são expostas a um ambiente inflamatório, tais como o componente exterior da membrana de bactérias Gram-negativas, lipopolissacarídeo (LPS), eles expressam solúveis citocinas pró-inflamatórias, como Ccl5, Cxcl1 e Cxcl10 e acionar o ativação de leucócitos em circulação. Além disso, a expressão de moléculas de adesão E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 na superfície endotelial permite a interação e a adesão de leucócitos ativados para a camada endotelial e eventualmente o extravasamento para o tecido inflamado. Nesse cenário, a função endotelial deve ser fortemente regulamentada porque ativação excessiva ou com defeito no recrutamento de leucócitos pode levar a desordens inflamatórias-relacionadas. Desde que muitos destes transtornos não têm um tratamento eficaz, novas estratégias com foco na camada vascular devem ser investigadas. Propomos a ensaios abrangentes que são úteis para a busca de novos reguladores endoteliais que modificar a função dos leucócitos. Analisamos a ativação endotelial usando alvos específicos expressão envolvidos no recrutamento de leucócitos (por exemplo, citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão) com várias técnicas, incluindo: (reação em cadeia de polimerase quantitativo em tempo real RT-qPCR), western-blot, ensaios de aderência e citometria de fluxo. Essas abordagens determinar função endotelial no contexto inflamatório e são muito úteis para realizar ensaios de triagem para caracterizar o romance reguladores inflamatórios endoteliais que são potencialmente valiosos para a concepção de novas estratégias terapêuticas.

Avaliação da ativação de células endoteliais induzida por LPS por RT-qPCR
As soro fome MLEC-04 células foram estimuladas por 100 ng/mL de LPS para 6h, e a expressão de gene endotelial foi avaliada por meio de RT-qPCR, comparando a expressão de marcadores de ativação para a condição de repouso. Como mostrado na figura 1A, as células de LPS incubados MLEC-04 induziram a expressão de RNAm de...

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Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Endotélio vascular controla firmemente o recrutamento de leucócitos. Extravasamento de leucócitos inadequado contribui para doenças inflamatórias humanas. Portanto, à procura de novos elementos reguladores de ativação endotelial é necessária projetar terapias melhoradas para desordens inflamatórias. Aqui, descrevemos uma metodologia abrangente para caracterizar o romance reguladores endoteliais que podem modificar leucócitos tráfico durante a inflamação.

Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Imunologia e Infecção

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Uma Introdução à Vespas parasitas de<em&gt; Drosophila</em&gt; E Resposta Imune a antiparasitários

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Ensaios para a identificação de novos antivirais contra a febre catarral ovina vírus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS Mediada frente Triagem Genética para identificação de genes envolvidos na resistência não hospedeiras


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Phenomics fago: Abordagens fisiológicas para Caracterizar Novel Proteínas Virais

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...