Name: screening assays to characterize novel endothelial regulators involved in the inflammatory response
Uploaded: 2017-09-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) y el Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (número de licencia IERPY 1149/16 para A.L.; MPY 1410/09 para S. Hortelano); por el MINECO a través del Fondo de Investigación en Salud (FIS) (otorga números PI11.0036 y PI14.0055 a S. Hortelano). S. Herranz fue apoyada por IERPY 1149/16 del ISCIII.

1. cultivo de células endoteliales <ol><li>cultivo de tejidos tratados placas <ol><li>placas de cultivo de tejidos capa 100 mm con gelatina de 2,5 mL de solución (autoclave, 0.1% gelatina en agua destilada) por 30 min a 37 ° C; esta puede ser extrapolado para el formato bien requerido. Aspirar la solución de gelatina y dejar placas secar al aire en la campana de cultivo de tejido.</li>
	</ol></li> <li>Las condiciones de cultivo de tejidos <ol><li>cultivar las células de la LMCE-0...

<ol>
	<li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crohn's+disease.">Crohn's disease.</a> Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li><li>Skeoch, S., Bruce, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+in+rheumatoid+arthritis:+is+it+all+about+inflammation?.">Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?.</a> Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).</li><li>Gerhardt, T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+trafficking+across+the+vessel+wall.">Monocyte trafficking across the vessel wall.</a> Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).</li><li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+that+exclusively+express+TLR4+on+endothelial+cells+can+efficiently+clear+a+lethal+systemic+Gram-negative+bacterial+infection.">Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection.</a> J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).</li><li>McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kupffer+cells+and+activation+of+endothelial+TLR4+coordinate+neutrophil+adhesion+within+liver+sinusoids+during+endotoxemia.">Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).</li><li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation.">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).</li><li>Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+in+acute+stroke:+targeting+excitotoxicity,+oxidative+and+nitrosative+stress,+and+inflammation.">Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation.</a> Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).</li><li>Hortelano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ILK+mediates+LPS-induced+vascular+adhesion+receptor+expression+and+subsequent+leucocyte+trans-endothelial+migration.">ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration.</a> Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).</li><li>Palaz&#243;n, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agonist+anti-CD137+mAb+act+on+tumor+endothelial+cells+to+enhance+recruitment+of+activated+T+lymphocytes.">Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes.</a> Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).</li><li>Jim&#233;nez-Garc&#237;a, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol+diterpene+prevents+LPS-triggered+inflammatory+responses+by+inhibiting+endothelial+activation.">8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation.</a> Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).</li><li>. SuperScript&#174; III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf</a> (2013)</li><li>Livak, K. J., Schmittge, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>. Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf</a> (2017)</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li><li>. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf</a> (2017)</li><li>Hohsfield, L. A., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+infusion+of+monocytes+isolated+from+2-week-old+mice+enhances+clearance+of+Beta-amyloid+plaques+in+an+Alzheimer+mouse+model.">Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model.</a> PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).</li><li>Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculosis+during+TNF-&#945;+inhibitor+therapy,+despite+screening.">Tuberculosis during TNF-&#945; inhibitor therapy, despite screening.</a> Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Tedgui, A., Mallat, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+mechanisms+in+the+vascular+wall.">Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall.</a> Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).</li><li>Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+interleukin-1+receptor+2+binding+prevents+cleavage+and+activity+of+interleukin-1&#945;,+controlling+necrosis-induced+sterile+inflammation.">Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1&#945;, controlling necrosis-induced sterile inflammation.</a> Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).</li><li>Pripp, A. H., Stani&#353;i&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+correlation+between+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+in+chronic+subdural+hematoma+patients+assessed+with+factor+analysis.">The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis.</a> PloS One. 9 (2), e90149 (2014).</li><li>Guha, M., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+induction+of+gene+expression+in+human+monocytes.">LPS induction of gene expression in human monocytes.</a> Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).</li><li>Tabas, I., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+therapy+in+chronic+disease:+challenges+and+opportunities.">Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities.</a> Science. 339 (6116), 166-172 (2013).</li></ol>

Este protocolo endotelial describe una tecnología paso a paso que establece las bases para explorar nuevos mecanismos implicados en la regulación de la respuesta inflamatoria. Estos enfoques se basan en el estudio de la actividad endotelial estimulado por LPS y evaluar los pasos críticos involucrados en el reclutamiento de leucocitos durante la respuesta inflamatoria, específicamente: liberación de citoquinas endotelial, adhesión endotelial las moléculas expresión y leucocito adherencia a la capa vascular. Una ve...

La inflamación es una respuesta biológica beneficiosa frente a agentes infecciosos, con el objetivo principal para eliminar el patógeno y reparar el tejido dañado. Bajo ciertas condiciones, como infecciones crónicas o enfermedades autoinmunes, la inflamación no se resuelve. En cambio, es una reacción aberrante con la continua infiltración de leucocitos, dando por resultado una respuesta inmune prolongada que conduce a daño de tejido, fibrosis, pérdida de función y en general, discapacidad y en algunos casos la muerte del paciente. Estos trastornos humanos, catalogados como enfermedades inflamatorias, todas involucran los vasos sanguíneos para el control de leucocitos extravasación1,2.
Las células endoteliales juegan un papel fundamental en la regulación de la respuesta inflamatoria al controlar el tráfico de leucocitos. Cuando la capa endotelial está expuesta a mediadores inflamatorios tales como el LPS, el endotelio reposo activa y expresa las citoquinas pro inflamatorias (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) y moléculas de adhesión (E-selectina, VCAM-1 y ICAM-1) que favorecen reclutamiento de leucocitos al sitio de infección de la circulación. Los leucocitos preparados por las citoquinas liberadas entonces median del balanceo y la interacción con la capa endotelial a través de las correspondientes contrapartes adhesivo: PSGL-1 y selectina, la integrina α4β1 VCAM-1, αLβ2 integrina ICAM-1. Finalmente, los leucocitos migran a través de la vasculatura hacia el foco de inflamación3.
El papel esencial del endotelio en la regulación de la respuesta inflamatoria se ha demostrado en ratones que fueron genéticamente modificados para expresar el receptor de LPS, el receptor de tipo toll 4 (TLR4), sólo en las células endoteliales. Estos animales endotelial TLR4 eran capaces de responder a una inflamación mediada por el LPS y para detectar la infección generada después de la inoculación de bacterias y en consecuencia lograr la resolución de la infección y supervivencia en niveles similares como los ratones de tipo salvaje4 , 5.
Por la vía de la respuesta inflamatoria regulada por el endotelio, se ha postulado que la inhibición en algunas etapas de la interacción leucocito endotelio daría lugar a la reducción de la migración trans-endotelial y un mejor pronóstico para enfermedades inflamatorias. De hecho, diversas estrategias dirigidas a la interacción endotelial activación y leucocito endotelio han sido diseñados para impedir la extravasación de células inmunitarias como tratamiento para trastornos inflamatorios6,7.
En este informe, describimos un grupo completo de en vitro técnicas para caracterizar completamente la actividad endotelial en respuesta a los LPS de estímulo inflamatorio y su papel en la activación del leucocito y adherencia a la capa vascular. El modelo de célula endotelial utilizado en este manuscrito fue la línea de células endoteliales de pulmón de ratón (LMCE-04), según lo descrito por Hortelano et al. 8. línea de celular de la LMCE-04 ha sido validado en la literatura un sistema apropiado para el estudio de activación endotelial9,10. Basado en sus intereses de investigación, estos enfoques se pueden extrapolar fácilmente a cualquier endotelial o sistemas del leucocito y el perfil inflamatorio. Una vez definidos los parámetros endoteliales en las condiciones seleccionadas, el sistema puede probar nuevos fármacos en la experimentación propuesta para evaluar la activación vascular. En este contexto inflamatorio, las células del endotelio con el compuesto de interés pueden ser comparadas con las condiciones de control de las células, y las diferencias resultantes pueden informar resultado pronóstico del fármaco sobre el desarrollo y progresión de la inflamación. Para concluir, proponemos un sistema relevante para caracterizar nuevos objetivos de medicamentos a las células endoteliales, que pueden influir en el diseño de nuevas terapias vasculares específicos contra enfermedades inflamatorias.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="820">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Gelatin</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">G9391</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-160E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9424</td>
			<td>RNA extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol absoluto</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1,310,861,612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Pure H2O</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1017979</td>
			<td>RNAse free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Pronadisa</td>
			<td>8020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stain for agarose gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>s33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperScript III First-Strand Synth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td height="21" style="height:21px;width:116px;">18080051</td>
			<td>Reagents for RT-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Fast SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td align="left">4385610</td>
			<td>Fluorescent stain for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp Fast Optical 96-Well</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346906</td>
			<td>Plates for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-bottom 96 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytometry tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TX100</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>212314</td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCl</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1,319,401,211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,064,041,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td>sigma</td>
			<td>13721-39-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td>Reagents for bicinchoninic acid assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>merck</td>
			<td align="left">805,740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">PVDF Transfer Membrane, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Panreac</td>
			<td align="left">1,623,121,611</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-515Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>c8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic acid</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1,310,081,611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1,310,911,612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Crystal violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 96%</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1,410,851,212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFSE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-115F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infinite M200</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>M200</td>
			<td>Multi mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel Doc 2000</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2000</td>
			<td>Gel documentation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StepOnePlus</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>StepOnePlus</td>
			<td>qPCR system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSQuant Analyzer 10</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Analyzer 10</td>
			<td>Cytometry equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChemiDoc MP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MP</td>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PECAM-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ICAM-2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>1054602</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">E-selectin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553749</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">VCAM-1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553330</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ICAM-1</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553250</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rat IgG-FITC</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-095-006</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti armenian hamster-FITC</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>127-095-160</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat IgG isotyope control</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:116px;">10700</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Armenian hamster IgG isotype control</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-33220</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P-I&#954;&#914;-&#945;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2859</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5441</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P-ERK</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9101</td>
			<td>Use at 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse HRP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>LNXA931/AE</td>
			<td>Use at 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit HRP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>LNA934V/AG</td>
			<td>Use at 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rat HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-3823</td>
			<td>Use at 1:10000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening assays to characterize novel endothelial regulators involved in the inflammatory response

La capa endotelial es esencial para mantener la homeostasis en el cuerpo mediante el control de muchas funciones diferentes. Regulación de la respuesta inflamatoria por la capa endotelial es crucial para combatir eficientemente insumos perjudiciales y ayuda en la recuperación de áreas dañadas. Cuando las células endoteliales están expuestas a un ambiente inflamatorio, como el componente externo de la membrana de bacterias Gram-negativas, lipopolisacárido (LPS), express soluble citoquinas proinflamatorias, tales como Ccl5, Cxcl1 y Cxcl10 y desencadenar la activación de leucocitos en circulación. Además, la expresión de moléculas de adhesión E-selectina, VCAM-1 y ICAM-1 en la superficie endotelial permite la interacción y adhesión de los leucocitos activados a la capa endotelial y finalmente la extravasación hacia los tejidos inflamados. En este escenario, la función endotelial debe ser estrictamente regulada debido a una activación excesiva o defectuosa en el reclutamiento de leucocitos podría conducir a trastornos inflamatorios. Puesto que muchos de estos trastornos no tienen un tratamiento eficaz, deben investigarse nuevas estrategias con un enfoque en la capa vascular. Proponemos el análisis integrales que son útiles para la búsqueda de nuevos reguladores endoteliales que modifican la función leucocitaria. Analizamos activación endotelial utilizando objetivos de expresión específicos involucrados en el reclutamiento de leucocitos (por ejemplo, citocinas, quimiocinas y moléculas de adhesión) con varias técnicas, incluyendo: (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo en tiempo real RT-qPCR), western-blot, ensayos de citometría y adhesión de flujo. Estos enfoques determinan la función endotelial en el contexto inflamatorio y son muy útiles para llevar a cabo ensayos de investigación para caracterizar nuevos reguladores inflamatorios endoteliales que son potencialmente valiosos para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas.

Evaluación de la activación de células endoteliales inducida por LPS por RT-qPCR
El suero de hambre LMCE-04 las células fueron estimuladas por 100 ng/mL de LPS durante 6 h, y la expresión de genes endoteliales se evaluó mediante RT-qPCR comparando la expresión de marcadores de activación a la condición de reposo. Como se muestra en la figura 1A, las células se incubaron LPS LMCE-04 indujeron ...

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Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Endotelio vascular controla firmemente el reclutamiento leucocitario. Extravasación leucocitaria inadecuada contribuye a enfermedades inflamatorias humanas. Por lo tanto, es necesario diseñar mejores terapias para trastornos inflamatorios buscando nuevos elementos reguladores de la activación endotelial. Aquí, describimos una completa metodología para caracterizar nuevos reguladores endoteliales que pueden modificar el tráfico de leucocitos durante la inflamación.

Selección de ensayos para caracterizar nuevos reguladores endoteliales implicados en la respuesta inflamatoria

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi detección de los factores del huésped implicados en Vaccinia Infección del virus utilizando Drosophila Celdas

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Investigación

Inmunología e Infección

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Una introducción a las avispas parasitarias de<em&gt; Drosophila</em&gt; Y la respuesta inmune antiparasitario

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

El uso de interferón-γ enzimo-inmunoensayo para la Caracterización de Nuevos epítopos de células T del virus del papiloma humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS mediada por delante de detección genética para la identificación de genes implicados en la resistencia no huésped


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Fenómica fagos: enfoques fisiológicos para caracterizar Novela Virales Proteínas

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...