Name: in vitro polymerization of f-actin on early endosomes
Uploaded: 2017-08-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes at JoVE.com

תמיכה נתקבל שוויצרי הקרן הלאומית למדע; התוכנית Sinergia שוויצרי; הפולנית-השוויצרי מחקר תוכנית (PSPB-094/2010); NCCR בביולוגיה כימיים; LipidX מן היוזמה SystemsX.ch שוויצרי, מוערכים על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (כדי ג'יי ג'י). O. מ נתמכה על ידי התחברות לטווח ארוך EMBO (ALTF-516-2012).

1-פתרונות, ההכנות הערה: כל מאגרי ופתרונות צריכה להיות מוכנה מזוקק פעמיים (dd) H 2 O. מכיוון המדינה הידרציה של סוכרוז משתנה, הריכוז הסופי של כל הפתרונות סוכרוז להיקבע באמצעות משאבות-מעבדות של.
<ol><li>הכן באגירה פוספט תמיסת מלח ללא קטיונים דו ערכיים (נולד ב- PBS): 137 מ מ נז'י, מ מ 2.7...

<ol>
	<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+maturation.">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).</li><li>Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+Maturation,+Transport+and+Functions.">Endosome Maturation, Transport and Functions.</a> Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).</li><li>Puthenveedu, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-dependent+sorting+of+recycling+proteins+by+actin-stabilized+endosomal+microdomains.">Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains.</a> Cell. 143 (5), 761-773 (2010).</li><li>Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer-mediated+endosomal+protein+sorting:+all+WASHed+up!.">Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!.</a> Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).</li><li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer:+a+master+conductor+of+endosome+sorting.">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).</li><li>Woodman, P. G., Futter, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+bodies:+co-ordinated+progression+to+maturity.">Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).</li><li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ESCRT+pathway.">The ESCRT pathway.</a> Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).</li><li>Morel, E., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A2+binding+to+endosomes+and+functions+in+endosomal+transport+are+regulated+by+tyrosine+23+phosphorylation.">Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).</li><li>Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin+and+cortactin+control+actin-dependent+multivesicular+endosome+biogenesis.">Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis.</a> Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).</li><li>Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+membrane+domains+on+endosomes+in+the+recycling+pathway+visualized+by+multicolor+imaging+of+Rab4,+Rab5,+and+Rab11.">Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11.</a> J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).</li><li>Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A2-dependent+polymerization+of+actin+mediates+endosome+biogenesis.">Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis.</a> Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cytoskeleton+and+molecular+motors+in+endosomal+dynamics.">The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics.</a> Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).</li><li>Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+II+regulates+multivesicular+endosome+biogenesis+in+the+degradation+pathway+of+animal+cells.">Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells.</a> EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).</li><li>Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rab5+controls+early+endosome+fusion+in+vitro.">rab5 controls early endosome fusion in vitro.</a> Cell. 64 (5), 915-925 (1991).</li><li>Wandinger-Ness, A., Zerial, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+proteins+and+the+compartmentalization+of+the+endosomal+system.">Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).</li><li>Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+intermediates+in+the+pathway+of+intercompartmental+transport+in+a+cell-free+system.">Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system.</a> Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).</li></ol>

אקטין ממלא תפקיד מכריע אנדוזום ממברנה dynamics4,14. בעבר דיווחנו כי אקטין התגרענות הפילמור מתרחשים על endosomes מוקדם, ויוצרים F-אקטין תיקונים קטנים או רשתות. רשתות אלה F-אקטין נדרשים לחלוטין להעברה ממברנה מעבר endosomes מוקדמת לאורך השביל השפלה. הפרעה בשלב כלשהו של תהליך ...

התאים האיקריוטים גבוה יותר, חלבונים ושומנים הם הפנימו לתוך מוקדם endosomes איפה המיון מתבצע. כמה חלבונים ושומנים, שנועד להיות reutilized, שולבו צינורי מחוזות endosomes מוקדמת, ואז מועברים קרום פלזמה או טרנס-גולג'י רשת (TGN)1,2. לעומת זאת, חלבונים ושומנים אחרים ארוזים באופן סלקטיבי לתוך מחוזות endosomes מוקדמת כי התערוכה מראה multivesicular. אזורים אלה הרחב, על ניתוק ממברנות endosomal מוקדם, בסופו של דבר בוגרת לתוך שלפוחית המוביל endosomal חינם או גופים multivesicular (ECV/MVBs), אשר אחראים על תובלת המטענים לעבר המנוח endosomes1, 2.
אקטין ממלא תפקיד מכריע בתהליך שיפוץ ממברנה המשויכים להן אנדוזום והיכולת מיון endosomal. חלבון מיון לאורך המסלולים מיחזור קרום פלזמה או את TGN תלוי את retromer קומפלקס החלבונים הקשורים. מכונות מיון זה נראה להיות מצמידים את היווצרות של מיחזור בקוריאנית באמצעות האינטראקציות של retromer מתחם עם צרעה והצלקת homologue (שטיפה) מורכב, מסועף אקטין3,4,5 . לעומת זאת, מולקולות המיועדים השפלה, במיוחד הפעלת קולטנים איתות, מסודרים לתוך שלפוחית intraluminal (ILVs) על ידי endosomal מיון מתחמי הדרושים עבור תחבורה (ESCRT)2,6, 7. בעוד תפקיד אפשרי של אקטין בתהליך מיון תלוי-ESCRT אינו ידוע, F-אקטין ממלא תפקיד חשוב להן של ECV/MVBs, תחבורה מעבר endosomes המוקדמות. בפרט, מצאנו כי annexin A2 נקשר מועשרת כולסטרול אזורים של אנדוזום מוקדם, ויחד עם spire1, nucleates פלמור אקטין-F. היווצרות של הרשת אקטין מסועף מובחנים endosomes דורשת את הפעילות הסתעפות של החלבון אקטין הקשורות (ARP) 2/3 מורכבים, כמו גם את moesin חלבון ERM ו-8,9cortactin חלבון מחייב אקטין.
כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות. Assay הזה שימש בעבר כדי לחקור את התפקיד של annexin A2 ב- F-אקטין התגרענות ואת moesin ואת cortactin על היווצרות endosomal אקטין רשתות8,9. עם זה פרוטוקול במבחנה , הסדרה מורכבת של התגובות המתרחשות על endosomes במהלך פלמור אקטין הופכים לבצע ניתוח הביוכימי והמולקולרי של השלבים רציפים של התהליך, לרבות התגרענות אקטין, ליניארי פלמור, מסעף ו crosslinking.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1287">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:477px;">NaCl</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">71380</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>196770010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Na2HPO4</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>424370025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesiun acetate tetrahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11017101001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10253286001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236624001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehide</td>
			<td>Polysciences. Inc</td>
			<td>380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor 555 phalloidin</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A34055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Actin rhodamine</td>
			<td>Cytoskeleton. Inc</td>
			<td>APHR-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DABCO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-2522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter 0.22um</td>
			<td>Millex&#160;</td>
			<td>SL6V033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Round 10cm dishes for cell culture</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Assistent</td>
			<td>569/3 40569003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15-ml polypropylen tube&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hypodermic Needle 22G Black 30mm&#160;</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro glass slides&#160;</td>
			<td>Assistent</td>
			<td>2406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18X18-mm glass coverslip</td>
			<td>Assistent</td>
			<td>1000/1818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SW60 centrifuge tube</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>344062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TLS-55 centrifuge tube</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200-&#956;l yellow tip</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-0706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1000-&#956;l Blue Graduated Tip</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1111-6801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5-ml test tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C 311-04-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18-mm diameter round coverslip&#160;</td>
			<td>Assistent</td>
			<td>1001/18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19&#160;mm)&#160;</td>
			<td>In vitro Scientific</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Refractometer</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>79729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorvall WX80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tabletop ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>TL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SW60 rotor</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>335649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TLS-55 rotor</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>346936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM-780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fugene HD transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:145px;">E2311</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein assay reagent A</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein assay reagent B</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein assay reagent S</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell scraper</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Refractometer</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH Meter 691</td>
			<td>Metrohm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NIH, Bethesda MD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro polymerization of f-actin on early endosomes

פונקציות רבות אנדוזום מוקדם, במיוחד מטען החלבון ומיון ממברנה דפורמציה, תלויים כתמים של חוטים F-אקטין קצרים nucleated על גבי קרום endosomal. הקמנו מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה גנטי וביוכימי מניפולציות. שברים Endosomal מוכנות על ידי ציפה במעברי צבע סוכרוז מתאי לבטא את החלבון endosomal מוקדם GFP-RAB5. שברים cytosolic מוכנות של קבוצות נפרדות של תאים. הן endosomal והן cytosolic שברים ניתן לאחסן קפוא חנקן נוזלי, במידת הצורך. ב וזמינותו, endosomal ואת cytosolic שברים מעורבים, התערובת מודגרת ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים המתאימים (למשל, יונית כוח, להפחית את הסביבה). בזמן הנסיעה, תערובת התגובה הוא קבוע, F-אקטין מתגלה עם phalloidin. התגרענות אקטין, הפילמור מכן נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. כאן, אנחנו מדווחים כי assay זה יכול לשמש כדי לחקור את התפקיד של הגורמים המעורבים או אקטין התגרענות על הקרום, או התארכות עוקבות, מ., או crosslinking של F-אקטין חוטים.

כדי לקבל תובנות לגבי היווצרות של F-אקטין תיקונים הקרומים אנדוזום מוקדם, עקבנו פרוטוקול המתוארים באיור2. בקצרה, התאים היו transfected עם GFP-RAB5, ואז endosomes מוקדם הוכנו על ידי subcellular fractionation. אלה endosomes מוקדם מטוהרים היו מודגרות עם ציטוזול על מנת לספק אקטין עצמה, כמו גם ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes at JoVE.com

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

פונקציות אנדוזום מוקדם תלויים פלמור אקטין-F. כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה הביוכימי ותעשיה מניפולציות.

במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...