Name: live-cell measurement of odorant receptor activation using a real-time camp assay
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay at JoVE.com

작품은 중국 국립 과학 재단 (31070972), 과학 및 기술 위원회의 상하이 시 (16ZR1418300), 혁신적인 연구 팀의 상하이 시 교육 위원회, 상하이 동부에 대 한 프로그램에 의해 지원 되었다 학술 프로그램 (J50201), 그리고 중국 (2012CB910401)의 국가 기본 연구 프로그램.

1. Culturing 및 유지 보수의 Hana3A 셀 <ol><li>최소 필수 매체 (MEM)와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100의 10 mL에 있는 유지 세포 µ g/mL 페니실린-스, 그리고 1.25 µ g/mL 암포 B 100 m m 5% CO 2와 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서 셀 문화 요리. 모든 다른 통로와 1 µ g/mL puromycin 플라스 (참조 소개)의 안정 되어 있는 transfection를 유지 하기 위해 추가. 
	참고: 클래스 II 생물 안전 캐비닛 되도?...

<ol>
	<li>Malakoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+the+scent+of+avian+olfaction.">Following the scent of avian olfaction.</a> Science. 286 (5440), 704-705 (1999).</li><li>Zippel, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+of+vertebrate+olfaction:+D.M.+Stoddart.+Chapman+and+Hall,+Andover,+Great+Britain,+1980.+£15.00,+234+pp.+ISBN+0-412-21820-8.">The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8.</a> Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).</li><li>Dryer, L., Berghard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptors:+a+plethora+of+G-protein-coupled+receptors.">Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).</li><li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse.">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).</li><li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+human+olfactory+subgenome.">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li><li>Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+the+holy+grail:+establishing+a+molecular+basis+for+Mammalian+olfaction.">After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction.</a> Cell. 116 (2), 329-336 (2004).</li><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors:+a+molecular+basis+for+odor+recognition.">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li><li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+eugenol-responsive+and+muscone-responsive+mouse+odorant+receptors.">In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors.</a> J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).</li><li>Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+mammalian+olfactory+receptors:+measurement+of+receptor+activation+via+luciferase+activity.">High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity.</a> J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).</li><li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire.">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+activated+olfactory+neurons+identifies+odorant+receptors+for+odors+in+vivo.">Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).</li><li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+receptor+codes+for+odors.">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li><li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons.">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li><li>Kajiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+bases+of+odor+discrimination:+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants.">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li><li>von der Weid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transcriptional+profiling+of+chemosensory+neurons+identifies+receptor-ligand+pairs+in+vivo.">Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).</li><li>D'Hulst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MouSensor:+A+Versatile+Genetic+Platform+to+Create+Super+Sniffer+Mice+for+Studying+Human+Odor+Coding.">MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding.</a> Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).</li><li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+retention,+degradation,+and+aggregation+of+olfactory+G-protein+coupled+receptors.">Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li><li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors.">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).</li><li>Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ligands+for+olfactory+receptors+by+functional+expression+of+a+receptor+library.">Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library.</a> Cell. 95 (7), 917-926 (1998).</li><li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors.">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors.">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li><li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling.">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).</li><li>Durocher, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+gene+assay+for+high-throughput+screening+of+G-protein-coupled+receptors+stably+or+transiently+expressed+in+HEK293+EBNA+cells+grown+in+suspension+culture.">A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture.</a> Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).</li><li>Liberles, S. D., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+class+of+chemosensory+receptors+in+the+olfactory+epithelium.">A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium.</a> Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).</li><li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+effects+of+odorants+on+mouse+behavior.">Combinatorial effects of odorants on mouse behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).</li><li>Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+analysis+of+odor+coding+in+the+olfactory+epithelium.">A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium.</a> J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells.">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li><li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase.">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).</li><li>Fan, B. F., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Luminescent+Assays+for+GPCR+Studies:+Combination+of+Sensitive+Detection+and+Real-Time+Analysis+Expands+Applications.">Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications.</a> Genetic Engineering &amp; Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).</li><li>Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Butter+Aroma+Recombinate+Activates+Human+Class-I+Odorant+Receptors.">A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors.</a> J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).</li><li>Noe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OR2M3:+A+Highly+Specific+and+Narrowly+Tuned+Human+Odorant+Receptor+for+the+Sensitive+Detection+of+Onion+Key+Food+Odorant+3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol.">OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol.</a> Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).</li><li>Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+broadly+tuned+odorant+receptor+OR1A1+is+highly+selective+for+3-methyl-2,4-nonanedione,+a+key+food+odorant+in+aged+wines,+tea,+and+other+foods.">The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods.</a> Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+copper+in+detection+of+metal-coordinating+odorants.">Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smelling+Sulfur:+Copper+and+Silver+Regulate+the+Response+of+Human+Odorant+Receptor+OR2T11+to+Low-Molecular-Weight+Thiols.">Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols.</a> J Am Chem Soc. , (2016).</li><li>Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-transporting+protein+1+short+(RTP1S)+mediates+translocation+and+activation+of+odorant+receptors+by+acting+through+multiple+steps.">Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps.</a> J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).</li><li>Shirasu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+receptor+and+neural+pathway+responsible+for+highly+selective+sensing+of+musk+odors.">Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors.</a> Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).</li><li>Block, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implausibility+of+the+vibrational+theory+of+olfaction.">Implausibility of the vibrational theory of olfaction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).</li><li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors:+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection.">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li><li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction.">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).</li><li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families.">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li></ol>

특정 odorant에 노출 시 OR의 활성화를 정확 하 게 측정 하는 것은 후 각 정보의 코딩을 해독에 첫걸음 이다. 어떻게 하나의 예로 식별할 수는 생체 외에서 사용 하 여이 연구 대표 OR 식 시스템, 관심 및 이후에 수용 체의 향기가 있는 화학에 대 한 인간의 또는 레 퍼 토리 가운데 응답 ORs 에서처럼 실험 약리학은 화학 물질의 다양 한 농도 사용 하 여입니다. 우리의 결과 muscone에 대 한 진실 fid...

냄새의 감각을 음식을 얻기, 육 식 동물 및 위험 방지, 종, 구분 선택 메이 트1,2의 후 각 능력에 의존 하는 그들은 동물의 생존에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 기능의 실현 odorant 수용 체 (ORs), 후 각 상피 (OE)에 위치한 후 각 감각 신경 (OSNs)의 속눈썹 표면에 개별적으로 표현 되는에 따라 다릅니다. ORs 구성 최대 약 400와 1200 다양 한 OR 유전자 인간에서 G-단백질 결합 수용 체 (GPCR) superfamily의 가족 및 마우스, 각각3,4,5. ORs odorants에 의해 활성화 후 각 G-단백질 (Golf)의 순차적 활성화를 통해 증가 시킨된 세포내 캠프 수준 이어질 고 III adenylyl 있고 (ACIII)를 입력 합니다. 세포내 캠프의 결과 증가 수준 두 번째 메신저, 세포 표면에 뉴클레오티드 개폐 통로 열어, 트리거링 양이온 등 캘리포니아2 + 활동 전위, 그리고 궁극적으로 시작의 유입으로 작동할 수 있습니다. 신경-잠재적인 전송 그리고 후 각 지 각입니다. 감지 하 고 ORs로 odorants의 많은 수를 감 별 하는 과정은 후 각 지 각6,7의 첫 번째 단계로 간주 된다.
때문에 벅과 악 셀8 먼저 성공적으로 복제 odorant 수용 체 ORs에서 시작 하는 후 각 인식의 메커니즘을 해명, 또는 가족의 deorphanization이이 필드에 핫스팟 중 하나가 되었다. 다양 한 에 비보, ex vivo 생체 외에서 메서드와 OR 활성화를 측정 하는 보고 된9,10,,1112되었습니다. 캘리포니아2 + 영상 단일 셀 RT-PCR OSNs에 다음을 사용 하는 전통적인 방법 지방 족 odorants13,,1415다른 ORs의 식별을 사용할 수 있습니다. 더 최근에, 대규모 transcriptome 분석의 등장 더 많은 비보에 높은 처리량 방법의 개발 추진. 켄터키 분석 결과 eugenol 및 muscone 응답 마우스 ORs S100a5 tauGFP 기자 마우스 긴장과 microarray 분석9를 사용 하 여 식별합니다. Odorant 노출 후 또는 mRNA 수준에서 감소에 따라, 꿈의 기술 고용 모두 척추 및 비 척추 동물16OR 활성화 프로필을 확인 하려면 transcriptomic 접근. Matsunami 신경 활성화에 s 6의 인 산화를 감안할 때, 응답 ORs12식별 phosphorylated 리보솜 immunoprecipitations에서 시퀀스 된 mRNAs를 유사 하 게, 그룹. 마지막으로, 파인 그룹 슈퍼 스니퍼 쥐 냄새에서 vivo에서, MouSensor 기술17로 알려진 코딩을 공부 하는 플랫폼으로 서 역할을 수 있는 보고.
생체 외에서 영역에서 OSNs 경작의 도전은 OR 기능 식에 vivo에서 모방 분리 식 시스템 ORs 향기로운 화학 제품의 대규모 심사를 실시 하 이상적인 솔루션입니다. 그럼에도 불구 하 고, 이후 네이티브 OSNs에서 다 비 후 각 근원의 경작된 셀 라인 또는 단백질 바인딩과 그물에 원형질 막에 트래픽을 수 없습니다 유지 됩니다, 또는 저하 및 수용 체 기능18 의 손실에 결과 , 19.이 문제를 해결 하려면 광범위 한 작품을 만들어왔다 OR 기능 식 분리 세포의 세포 막에 복제. Krautwurst 외. 먼저 연결할 rhodopsin (Rho-태그)의 처음 20 아미노산 또는 단백질의 N 맨끝 그리고이 승진 (HEK) 인간 미 발달 신장 세포20일부 ORs의 세포 표면 표현. 단일 OSNs에서 진 식 (세이 지) 도서관 분석의 직렬 분석을 실시 하 여 사이토 외. 먼저 수용 체 수송 단백질 (RTP) 가족 구성원, RTP1, RTP2, 및 수용 체 식 증강 단백질 1 (REEP1) 또는 세포 막에 매매를 촉진 하 고 ORs에서 HEK293T 셀 의 응답 odorant 중재 하는 복제 21. 이러한 결과에 따라, Matsunami 그룹 Hana3A 세포 라인을 설립 성공적으로, 안정적으로 HEK293T에서 RTP1, RTP2, REEP1, 및 Gαolf 와 페 고 뚜렷이 효율적인 또는 기능에 대 한로 태그 ORs와 페 식입니다. 후속 연구 1) 짧은 형태의 RTP1, RTP1S, 홍보 하거나 원래 RTP1 단백질과 2) 유형 3 muscarinic 아 세 틸 콜린 수용 체 (M3R) β-arrestin-2의 억제를 통해 또는 활동을 향상 시킬 수 있는 보다 기능 더 견고 하 게 수 있는 공개 모집, 둘 다 최적화 실험을 분리 표현 시스템에 도입 되었다22,23출력.
여러 가지 검색 방법은 분리 시스템에서 수용 체 활성화를 계량에 사용 되었습니다. 은닉 placental 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (SEAP) 분석 결과 또는 활성화를 평가 하기 위한 매력적인 옵션을 기자 효소 transcriptionally 캠프 응답 요소 (CREs)에 의해 규제로 작동 합니다. 형광은 SEAP 검출 시 약24를 가진 외피 후 문화 매체의 샘플에서 쉽게 감지 된다. 이 메서드를 사용 하 여 아민 관련 수용 체 (TAARs) 되어 OE는 추적 표현 chemosensory 수용 체의 보조 클래스 ORs의 기능25,,2627특징. 또 다른 일반적인 방법은, luciferase 분석 결과, 야영지 응답 성분 (CRE)의 제어에서 반딧불 luciferase 취재 원 유전자를 사용합니다. Luciferase 생산에 의해 생성 된 발광 측정 또는 활성화10,,1128측정의 효율적이 고 강력한 수단을 제공 합니다.
실시간 캠프 분석은 또한 널리 사용 되었습니다 분리 또는 생 GPCRs의 함수를 동적으로 모니터링. 이러한 고급 분석 실험의 한 예로 유전자 인코딩된 바이오 센서 변종, 돌연변이 형태의 luciferase 융합 캠프 바인딩 도메인을 보유 하 고 활용 합니다. 캠프 묶을 때 구조적 변화 luciferase, 있는 발광 다음 화학 리더29,30으로 측정 될 수 있다의 활성화에 지도 한다. 실시간 캠프 기술 드 HEK293 NxG 108CC15 세포에 인간의 odorant 수용 체의 분리에 적합 보고 되었습니다.엉덩이 = "외부 참조" > 31,,3233, 뿐만 아니라 HEK293T에서 파생 된 Hana3A34,35세포로. 또한 Krautwurst 그룹 양방향 대규모 또는 검사 방법32,33에 적합 하도록 실시간 캠프 기술을 자세히 설명 합니다.
여기는 Hana3A 세포에서 실시간 캠프 분석 결과 사용 하 여 또는 활성화를 측정 하기 위한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜에서 미리 equilibrated 라이브 셀의 발광 운동 측정 30 분 다음 특정 휘발성 화합물과 치료, 보다 효율적이 고 정확한 분석에 덜 취약 또는 활성화의 대표 연장 시간과 냄새 유발 세포 독성 세포 환경에서 발생 하는 아티팩트 이 실시간 측정 ORs의 ligands, 대규모 심사로 관심의 특정 또는 ligand 쌍의 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리가 성공적으로 OR5AN1로 식별 사향 복합 muscone에 대 한 수용 체 379 인간의 ORs에 대 한 심사를 수행 하 고 이후에 긍정적인 심사 결과 확인 하 여.

<table width="1240">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:405px;height:25px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">GloSensor cAMP reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">pGloSensor-20F cAMP plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hana3A cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available from authors upon request</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HBSS, w/o calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14175095</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HEPES</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30237</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lipofectamine2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">M3R plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cloned into a mammalian expression vector such as pCI</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MEM, w/EBSS and w/L-glutamine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Muscone</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-200528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Musk tibetene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S359165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">OR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PBS, w/o calcium or magnesium</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>DP103-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RTP1S plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cloned into a mammalian expression vector such as pCI</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.2-mL PCR tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1.5-mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">15-mL 17 mm x 120 mm conical tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">8-well and/or 12-well multichannel pipetman</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">96-well flat-bottomed white cell culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">100 mm x 20 mm cell culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Class II biological safety cabinet with laminar flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell culture incubator, w/ 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Infinite F200 plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sterile paper towel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell measurement of odorant receptor activation using a real-time camp assay

포유류 odorant 수용 체 (OR) 가족의 거 대 한 크기는 수많은 휘발성 화학 물질 가운데 그들의 동족 ligands를 찾는 데 어려움을 제시. 효율적이 고 정확 하 게 ORs deorphanize, 우리 표현 포유류 ORs와 유전자 변형된 바이오 센서 플라스 미드 실시간으로 또는 활성화의 하류 캠프 생산을 측정 하는 분리 셀 라인의 사용을 결합. 이 분석 결과 ORs와 반대로화면 odorants을 사용할 수 있습니다. 화면에서 긍정적인 odorant 수용 체 상호 작용 이후에 다양 한 악취 농도, 농도-응답 곡선을 생성에 대 한 테스트 하 여 확인할 수 있습니다. 여기 우리는 인간 또는 라이브러리 Hana3A 세포에 표현 하 고 긍정적으로 반응 하는 수용 체의 화합물에 대 한 동족 수용 체 확인 향기로운 화합물의 높은 처리량 검열을 수행 하기 위해이 방법을 사용. 우리 효율적이 고 또는 활성화 평가에 신뢰할 수 있는 것이 높은 처리량 탐지 방법을 발견 하 고 우리의 데이터 또는 기능 연구에 그것의 잠재적인 사용의 예를 제공.

Muscone 천연 사향에서 주요 향기로운 구성 요소입니다. 최근은 muscone 및 마우스 또는, MOR215-1, 쥐37,38행동에 muscone 응답 glomeruli에서 복제에 상 동에 따라 다른 macrocyclic 사향 화합물에 대 한 인간의 수용 체로 확인 된 OR5AN1을 공부 한다. 또한 인간 또는 레 퍼 토리, 우리의 그룹 및 Touhara 그룹을 심사 하 여 OR5AN1 2 macrocyclic 사향 화합물...

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay at JoVE.com

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Odorant 수용 체의 기능을 특성화 deorphanization 과정에서 필수적인 부분을 제공 합니다. 우리 캠프 분석 결과 사용 하 여 실시간으로에서 odorant 수용 체의 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다.

라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

연구

신경과학

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Neuroscientific 연구 및 실시간 기능성 두피 매핑을위한 인적 Electrocorticographic (ECoG) 신호를 녹음하기

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

루시 페라 제 활동을 통해 수용체 활성화의 측정 : 포유류의 후각 수용체의 높은 처리량 분석

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

실시간 전기 생리학 : 프로브 신경 역학과 저쪽​​에 폐쇄 루프 프로토콜을 사용하여

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

관리의 실시간 fMRI Neurofeedback 훈련에 대 한 프로토콜

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 실시간으로 핵 세포질 수송을 측정하는 분석

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

RNA에 의한 Locust Antenna 내의 악취 수용체 유전자의 국산화<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

SwarmSight: 곤충 안테나와 일반적인 준비와 기존 하드웨어를 사용 하 여 코 확장 반사의 실시간 추적

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

AMPA 모니터링을 위한 하이 콘텐츠 분석 결과 수용 체 매매

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...