Name: live-cell measurement of odorant receptor activation using a real-time camp assay
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay at JoVE.com

O trabalho foi apoiado pelo chinês National Science Foundation (31070972), ciência e tecnologia Comissão de Xangai município (16ZR1418300), o programa para a inovadora pesquisa equipe de Shanghai Municipal Comissão de educação, o Shanghai Oriental Programa acadêmico (J50201) e o programa nacional de pesquisa básica da China (2012CB910401).

1. Culturing e manutenção de células Hana3A <ol><li>manter as células em 10 mL de meio essencial mínimo (MEM) com 10% soro bovino fetal (FBS), 100 µ g/mL penicilina-estreptomicina e 1,25 µ g/mL anfotericina B em um 100-mm placa de cultura de células em uma incubadora de cultura de célula de 37 ° C com 5% de CO 2. Com cada outra passagem, adicionar 1 puromicina µ g/mL para manter estável transfection de plasmídeos (ver introdução). 
	Nota: Executar todas as etapas que env...

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	<li>Malakoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+the+scent+of+avian+olfaction.">Following the scent of avian olfaction.</a> Science. 286 (5440), 704-705 (1999).</li><li>Zippel, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+of+vertebrate+olfaction:+D.M.+Stoddart.+Chapman+and+Hall,+Andover,+Great+Britain,+1980.+£15.00,+234+pp.+ISBN+0-412-21820-8.">The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8.</a> Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).</li><li>Dryer, L., Berghard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptors:+a+plethora+of+G-protein-coupled+receptors.">Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).</li><li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse.">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).</li><li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+human+olfactory+subgenome.">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li><li>Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+the+holy+grail:+establishing+a+molecular+basis+for+Mammalian+olfaction.">After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction.</a> Cell. 116 (2), 329-336 (2004).</li><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors:+a+molecular+basis+for+odor+recognition.">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li><li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+eugenol-responsive+and+muscone-responsive+mouse+odorant+receptors.">In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors.</a> J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).</li><li>Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+mammalian+olfactory+receptors:+measurement+of+receptor+activation+via+luciferase+activity.">High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity.</a> J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).</li><li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire.">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+activated+olfactory+neurons+identifies+odorant+receptors+for+odors+in+vivo.">Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).</li><li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+receptor+codes+for+odors.">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li><li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons.">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li><li>Kajiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+bases+of+odor+discrimination:+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants.">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li><li>von der Weid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transcriptional+profiling+of+chemosensory+neurons+identifies+receptor-ligand+pairs+in+vivo.">Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).</li><li>D'Hulst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MouSensor:+A+Versatile+Genetic+Platform+to+Create+Super+Sniffer+Mice+for+Studying+Human+Odor+Coding.">MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding.</a> Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).</li><li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+retention,+degradation,+and+aggregation+of+olfactory+G-protein+coupled+receptors.">Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li><li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors.">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).</li><li>Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ligands+for+olfactory+receptors+by+functional+expression+of+a+receptor+library.">Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library.</a> Cell. 95 (7), 917-926 (1998).</li><li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors.">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors.">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li><li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling.">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).</li><li>Durocher, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+gene+assay+for+high-throughput+screening+of+G-protein-coupled+receptors+stably+or+transiently+expressed+in+HEK293+EBNA+cells+grown+in+suspension+culture.">A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture.</a> Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).</li><li>Liberles, S. D., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+class+of+chemosensory+receptors+in+the+olfactory+epithelium.">A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium.</a> Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).</li><li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+effects+of+odorants+on+mouse+behavior.">Combinatorial effects of odorants on mouse behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).</li><li>Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+analysis+of+odor+coding+in+the+olfactory+epithelium.">A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium.</a> J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells.">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li><li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase.">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).</li><li>Fan, B. F., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Luminescent+Assays+for+GPCR+Studies:+Combination+of+Sensitive+Detection+and+Real-Time+Analysis+Expands+Applications.">Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications.</a> Genetic Engineering &amp; Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).</li><li>Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Butter+Aroma+Recombinate+Activates+Human+Class-I+Odorant+Receptors.">A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors.</a> J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).</li><li>Noe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OR2M3:+A+Highly+Specific+and+Narrowly+Tuned+Human+Odorant+Receptor+for+the+Sensitive+Detection+of+Onion+Key+Food+Odorant+3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol.">OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol.</a> Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).</li><li>Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+broadly+tuned+odorant+receptor+OR1A1+is+highly+selective+for+3-methyl-2,4-nonanedione,+a+key+food+odorant+in+aged+wines,+tea,+and+other+foods.">The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods.</a> Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+copper+in+detection+of+metal-coordinating+odorants.">Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smelling+Sulfur:+Copper+and+Silver+Regulate+the+Response+of+Human+Odorant+Receptor+OR2T11+to+Low-Molecular-Weight+Thiols.">Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols.</a> J Am Chem Soc. , (2016).</li><li>Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-transporting+protein+1+short+(RTP1S)+mediates+translocation+and+activation+of+odorant+receptors+by+acting+through+multiple+steps.">Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps.</a> J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).</li><li>Shirasu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+receptor+and+neural+pathway+responsible+for+highly+selective+sensing+of+musk+odors.">Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors.</a> Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).</li><li>Block, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implausibility+of+the+vibrational+theory+of+olfaction.">Implausibility of the vibrational theory of olfaction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).</li><li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors:+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection.">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li><li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction.">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).</li><li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families.">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li></ol>

Medir com precisão a ativação de um Bo após exposição a um determinado odorant é o primeiro passo para decifrar a codificação da informação olfactiva. Os experimentos mostrado neste estudo representam que um exemplo de como um pode identificar, usando um em vitro sistema de expressão OR, RUP ágil entre o repertório OR humano para o produto químico odoríferos de interesse e posteriormente, caracterizando o receptor Farmacologia, utilizando diferentes concentrações do produto químico. Nossos res...

O sentido do olfato desempenha um papel importante na sobrevivência dos animais, como eles dependem de suas habilidades olfativas para obter alimentos, evitar predadores e perigo, distinguir a espécie e selecione companheiro1,2. A realização dessas funções depende os receptors odorant (SRO), que individualmente são expressos na superfície ciliar dos neurônios sensoriais olfativos (OSNs) localizada no epitélio olfativo (OE). RUP constituem a maior família da superfamília de receptores (GPCR) G-proteína juntamente com aproximadamente 400 e 1200 diversas OR genes em humanos e rato, respectivamente3,4,5. SRO ativado por odorantes leva ao aumento dos níveis intracelular de cAMP através da ativação sequencial de olfativa G-proteína (Golf) e digite adenilato ciclase III (ACIII). O resultante aumento do nível de cAMP intracelular pode funcionar como um segundo mensageiro, que abre o canal do nucleotide-gated na superfície das células, provocando o influxo de cátions incluindo Ca2 + e potenciais de ação e, finalmente, iniciar neuro-potencial transmissão e percepção olfativa. O processo de detectar e discriminar um grande número de odores pelo RUP é considerado como o primeiro passo de percepção olfativa6,7.
Desde que Buck e Axel8 primeiro com êxito clonado odorant receptores e elucidado o mecanismo da percepção olfativa, iniciada pelo RUP, deorphanization da família OR tornou-se um dos hotspots neste campo. Vários métodos in vivo, ex vivo e in vitro , para medir a ativação OR foram relatados9,10,11,12. Um método tradicional usado Ca2 + imagem seguida de célula única RT-PCR na OSNs permitiu a identificação de diferentes RUP para alifáticos odorantes13,14,15. Mais recentemente, o advento das análises em larga escala transcriptome promoveu o desenvolvimento de métodos de alta produtividade na vivo mais. O ensaio de Kentucky identificou ORs eugenol e muscona-responsivo do mouse com o uso do S100a5-tauGFP repórter rato estirpe e microarray análise9. Baseia a diminuição nos níveis de RNAm OR após exposição odorante, a tecnologia de sonho empregou uma abordagem transcriptomic para determinar perfis de ativação OR em ambas as espécies de vertebrados e non-vertebrado16. Da mesma forma, dada a fosforilação de S6 em ativações neuronais, o Matsunami grupo sequenciados mRNAs de moleculas de Ribossoma fosforilada para identificar responsivo ORs12. Finalmente, o grupo de Feinstein relatou ratos super cheirador que poderiam servir como uma plataforma para estudar o odor de codificação na vivo, conhecido como o de tecnologia de MouSensor17.
No Reino em vitro , o desafio de cultivo OSNs faz um sistema de expressão heteróloga que imita OR expressão funcional na vivo uma solução ideal para realizar a triagem em larga escala de produtos químicos odoríferos para RUP. No entanto, desde linhas de células cultivadas de origens não-olfactory diferem OSNs nativas ou proteínas são retidas no retículo endoplasmático e incapaz de tráfego para a membrana plasmática, resultando em OR degradação e perda da função de receptor18 , 19. para resolver este problema, foram feitas obras extensas para replicar a expressão funcional de OR na membrana celular em linhagens celulares heteróloga. Krautwurst et al primeiro anexados os 20 primeiros aminoácidos da rodopsina (Rho-marca) do N-terminal da proteína OR e isto promoveu a expressão da pilha-superfície de alguns ORs em células de rim humano embrionário (HEK)20. Realizando uma análise serial de análise de biblioteca de expressão (SAGE) gene do único OSNs, Saito et al. primeiro clonado do receptor-transportando proteínas (RTP) os membros da família, RTP1 e RTP2 e a proteína de potenciador de expressão do receptor 1 (REEP1) que facilitou OR tráfico para a membrana celular e aprimorado mediada por odorant respostas das RUP em células HEK293T 21. com base nesses resultados, o grupo Matsunami estabelecida com êxito a linha de celular Hana3A, estàvel transfected com RTP1, RTP2, REEP1 e Gαolf em HEK293T e transitoriamente transfected com RUP Rho-tag, para eficiente ou funcional expressão. Posteriores estudos revelaram 1) um formulário mais curto da RTP1, RTP1S, que poderia promover mais robustamente ou função do que o original proteína RTP1 e 2) o receptor de acetilcolina muscarínicos tipo 3 (M3R) que pode aumentar a atividade de OR através da inibição da β-arrestin-2 recrutamento, ambos os quais foram introduzidos no sistema de expressão heteróloga para otimizar experimental de saída22,23.
Vários métodos de deteção têm sido utilizados para quantificar a ativação do receptor em sistemas heterólogos. O ensaio da fosfatase alcalina placentária secretado (SEAP) trabalha com uma enzima reveladora transcriptionally regulamentada por elementos de resposta acampamento (CREs), tornando-se uma opção atraente para avaliar a ativação OR. A fluorescência é facilmente detectada em uma amostra de meio de cultura após a incubação com SEAP deteção reagente24. Usando este método, as funções das regiões ultraperiféricas, bem como uma classe secundária dos receptores chemosensory, expressado no OE, o rastreamento associado da amina receptores (TAARs) tem sido caracterizam25,26,27. Um outro método comum, o ensaio de luciferase, usa um gene de repórter de luciferase de vaga-lume sob o controle do elemento de resposta acampamento (CRE). Medição da luminescência gerada pela produção de luciferase oferece um meio eficiente e robusto de quantificar OR ativação10,11,28.
Ensaios de campo em tempo real também têm sido amplamente utilizados na monitoração dinamicamente a função de GPCRs heterólogos ou endógenas. Um exemplo desses ensaios avançados aproveita-se de uma variante geneticamente codificado biosensor, que possui um domínio de ligação de acampamento fundido a uma forma mutante de luciferase. Quando vincula de acampamento, a mudança conformacional leva à ativação de luciferase, luminescência, que então pode ser medida com um leitor de quimioluminescência29,30. A tecnologia de campo em tempo real tem sido relatada apropriado para o de orfandade de odorante humana receptores nas células de 108CC15 HEK293 e NxGbunda = "xref" > 31,32,33, como bem como o Hana3A HEK293T-derivado de células34,35. O grupo de Krautwurst também descrito em detalhes a tecnologia de campo em tempo real para ser apropriado para abordagens em grande escala ou triagem de bi-direcional de32,33.
Aqui descrevemos um protocolo para medir a ativação OR usando um ensaio de campo em tempo real em células Hana3A. Neste protocolo, a luminescência de células vivas pre-equilibradas cineticamente é medida por 30 min após o tratamento com compostos voláteis específicos, o que representa uma análise mais eficiente e precisa de ativação OR que são menos suscetíveis a artefatos que ocorrem no ambiente celular com tempo prolongado e toxicidades celular induzida pelo odor. Esta medição em tempo real permite uma triagem em larga escala do RUP e ligantes, bem como a caracterização de pares específicos de OR-ligante de interesse. Usando esse método, com sucesso identificamos OR5AN1 como receptor para a muscona composto de almíscar executando um rastreio contra 379 ORs humanos e posteriormente confirmando o resultado da seleção positiva.

<table width="1240">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:405px;height:25px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">GloSensor cAMP reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">pGloSensor-20F cAMP plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hana3A cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available from authors upon request</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HBSS, w/o calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14175095</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HEPES</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30237</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lipofectamine2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">M3R plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cloned into a mammalian expression vector such as pCI</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MEM, w/EBSS and w/L-glutamine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Muscone</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-200528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Musk tibetene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S359165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">OR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PBS, w/o calcium or magnesium</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>DP103-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RTP1S plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cloned into a mammalian expression vector such as pCI</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.2-mL PCR tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1.5-mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">15-mL 17 mm x 120 mm conical tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">8-well and/or 12-well multichannel pipetman</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">96-well flat-bottomed white cell culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">100 mm x 20 mm cell culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Class II biological safety cabinet with laminar flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell culture incubator, w/ 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Infinite F200 plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sterile paper towel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell measurement of odorant receptor activation using a real-time camp assay

Os tamanhos enormes das famílias do receptor (OR) odorant mamíferos apresentam dificuldades para encontrar seus cognatos ligantes entre numerosos produtos químicos voláteis. Para eficiência e precisão deorphanize ORs, podemos combinar o uso de uma linha de celular heteróloga para expressar ORs mamíferos e um plasmídeo geneticamente modificado biosensor para medir a produção de acampamento a jusante de ativação OR em tempo real. Este ensaio pode ser usado para tela odorantes contra ORs e vice-versa. Interações de odorante-receptor positivo das telas podem ser posteriormente confirmadas por teste em relação a várias concentrações de odor, gerando curvas concentração-resposta. Aqui nós usamos este método para executar um rastreio do elevado-throughput de um composto odoríferos contra uma biblioteca de OR humano expressos nas células Hana3A e confirmou que o receptor está respondendo positivamente é o receptor cognato para o composto de interesse. Encontramos este método de deteção de alta produtividade para ser eficiente e confiável na avaliação da ativação OR e nossos dados fornecem um exemplo de seu uso potencial em estudos funcionais de OR.

Muscona é o principal componente aromático de almíscar natural. Recentes estudos de OR5AN1 identificado como um receptor humano para muscona e outros compostos de almíscar macrociclos com base na homologia com o mouse ou, MOR215-1, clonado de glomérulos muscona-responsivos em comportar-se de ratos37,38. Selecionando o repertório OR humano, nosso grupo e o grupo de Touhara também identificado OR5AN1 como um grande receptor p...

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Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Caracterizando a função dos receptores de odorante serve uma parte indispensável do processo de deorphanization. Nós descrevemos um método para medir a ativação dos receptores odorant em tempo real, usando um ensaio de campo.

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Neurociência

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Gravação Humanos eletrocorticográfica (ECOG) Sinais para pesquisa neurocientífica e mapeamento em tempo real Funcional Cortical

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

De alta capacidade de análise de mamíferos olfativas Receptores: Medição do Receptor de ativação via luciferase Atividade

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Eletrofisiologia em tempo real: Usando protocolos de circuito fechado para sondar Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Um protocolo para a administração do real-time fMRI treinamento de Neurofeedback

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Ensaio para Medir o Transporte Nucleocitoplasmático em Tempo Real dentro de Células NSC-34 do tipo Motor-Neuron

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localização de Genes de Receptor de Odorantes em Antenas de Locustídeo por RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridação

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

SwarmSight: Acompanhamento em tempo real dos movimentos de antena do inseto e reflexo de extensão Proboscis usando uma preparação comum e Hardware convencional

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Um ensaio de alto teor para monitoramento Leandro tráfico de Receptor

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...