Name: live-cell measurement of odorant receptor activation using a real-time camp assay
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay at JoVE.com

El trabajo fue apoyado por la Fundación de ciencia nacional chino (31070972), ciencia y tecnología Comisión de Shangai municipio (16ZR1418300), el programa para innovadores investigación equipo de Shanghai Municipal Comisión de educación, el Shanghai oriental Programa (J50201) y el programa de investigación básica Nacional de China (2012CB910401).

1. cultivo y mantenimiento de las células Hana3A <ol><li>mantener las células en 10 mL de medio mínimo esencial (MEM) con 10% suero fetal bovino (FBS), 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina y 1,25 μg/mL anfotericina B en un 100 mm placa de cultivo de células en una incubadora de cultivo celular de 37 ° C con 5% CO 2. Con cada otro paso, añadir 1 puromicina μg/mL para mantener estable de la transfección de plásmidos (véase Introducción). 
	Nota: Realice todos los pasos que...

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Medir con precisión la activación de un OR con la exposición a un determinado odorante es el primer paso para descifrar la codificación de la información olfativa. Los experimentos se muestra en esta representan estudio que un ejemplo de cómo se puede identificar, mediante una en vitro sistema de expresión OR, or sensible entre el repertorio humano de OR para el olor químico de interés y posteriormente caracterizar el receptor Farmacología utilizando diferentes concentraciones de la sustancia. Nuestros...

El sentido del olfato desempeña un papel importante en la supervivencia de animales como ellos confían en sus capacidades olfativas para obtener comida, evitar depredadores y peligros, especies y seleccionar mate1,2. La realización de estas funciones depende de los receptores de olor (RUP), que se expresan individualmente en la superficie ciliar de las neuronas sensoriales olfativas (OSNs) localizada en el epitelio olfatorio (OE). ORs constituyen la mayor familia de la superfamilia de receptores (GPCR) de la proteína G acoplada con aproximadamente 400 y 1200 diversos OR genes en humanos y ratón, respectivamente3,4,5. ORs activados por olores conducen al aumento de los niveles intracelular de cAMP a través de la activación secuencial de proteína olfatoria de G (Golf) y tipo cyclase del adenylyl III (ACIII). El mayor nivel de cAMP intracelular resultante podría funcionar como un segundo mensajero, que se abre el canal nucleotide-bloqueado en la superficie de la célula, provocando afluencia de cationes como Ca2 + y los potenciales de acción y en última instancia iniciando potencial de neuro transmisión y percepción olfativa. El proceso de detectar y discriminar una gran cantidad de olores por ORs es considerado como el primer paso de percepción olfativa6,7.
Puesto que Buck y Axel8 primero con éxito había reproducido receptores odorantes y dilucidado el mecanismo de la percepción olfativa iniciada por ORs, deorphanization de la familia de OR se convirtió en uno de los hotspots en este campo. Varios métodos in vivo, ex vivo y en vitro para medir la activación OR han sido reportados9,10,11,12. Un método tradicional que utiliza Ca2 + proyección de imagen de seguido por RT-PCR unicelular en OSNs permitió la identificación de diferentes SRO a aceites alifáticos13,14,15. Más recientemente, el advenimiento de los análisis del transcriptoma a gran escala promueve el desarrollo de métodos de alto rendimiento en vivo más. El ensayo de Kentucky había identificado ORs de eugenol y muscone-sensible al ratón con el uso de la S100a5-tauGFP reportero ratón cepa y microarrays análisis9. Basado en la disminución de los niveles de mRNA de OR después de la exposición de olor, la tecnología de sueño emplea un enfoque transcriptómicos para determinar perfiles de activación OR en ambas especies de vertebrados y no vertebrados16. Asimismo, habida cuenta de la fosforilación de S6 en activaciones neuronales, la señorita grupo secuenciado mRNAs de immunoprecipitations ribosoma fosforilada para identificar capacidad de respuesta de ORs12. Por último, el grupo de Feinstein informó ratones estupendo sniffer que podrían servir como una plataforma para estudiar olor codificación en vivo, conocido como la tecnología de MouSensor17.
En el Reino de vitro , el reto de cultivo OSNs hace un sistema de expresión heteróloga que imita OR expresión funcional en vivo una solución ideal para la investigación a gran escala de los productos químicos para ORs. Sin embargo, puesto que las líneas de cultivo de células de origen no olfativa difieren OSNs nativos, o proteínas son retenidas en el retículo endoplasmático e incapaz de tráfico a la membrana plasmática, dando por resultado OR degradación y pérdida de función del receptor18 , 19. para resolver este problema, se han realizado trabajos extensos para replicar expresión funcional OR sobre la membrana celular en células heterólogas. Krautwurst et al. primero atribuye los 20 primeros aminoácidos de la rodopsina (Rho-etiqueta) a la N-terminal de la proteína de OR y esto promovió la expresión de superficie de la célula de algunos ORs en células de riñón embrionario humano (HEK)20. Mediante la realización de un análisis de serie de análisis del gene expresión (SAGE) Biblioteca de solo OSNs, Saito et al. clonó por primera vez el transporte del receptor proteína (RTP) miembros de la familia, RTP1 y RTP2 y la proteína del receptor de expresión potenciador 1 (REEP1) que facilitó el tráfico de OR a la membrana celular y mejorada respuestas mediadas por el olor de las RUP en las células HEK293T 21. basándose en estos hallazgos, el grupo de la señorita establecido con éxito la línea celular de Hana3A estable transfected con RTP1, RTP2, REEP1 y Gαolf en HEK293T y transitorio transfected con ORs tagged Rho, eficiente o funcional expresión. Posteriores estudios revelaron 1) una forma más corta de RTP1, RTP1S, que podrían promover más robusta o función de la proteína original de RTP1 y 2) el receptor muscarínico de tipo 3 (M3R) que podría mejorar la actividad OR vía inhibición de la β-arrestin-2 contratación, los cuales fueron introducidos en el sistema de expresión heteróloga para optimizar experimental salida22,23.
Varios métodos de detección se han utilizado para cuantificar la activación del receptor en sistemas heterólogos. El ensayo de la fosfatasa alcalina placentaria secretada (SEAP) trabaja con una enzima reporter reglamentada transcripcionalmente por elementos de la respuesta de campo (CREs), convirtiéndolo en una opción atractiva para evaluar la activación de la OR. La fluorescencia se detecta fácilmente en una muestra de medio de cultivo después de la incubación con SEAP detección reactivo24. Usando este método, las funciones de RUP como una clase secundaria de receptores chemosensory en el OE-el rastro receptores asociados a aminas (Edmonton) han sido caracterizan25,26,27. Otro método común, el ensayo de luciferasa, utiliza un gen de reportero de luciferasa de luciérnaga bajo el control del elemento de respuesta cAMP (CRE). Luminiscencia generada por la producción de luciferase de medición proporciona un medio eficiente y robusto de cuantificación OR activación10,11,28.
Ensayos de campo en tiempo real también han sido ampliamente utilizados en el seguimiento dinámicamente la función de los GPCRs heterólogas o endógenas. Un ejemplo de tales ensayos avanzados aprovecha una variante genéticamente codificados biosensor, que posee un dominio de unión a campo fusionado a la forma mutante de la luciferasa. Cuando el campo se une, el cambio conformacional conduce a la activación de la luciferasa, luminiscencia que puede medirse entonces con un lector de la quimioluminescencia29,30. La tecnología de campo en tiempo real ha informado conveniente para la orfandad de los receptores de olor humano en las células HEK293 y NxG de 108CC15culo = "xref" &gt; 31,32,33, como así como en la Hana3A HEK293T derivado células34,35. El grupo Krautwurst también describe en detalle la tecnología de campo en tiempo real para ser conveniente para enfoques a gran escala o detección bidireccional32,33.
Aquí se describe un protocolo para medir la activación OR usando un análisis de campo en tiempo real en células Hana3A. En el presente Protocolo, la luminiscencia de células vivas previamente equilibradas se mide cinéticamente por 30 min después del tratamiento con compuestos volátiles específicos, que representan un análisis más eficiente y preciso de la activación de OR que son menos susceptibles a artefactos que se producen en el entorno celular con tiempo prolongado y toxicidad celular inducida por el olor. Esta medida en tiempo real permite una proyección a gran escala de SRO y ligandos, así como caracterización de pares OR-ligando específicos de interés. Usando este método, con éxito identificamos OR5AN1 como receptor para el muscone compuesto de almizcle realizando una proyección contra 379 ORs humanas y posteriormente confirmar el resultado de la investigación positiva.

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	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:405px;height:25px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">GloSensor cAMP reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">pGloSensor-20F cAMP plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hana3A cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available from authors upon request</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HBSS, w/o calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14175095</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HEPES</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30237</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lipofectamine2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">M3R plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cloned into a mammalian expression vector such as pCI</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MEM, w/EBSS and w/L-glutamine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Muscone</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-200528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Musk tibetene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S359165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">OR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PBS, w/o calcium or magnesium</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>DP103-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RTP1S plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cloned into a mammalian expression vector such as pCI</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.2-mL PCR tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1.5-mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">15-mL 17 mm x 120 mm conical tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">8-well and/or 12-well multichannel pipetman</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">96-well flat-bottomed white cell culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">100 mm x 20 mm cell culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Class II biological safety cabinet with laminar flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell culture incubator, w/ 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Infinite F200 plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sterile paper towel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell measurement of odorant receptor activation using a real-time camp assay

El enorme tamaño de las familias de mamíferos odorante del receptor (o) presenta dificultades para encontrar sus ligandos afines entre los numerosos productos químicos volátiles. Para eficientemente y exactamente deorphanize ORs, combinamos el uso de una línea de células heterólogas ORs mamíferos y un plásmido biosensor genéticamente modificados para medir campo producción aguas abajo de la activación de la OR en tiempo real. Este ensayo puede utilizarse para olores de pantalla contra ORs y viceversa. Las interacciones de los receptores odorantes de las pantallas pueden confirmarse posteriormente por pruebas contra diferentes concentraciones de olor, generación de curvas de concentración-respuesta positiva. Aquí hemos utilizado este método para realizar una proyección de alto rendimiento de un compuesto oloroso contra una biblioteca OR humano expresado en las células Hana3A y confirmó que el receptor responder positivamente es el receptor cognado para el compuesto de interés. Encontramos este método de detección de alto rendimiento eficiente y confiable en la evaluación de la activación de la OR y nuestros datos proporcionan un ejemplo de su uso potencial en estudios funcionales OR.

Muscone es el principal componente aromático de almizcle natural. Recientes estudios OR5AN1 identificados como un receptor humano para el muscone y otros compuestos macrocíclicos de almizcle basadas en homología con el ratón o, MOR215-1, reproducido de glomérulos muscone-responsivo en comportarse ratones37,38. Por proyección el repertorio humano de OR, nuestro grupo y el grupo Touhara también identificado OR5AN1 como un rec...

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Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Caracterizar la función de receptores odorantes sirve una parte indispensable en el proceso de deorphanization. Se describe un método para medir la activación de receptores odorantes en tiempo real utilizando un ensayo de campo.

Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Investigación

Neurociencias

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Grabación electrocorticográfica Humanos (ECoG) Las señales de la investigación neurocientífica y en tiempo real el mapeo cortical funcional

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Análisis de alto rendimiento de los mamíferos receptores olfativos: Medición de la activación del receptor a través de actividad luciferasa

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

En tiempo real Electrofisiología: Usando protocolos de bucle cerrado para sondear neuronales Dinámica y allá

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

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Un protocolo para la administración de Real-Time fMRI entrenamiento de Neurofeedback

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Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Ensayo para medir el transporte nucleocitoplasmático en tiempo real dentro de las células NSC-34 similares a neuronas motoras

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Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localización de Genes Receptor Odorante en Antenas Locustinas por RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación

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