Name: live-cell measurement of odorant receptor activation using a real-time camp assay
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay at JoVE.com

Çalışma Çin Ulusal Bilim Vakfı (31070972), bilim ve teknoloji Komisyonu, Shanghai Belediyesi (16ZR1418300), yenilikçi araştırma ekibi Şangay Belediye Eğitim Komisyonu, Shanghai Doğu için Program tarafından desteklenmiştir Akademik Program (J50201) ve Çin (2012CB910401) ulusal temel araştırma programı.

1. Culturing ve Hana3A hücreleri bakım <ol><li>10 mL % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 ile minimum temel orta (MEM) hücrelerde koru µg/mL penisilin-streptomisin ve 1,25 µg/mL Amfoterisin B 100 mm hücre kültür çanak 37 ° C hücre kültür kuluçka %5 CO 2. Her diğer geçişiyle plazmid (bkz: giriş) istikrarlı transfection korumak için 1 µg/mL puromisindir eklemek. 
	Not: steril ortam sağlamak için bir sınıf II biyolojik Emanet dolabı hücre kültüründe içeren t...

<ol>
	<li>Malakoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+the+scent+of+avian+olfaction.">Following the scent of avian olfaction.</a> Science. 286 (5440), 704-705 (1999).</li><li>Zippel, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecology+of+vertebrate+olfaction:+D.M.+Stoddart.+Chapman+and+Hall,+Andover,+Great+Britain,+1980.+£15.00,+234+pp.+ISBN+0-412-21820-8.">The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8.</a> Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).</li><li>Dryer, L., Berghard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptors:+a+plethora+of+G-protein-coupled+receptors.">Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).</li><li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse.">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).</li><li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+human+olfactory+subgenome.">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li><li>Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+the+holy+grail:+establishing+a+molecular+basis+for+Mammalian+olfaction.">After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction.</a> Cell. 116 (2), 329-336 (2004).</li><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors:+a+molecular+basis+for+odor+recognition.">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li><li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+eugenol-responsive+and+muscone-responsive+mouse+odorant+receptors.">In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors.</a> J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).</li><li>Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+mammalian+olfactory+receptors:+measurement+of+receptor+activation+via+luciferase+activity.">High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity.</a> J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).</li><li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire.">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+activated+olfactory+neurons+identifies+odorant+receptors+for+odors+in+vivo.">Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).</li><li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+receptor+codes+for+odors.">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li><li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons.">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li><li>Kajiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+bases+of+odor+discrimination:+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants.">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li><li>von der Weid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transcriptional+profiling+of+chemosensory+neurons+identifies+receptor-ligand+pairs+in+vivo.">Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).</li><li>D'Hulst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MouSensor:+A+Versatile+Genetic+Platform+to+Create+Super+Sniffer+Mice+for+Studying+Human+Odor+Coding.">MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding.</a> Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).</li><li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+retention,+degradation,+and+aggregation+of+olfactory+G-protein+coupled+receptors.">Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li><li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors.">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).</li><li>Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ligands+for+olfactory+receptors+by+functional+expression+of+a+receptor+library.">Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library.</a> Cell. 95 (7), 917-926 (1998).</li><li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors.">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors.">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li><li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling.">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).</li><li>Durocher, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+gene+assay+for+high-throughput+screening+of+G-protein-coupled+receptors+stably+or+transiently+expressed+in+HEK293+EBNA+cells+grown+in+suspension+culture.">A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture.</a> Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).</li><li>Liberles, S. D., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+class+of+chemosensory+receptors+in+the+olfactory+epithelium.">A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium.</a> Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).</li><li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+effects+of+odorants+on+mouse+behavior.">Combinatorial effects of odorants on mouse behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).</li><li>Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+analysis+of+odor+coding+in+the+olfactory+epithelium.">A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium.</a> J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells.">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li><li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase.">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).</li><li>Fan, B. F., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Luminescent+Assays+for+GPCR+Studies:+Combination+of+Sensitive+Detection+and+Real-Time+Analysis+Expands+Applications.">Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications.</a> Genetic Engineering &amp; Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).</li><li>Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Butter+Aroma+Recombinate+Activates+Human+Class-I+Odorant+Receptors.">A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors.</a> J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).</li><li>Noe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OR2M3:+A+Highly+Specific+and+Narrowly+Tuned+Human+Odorant+Receptor+for+the+Sensitive+Detection+of+Onion+Key+Food+Odorant+3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol.">OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol.</a> Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).</li><li>Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+broadly+tuned+odorant+receptor+OR1A1+is+highly+selective+for+3-methyl-2,4-nonanedione,+a+key+food+odorant+in+aged+wines,+tea,+and+other+foods.">The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods.</a> Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+copper+in+detection+of+metal-coordinating+odorants.">Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smelling+Sulfur:+Copper+and+Silver+Regulate+the+Response+of+Human+Odorant+Receptor+OR2T11+to+Low-Molecular-Weight+Thiols.">Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols.</a> J Am Chem Soc. , (2016).</li><li>Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-transporting+protein+1+short+(RTP1S)+mediates+translocation+and+activation+of+odorant+receptors+by+acting+through+multiple+steps.">Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps.</a> J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).</li><li>Shirasu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+receptor+and+neural+pathway+responsible+for+highly+selective+sensing+of+musk+odors.">Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors.</a> Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).</li><li>Block, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implausibility+of+the+vibrational+theory+of+olfaction.">Implausibility of the vibrational theory of olfaction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).</li><li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors:+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection.">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li><li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction.">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).</li><li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families.">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li></ol>

AMELİYATHANEYİ'ın etkinleştirme maruz bir belirli propil için üzerine doğru ölçme koku bilgi kodlama deşifre ilk adımdır. Deneyler nasıl bir örneği, bir vitro kullanarak tanımlayabilirsiniz bu çalışma temsil OR ifade sistem, duyarlı ORs uygun faiz ve daha sonra reseptör karakterize kokulu gelir insan OR repertuar arasında gösterilen çeşitli kimyasal konsantrasyonları kullanarak Farmakoloji. Bizim sonuçları OR5AN1 muscone için bir bona fide reseptör olarak onaylamak. Bu bir ...

Onlar yiyecek elde kaçının saldırganlar ve tehlike tür ayırt etmek ve dostum1,2seçin için koku alma yeteneklerini üzerinde itimat gibi koku alma duygusu hayvanların hayatta önemli bir rol oynar. Bu işlevlerin gerçekleşme tek tek koku epitel (OE) bulunan silier yüzeyi koku duyusal nöronların (OSNs) ifade edilir propil reseptörleri (ORs), bağlıdır. ORs en büyük ailesi G-protein birleştiğinde reseptör (GPCR) süper yaklaşık 400 ve 1200 farklı OR genleri olan insan ve fare, sırasıyla3,4,5oluşturmaktadır. Odorants tarafından aktive ORs koku G-protein (Golf) sıralı harekete geçirmek yolu ile hücre içi kamp düzeyinin için kurşun ve III gozlemler cyclase (ACIII) yazın. Hücre içi kampı ortaya çıkan artan düzeyde Ca2 + ve aksiyon potansiyelleri de dahil olmak üzere ve sonuçta ilk adım katyonlar akını tetikleme hücre yüzeyinde nükleotit Geçitli kanal açan ikinci habercisi olarak, işlev olabilir Nöro-potansiyel iletim ve koku algı. Saptama ve çok sayıda odorants ORs tarafından ayrımcılık işlemi koku algı6,7ilk adımı olarak kabul edilir.
Buck ve Axel8 ilk başarıyla propil reseptörleri klonlanmış ve ORs tarafından başlatılan koku algı mekanizmasının aydınlatılmamıştır beri deorphanization OR ailesinin bu alandaki hotspots biri haline geldi. OR harekete geçirmek ölçmek için çeşitli içinde vivo, ex vivo ve in vitro yöntemleri bildirilen9,10,11,12olmuştur. Ca2 + görüntüleme tek hücreli RT-PCR tarafından OSNs üzerinde takip kullanılan geleneksel bir yöntem Alifatik odorants13,14,15farklı ORs tanımlaması etkin. Daha yakın zamanlarda, büyük ölçekli transcriptome analizleri gelişiyle daha yüksek üretilen iş in vivo yöntemler geliştirme teşvik. Kentucky tahlil eugenol ve muscone duyarlı fare ORs S100a5-tauGFP muhabir fare zorlanma ve Mikroarray analiz9kullanımı ile tespit edilmiştir. OR mRNA düzeyleri azalma propil maruz kaldıktan sonra dayanarak, rüya teknoloji OR etkinleştirme profilleri her iki tür omurgalı ve omurgalılar16belirlemek için bir transcriptomic yaklaşım istihdam. Benzer şekilde, S6 fosforilasyon nöronal activations içinde göz önüne alındığında, Matsunami grup duyarlı ORs12tanımlamak için fosforile ribozom immunoprecipitations gelen Sıralı mRNA'ların. Son olarak, Feinstein grup içinde vivoMouSensor teknoloji17olarak bilinen, kodlama koku çalışma için bir platform olarak hizmet verebilir süper sniffer fareler bildirdi.
Vitro alanda OSNs kültür meydan OR fonksiyonel ifade içinde vivo taklit eden bir kapaklı ifade sistemi kokulu kimyasallar büyük ölçekli tarama ORs için yapmak için ideal bir çözüm yapar. Yine de, kültürlü hücre hatları sigara koku kökenli yerel OSNs farklı veya proteinler endoplazmik retikulum ve plazma zarı trafik için korunur beri OR bozulması ve reseptör işlevi18 kaybı ile sonuçlanan , 19. bu sorunu çözmek için kapsamlı çalışmalar OR fonksiyonel ifade Contegra hücre hatlarında hücre zarı üzerinde çoğaltmak için yapılmıştır. Krautwurst ve ark. ilk rhodopsin (Rho-etiket) ilk 20 amino asit OR protein N-terminal bağlı. ve bu bazı ORs insan embriyonik böbrek (HEK) hücreleri20hücre yüzeyine ifade yükseldi. Gen ifade (adaçayı) Kütüphane analizi tek OSNs, üzerinden seri bir analiz tarafından Saito ve ark. ilk klonlanmış reseptör taşıma protein (RTP) aile üyeleri, RTP1 ve RTP2 ve OR hücre zarı ticareti kolaylaştırdı ve propil-aracılı yanıtları ORs HEK293T hücrelere Gelişmiş reseptör ifade artırıcı protein 1 (REEP1) 21. bu bulgulara dayanarak, Matsunami grup başarılı Hana3A hücre kültürünü kurdu, stabil RTP1, RTP2, REEP1 ve Gαolf içinde HEK293T ile transfected ve geçici verimli veya fonksiyonel Rho öğesini ORs ile transfected ifade. Sonraki çalışmaları 1) RTP1, RTP1S, daha sağlam teşvik veya işlev özgün RTP1 protein ve β-arrestin-2 inhibisyonu yoluyla OR etkinliği artıran 2) Tip 3 muscarinic asetilkolin reseptörü (M3R) daha kısa biçimi ortaya İşe Alım, ikisi de deneysel optimize etmek için kapaklı ifade sistem kullanılmaya başlanan22,23çıktı.
Birkaç algılama yöntemleri reseptörü harekete geçirmek Contegra sistemlerinde ölçmek için kullanılmaktadır. Salgılanan plasental alkalen fosfataz (SEAP) tahlil OR harekete geçirmek değerlendirmek için çekici bir seçenek yapma transcriptionally kamp yanıt öğeleri (CREs), tarafından düzenlenen bir muhabir enzim ile çalışır. Floresans kolayca SEAP algılama reaktif24ile kuluçka sonra kültür orta bir örneği algılandı. Bu yöntemi kullanarak, ikincil bir sınıf reseptörleri (TAARs) Amin ilişkili olmuştur OE-izlemesinde ifade chemosensory reseptörlerinin yanı sıra ORs fonksiyonları25,26,27ile karakterizedir. Başka bir ortak yöntem, luciferase yöntemi, bir ateş böceği luciferase muhabir gen kamp yanıt öğesi (CRE) kontrolü altında kullanır. Luciferase üretim tarafından üretilen ışıma ölçme OR harekete geçirmek10,11,28miktarının verimli ve güçlü bir araç sağlar.
Gerçek zamanlı kamp deneyleri de dinamik olarak kapaklı veya endojen GPCRs işlev izleme yaygın olarak kullanılmıştır. Bu tür gelişmiş deneyleri bir örnek luciferase mutant bir forma erimiş bir kampı-bağlayıcı etki sahip bir genetik olarak kodlanmış Biyoalgılayıcı değişken yararlanır. Kamp bağlandığında konformasyonal değişim luciferase, ışıma hangi sonra bir Kemiluminesan okuyucu29,30ile ölçülebilir aktivasyonu yol açar. Gerçek zamanlı kamp teknoloji HEK293 ve NxG 108CC15 hücrelerdeki insan propil reseptörlerinin de-orphaning için uygun bildirilmiştireşek "xref" = > olduğu gibi iyi HEK293T elde edilen Hana3A34,35hücreleri gibi 31,32,33,. Krautwurst grup aynı zamanda çift yönlü büyük ölçekli veya eleme yaklaşımlar32,33için uygun olmak için gerçek zamanlı kamp teknoloji ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Burada gerçek zamanlı bir kamp tahlil Hana3A hücrelerde kullanarak OR etkinleştirme ölçmek için bir protokol açıklayın. Bu protokol için önceden dengelenmiş canlı hücreleri ışıldama kinetically belirli uçucu bileşikler ile tedavi takip, üzere OR harekete geçirmek bir daha verimli ve doğru analiz temsil eden 30 dk ölçülür uzun zaman ve koku indüklenen hücre toksisite olan hücresel ortamda ortaya çıkan eserler. Bu gerçek zamanlı ölçüm ORs ve ligandlar büyük ölçekli bir tarama, hem de belirli OR-ligand çiftlere ilgi karakterizasyonu için sağlar. Bu yöntemi kullanarak, biz başarılı bir şekilde OR5AN1 olarak misk bileşik muscone reseptör 379 insan ORs karşı bir tarama gerçekleştirmek ve daha sonra olumlu tarama sonucunu teyit tespit.

<table width="1240">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:405px;height:25px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2942</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">GloSensor cAMP reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">pGloSensor-20F cAMP plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hana3A cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>available from authors upon request</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HBSS, w/o calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14175095</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HEPES</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30237</td>
			<td style="width:623px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Lipofectamine2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">M3R plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cloned into a mammalian expression vector such as pCI</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MEM, w/EBSS and w/L-glutamine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Muscone</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-200528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Musk tibetene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S359165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">OR plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PBS, w/o calcium or magnesium</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>DP103-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RTP1S plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cloned into a mammalian expression vector such as pCI</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.2-mL PCR tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1.5-mL Eppendorf tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">15-mL 17 mm x 120 mm conical tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">8-well and/or 12-well multichannel pipetman</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">96-well flat-bottomed white cell culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">100 mm x 20 mm cell culture dish</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Class II biological safety cabinet with laminar flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell culture incubator, w/ 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Infinite F200 plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sterile paper towel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell measurement of odorant receptor activation using a real-time camp assay

Memeli propil reseptör (OR) aileler büyük boyutları arasında çok sayıda uçucu Kimyasalları soydaş onların ligandlar bulmak için zorluklar. ORs verimli bir şekilde ve doğru bir şekilde deorphanize için memeli ORs ve genetiği değiştirilmiş Biyoalgılayıcı plazmid kamp üretim aşağı OR etkinleştirme gerçek zamanlı olarak ölçmek için ifade etmek için bir kapaklı cep satırının kullanımını birleştirir. Bu tahlil için ekran odorants ORs ve ahlak bozukluğu çok yönlükarşı kullanılabilir. Pozitif propil-reseptör etkileşimleri ekranlar üzerinden daha sonra konsantrasyon-yanıt eğrileri oluşturma çeşitli koku konsantrasyonlarının karşı test ederek teyit edilmesi. Burada Hana3A hücrelerde ifade ve olumlu yanıt reseptör soydaş reseptör için faiz bileşik olduğunu doğruladı insan bir OR Kütüphane karşı kokulu bir bileşik bir yüksek-den geçerek tarama gerçekleştirmek için bu yöntem kullanılır. Verimli ve güvenilir OR harekete geçirmek değerlendirirken bu yüksek üretilen iş algılama yöntem bulduk ve bizim veri OR fonksiyonel çalışmalar potansiyel kullanım için bir örnek sağlar.

Muscone doğal misk üzerinden ana aromatik bileşenidir. Son muscone ve fare veya MOR215-1, fareler37,38davranışlar içinde muscone duyarlı glomeruli üzerinden klonlanmış homoloji dayalı diğer macrocyclic misk bileşikler için insan bir reseptör olarak tanımlanan OR5AN1 çalışmalar. İnsan OR repertuar, bizim grup ve Touhara grup Ayrıca tarama tarafından OR5AN1 olarak iki macrocyclic misk bileşikler, cyclopentadec...

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay at JoVE.com

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Işlev propil reseptörlerinin karakterize vazgeçilmez bir parçası deorphanization süreç içinde hizmet vermektedir. Biz gerçek zamanlı bir kamp tahlil kullanarak propil reseptörleri aktivasyonu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Emme Pipet Tekniği kullanılarak Olfaktör Reseptör Nöronlar Kaydedilmiş odorant bağlı Cevapları

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Nörobilimsel Araştırma ve Gerçek-zamanlı Fonksiyonel Kortikal Haritalama İnsan elektrokortikografik (ECoG) Sinyaller Kayıt

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Lusiferaz aktivitesi ile reseptör aktivasyonunun bir ölçümü: Memeli Koku reseptörünün yüksek throughput Analizi

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Gerçek zamanlı yönetim fMRI psikoterapi eğitimi için bir iletişim kuralı

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Locust Antenlerinde Odorant Reseptör Genlerinin RNA ile Lokalizasyonu<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

SwarmSight: Gerçek zamanlı izleme böcek anten hareketleri ve hortum uzantısı refleks bir ortak hazırlık ve geleneksel donanım kullanarak

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

AMPA izlemek için bir yüksek-içerik tahlil reseptör ticareti

Postsynaptic trafficking of receptors to and from the cell surface is an important mechanism by which neurons modulate their responsiveness to different ...