Name: in vitro bioluminescence assay to characterize circadian rhythm in mammary epithelial cells
Uploaded: 2017-09-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da 2012 società di tossicologia (SOT)-Colgate Palmolive Grant per ricerca alterativa (M. Fang) e la ricerca di collaborazione internazionale fondo da animali e piante quarantena Agenzia, Repubblica di Corea (M. Fang), e concedere il NIEHS P30ES005022 (Zarbl H.). Vorremmo ringraziare il dottor Zheng Chen (McGovern Medical School presso l'Università di Texas Health Science Center a Houston) per la sua discussione utile, Mr. Shao-An Juan per la sua assistenza sperimentale e MS. Kimi Nakata per la prova di lettura.

1. costruzione del PER2 promotore guidato destabilizzato Luciferase Reporter vettore <ol><li>acquistare un oggetto personalizzato pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vettore che contiene il cDNA codificante rLuc e umani Frammento di promotore PER2 (hPER2P, 941 bp) presso il sito tra Sac I e Hind III a clonazione più regione 17.</li>
	<li>Tagliare il frammento di promotore PER2 umano (hPER2P, 941 bp) fuori dal vettore.</str...

<ol>
	<li>Akerstedt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Night+work+and+breast+cancer+in+women:+a+Swedish+cohort+study.">Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study.</a> BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).</li><li>Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. 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J., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+input+modulates,+but+does+not+determine,+phase+of+peripheral+circadian+oscillators.">Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).</li><li>Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four-hour+rhythms+of+plasma+catecholamines+and+their+relation+to+cardiovascular+parameters+in+healthy+young+men.">Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men.</a> Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+circulating+fibroblast+growth+factor+21+is+related+to+diurnal+changes+in+fatty+acids+in+humans.">Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans.</a> Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+circadian+rhythm+of+DNA+synthesis+in+tumor+cells+by+inhibiting+platelet-derived+growth+factor+signaling.">Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling.</a> J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).</li><li>Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+growth+factor,+circadian+clock,+and+cell+cycle+signaling+in+regenerating+hepatocyte+RXRalpha-deficient+mouse+livers.">Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers.</a> Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).</li><li>Virag, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+poly(ADP-ribose)+polymerase-1:+role+in+oxidative+stress-related+pathologies.">Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies.</a> Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).</li><li>Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+inhibitor+screening+identifies+multiple+protein+kinases+important+for+circadian+clock+oscillations.">Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations.</a> Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).</li><li>Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Cell-autonomous+Circadian+Clock+Rhythms+of+Gene+Expression+Using+Luciferase+Bioluminescence+Reporters.">Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters.</a> J Vis Exp. (67), e4234 (2012).</li><li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li></ol>

In cellule di mammifero, periodicità dell'orologio circadiano è regolato da anelli di retroazione trascrizionale traslazionale interconnessi. Eterodimeri di Bmal1 e orologio o Npas2 regolare la trascrizione circadiano legandosi agli elementi di E-box nei promotori di nucleo CGs, tra cui Per2 e piangeree numerosi CCGs4. Come si accumulano nella cella, heterodimers di a: Cry traduzionalmente modificati e trasportate al nucleo di reprimere l'attività trascrizionale dell'orologio:...

L'orologio circadiano regola una vasta gamma di processi biologici da diurni espressione dei geni per dormire il comportamento in un ritmo prevedibile con una periodicità di circa 24 h. epidemiologico gli studi suggeriscono fortemente che rottura cronica del circadiano ritmo aumenta il rischio di cancro al seno e alla prostata nei turnisti, tra cui gli infermieri e gli equipaggi di volo1,2,3. Questi risultati sono confermati dagli studi del roditore, che dimostrano che l'esposizione a cicli di luce di notte, o luce di luce costante, che imitano il jet lag aumento l'incidenza del tumore e accelera la crescita del tumore4,5. Basato su dati provenienti da studi sia umani e del roditore, l'Agenzia internazionale per ricerca sul cancro classificati turni di lavoro come agente cancerogeno umano probabile (tipo 2A) in 20106.
Precedentemente, abbiamo dimostrato che una singola dose cancerogena dell'agente cancerogeno specifico tumore mammario, N- nitroso-N- methylurea (NMU), interrotto l'espressione circadiana dei principali geni circadiani (CGs) (ad es., periodo 2 , Per2) e parecchi geni circadiani controllato (GCC), tra cui chiave reattivo il danno del DNA e ripristino geni (DDRR) nella ghiandola mammaria di destinazione (ma non nel fegato). Inoltre, reimpostare l'espressione circadiana dei geni sia Per2 e DDRR verso il normale da un regime chemopreventive dell'alimentari L-metil-selenocisteina (MSC) ha ridotto l'incidenza del tumore del 63%. Questi risultati sono stati i primi a mostrare un collegamento meccanicistico tra ritmo circadiano, carcinogenesi chimica e chemoprevention7,8. Esposizioni verso altri tossici ambientali indicate per interrompere gene circadiano espressione in vivo inoltre sono associate con un rischio aumentato di malattie ambientali9,10. La comprensione dei meccanismi che collegano la rottura circadiana di tossici ambientali e patogenesi può portare a meccanicistico approcci alla prevenzione della malattia. Tuttavia, gli studi volti a definire le interazioni tra le esposizioni e ritmo circadiano sono di solito eseguite in vivo. Un tipico in vivo esperimento studiando che l'impatto sul ritmo circadiano richiede grandi quantità di animali, tessuti da almeno tre di controllo e tre animali esposti devono essere raccolti ogni 3-4 ore su un periodo di 24 o 48 h. Sviluppo di un sistema convalidato in vitro che ricapitola in vivo osservazioni e meccanismi sarebbe quindi non solo riducono il numero di animali necessari, ma anche drasticamente ridurre i costi sperimentali e il requisito che i ricercatori lavorano continuativamente per un periodo di 24-48 h. Inoltre, un sistema convalidato in vitro potrebbe essere usato per screening su vasta scala di composti e/o alterazioni genetiche che influenzano il ritmo circadiano, o la sua risposta a fattori di stress ambientale o sostanze tossiche. Pertanto, la combinazione strategica di modelli in vitro e in vivo e gli esperimenti sono necessari per ottenere diverse intuizioni con diversa attenzione.
Nei mammiferi, oscillatori circadiani esistano non solo nei neuroni specializzati del SCN, ma anche in diversi tipi di cellule più periferiche. Questi orologi molecolari sono simili a quelli nelle linee cellulari stabilite del fibroblasto e nei fibroblasti primari da embrioni o animali adulti; Tuttavia, c'è una necessità per tessuto modelli cellulari di tipo-specific11. Di conseguenza, gli studi tradizionali di attività locomotrice in vivo, SCN espianti ex vivoe saggi basati su cellule in vitro in cellule immortalizzate del fibroblasto sono ampiamente usati per studiare i difetti circadiani cella-autonoma. Tuttavia, non ci sono prove che indicano che un in vitro dei fibroblasti basati su cellule test può ricapitolare meccanismi circadiani e risposte presentano in cellule di altri organi periferici in vivo. Diversi tipi di cellule possono avere modelli distinti di espressione genica, metabolismo xenobiotico e DDRR, e i legami tra tossicità ed espressione genica circadiana possono essere cellula-tipo specifico e/o modulata da diversi parametri fisiologici. Inoltre, oscillatori circadiani nei sistemi basati su fibroblasti non sono stati completamente valutati per risposte a tossici ambientali, fattori di stress e agenti preventivi che collegano le esposizioni ai meccanismi di prevenzione e lo sviluppo della malattia. Così, c'è una necessità per facile, convalidato cellula-tipo specifico, le analisi in vitro bioluminescenza per studiare gli interferenti circadiano ambientali specifici di organo. Anche se una varietà di modelli di orologio cellulare (ad es., nel fegato, cheratinociti e le cellule di grasso, nonché una linea di cellule di osteosarcoma) sono state sviluppate in anni recenti12,13,14, 15, il dosaggio descritto qui è il primo modello di orologio cellulare in cellule epiteliali del seno e la prima dimostrazione in vivo risposte a fattori di stress ambientale, sostanze tossiche, farmaci e agenti chemopreventive di ricapitolare.
Renilla luciferasi (rLuc) e luciferasi firefly 30-61 kDa proteine monomeriche che non necessitano di posttranslational elaborazione dell'attività enzimatica e possono funzionare come un reporter genetico immediatamente dopo la traduzione. Una volta che il substrato si associa con l'enzima luciferasi, la reazione biochimica catalizzata genera un lampo di luce. Così, la luciferasi costrutti sono ampiamente usati come espressione gene reporter sistema in vitro e in vivo. Tuttavia, negli studi di ritmo circadiano, l'utilità del reporter di luciferase è limitato il tempo di dimezzamento relativamente lunga della proteina luciferasi (T1/2 = h 3,68) relativa al periodo (soprattutto per il breve periodo) per mutazioni nel gene circadiano espressione; Tuttavia, numerosi studi nel corso degli anni hanno utilizzato con successo il gene della luciferasi nel vettore pGL3, che indica che la luciferasi rapidamente degradabile potrebbero non essere necessario per aver segnalato i ritmi circadiani, soprattutto per i ritmi con un periodo più lungo, come 24 h. Pertanto, un reporter del utilizzando il vettore di luciferasi destabilizzato, pGL [Luc2P/Neo], che contiene hPEST (una sequenza di destabilizzazione della proteina) è stato sviluppato, che ci permette di usarlo come un vettore reporter circadiano per nostra attuale in vitro analisi di bioluminescenza. La proteina codificata da Luc2P ha una molto più breve emivita (T1/2 = 0,84 h) e quindi, risponde più velocemente e con un ordine di grandezza maggiore ai cambiamenti nell'attività trascrizionale che il selvaggio-tipo, hoSPI che può essere utilizzato per monitorare l'espressione ritmica della luciferasi regolato dal promotore PER2 con precisione in tempo reale16.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector</td>
			<td>SwitchGear Genomics</td>
			<td>S700000</td>
			<td>customized vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL4.18[Luc2P/Neo] vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>9PIE673</td>
			<td>destabilized luciferase expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224041</td>
			<td>For subcloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA cloning kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K4500-02</td>
			<td>with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sac I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hind III-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3104S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>DNA clean up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Miller&#39;s modification</td>
			<td>TEKNOVA</td>
			<td>L8600</td>
			<td>For transformed E. Coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plate</td>
			<td>TEKNOVA</td>
			<td>L1902</td>
			<td>For white/blue selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>For extraction of plasmide DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree plasmid maxi prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>For extraction of plasmide DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Mammary Epithelial Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td>Mammary Epithelial Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEBM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3151</td>
			<td>Mammary Epithelial Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGM SingleQuot Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4136</td>
			<td>Suppliments &#38; Growth Factors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReagentPack</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5034</td>
			<td>Reagent for subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Wash cells in culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Dilute 10X D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (35 mm)</td>
			<td>BD/Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>cell culture dish suitable to LumiCycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9044707</td>
			<td>For sealing dish with recording medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>64-1500 (CS-40R)</td>
			<td>For sealing dish with recording medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Supplement for growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate (Geniticin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10131035</td>
			<td>Antibiotic for selection of stabliy transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9393</td>
			<td>For colony selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Synchronization agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melatonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5250</td>
			<td>Synchronization agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Synchronization agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>Synchronization agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2912</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IC261</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10658</td>
			<td>Positive control for circadian disruptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylnitrosourea (NMU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1517</td>
			<td>Mammary specific carcinogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylselenocysteine (MSC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6680</td>
			<td>Organic selenium (chemopreventive agent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX527</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7034</td>
			<td>SIRT1 specific inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cambinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0494</td>
			<td>SIRT1 &#38; SIRT2 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 8000</td>
			<td>Quantify nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N805-0200</td>
			<td>For molecular biology experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>Series 8000 DH</td>
			<td>For cell culture at 5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge with refrezerator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td>For molecular biology experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with swing bucket</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80124</td>
			<td>Phase contrast optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Class II A2</td>
			<td>BSL-2 certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LumiCycle 32</td>
			<td>Actimetrics</td>
			<td>Not Available</td>
			<td>Luminoscence detector</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro bioluminescence assay to characterize circadian rhythm in mammary epithelial cells

Il ritmo circadiano è un processo fisiologico fondamentale presente in tutti gli organismi che regola i processi biologici che vanno dall'espressione genica di dormire comportamento. Nei vertebrati, ritmo circadiano è controllato da un oscillatore molecolare che funziona sia nel nucleo soprachiasmatico (SCN; centrale dello stimolatore cardiaco) e singole celle che comprende tessuti più periferici. Più importante, la rottura del ritmo circadiano di esposizione alla luce di notte, fattori di stress ambientale e/o sostanze tossiche è associata a un aumentato rischio di malattie croniche e l'invecchiamento. La capacità di identificare gli agenti che possono interferire con orologi biologici centrali e/o periferici e gli agenti che possono impedire o attenuare gli effetti della perturbazione circadiana, ha implicazioni significative per la prevenzione delle malattie croniche. Anche se i modelli del roditore possono essere utilizzati per identificare le esposizioni e gli agenti che inducono o prevenire/ridurre la rottura circadiana, questi esperimenti richiedono un numero elevato di animali. In vivo gli studi inoltre richiedono infrastrutture e risorse significative e i ricercatori a lavorare tutta la notte. Così, c'è un urgente bisogno di un sistema appropriato in vitro di cellula-tipo di schermo per ambientali interferenti circadiani e rinforzatori in tipi cellulari da diversi organi e Stati di malattia. Abbiamo costruito un vettore che guida la trascrizione della luciferasi destabilizzato in cellule eucariotiche, sotto il controllo del promotore del gene umano di periodo 2 . Questa costruzione del reporter circadiano era trasfettata stabilmente in cellule epiteliali mammarie umane e cellule circadiano reattivo reporter sono state selezionate per sviluppare il saggio in vitro bioluminescenza. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per stabilire e convalidare il dosaggio. Forniamo ulteriori dettagli per prova degli esperimenti di concetto che dimostra la capacità della nostra analisi in vitro di ricapitolare gli effetti in vivo di vari prodotti chimici sul cellulare orologio biologico. I risultati indicano che il dosaggio può essere adattato ad una varietà di tipi cellulari per lo screening sia ambientali interferenti e chemopreventive esaltatori di orologi circadiani.

Vettore reporter circadiano bioluminescenza: espressione umana di promotore-guidato da PER2 della variante destabilizzato luciferasi
La sequenza di DNA che comprende un frammento di bp 941 derivato dal promotore PER2 umano utilizzato per costruire il vettore reporter circadiano, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, in primo luogo è stato analizzato per la presenza di elementi regolatori conosciuta per regolar...

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In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

Un'analisi di bioluminescenza in vitro per determinare il ritmo circadiano cellulare in cellule epiteliali mammarie è presentata. Questo metodo utilizza plasmidi di reporter di cellule di mammifero che esprimono destabilizzato luciferasi sotto il controllo del promotore del gene di periodo 2 . Può essere adattato ad altri tipi di cella per valutare gli effetti di organo-specific il ritmo circadiano.

In Vitro Dosaggio di bioluminescenza per caratterizzare il ritmo circadiano in cellule epiteliali mammarie

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell&#39;ormone in colture cellulari primarie umane

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Ricerca

Genetica

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Utilizzando In Vitro e nelle celle di forma per indagare la piccola molecola ha indotto cambiamenti strutturali Pre-mRNA

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An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

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