Name: in vitro bioluminescence assay to characterize circadian rhythm in mammary epithelial cells
Uploaded: 2017-09-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la sociedad de Toxicología de 2012 (SOT)-Colgate Palmolive Grant de investigación alterativa (M. Fang) y la investigación de colaboración internacional fondo de Animal y de la Agencia de cuarentena de planta, República de Corea (M. Fang), y conceder el NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Nos gustaría agradecer al Dr. Zheng Chen (McGovern Facultad de medicina de la Universidad de Texas Health Science Center Houston) para su discusión útil, el Sr. Juan Shao-An por su ayuda experimental y la Sra. Kimi Nakata para su lectura de prueba.

1. construcción del PER2 promotor conducido desestabilizado Luciferase Reporter Vector <ol><li>comprar un modificado para requisitos particulares, pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector que contiene el cDNA que codifican rLuc y humanos Fragmento de promotor PER2 (hPER2P, 941 bp) en el sitio entre Sac I y Hind III en la región clonación múltiple 17.</li>
	<li>Cortar el fragmento de promotor PER2 humano (hPER2P, 941 b...

<ol>
	<li>Akerstedt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Night+work+and+breast+cancer+in+women:+a+Swedish+cohort+study.">Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study.</a> BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).</li><li>Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. 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Z., Zhang, X., Zarbl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylselenocysteine+resets+the+rhythmic+expression+of+circadian+and+growth-regulatory+genes+disrupted+by+nitrosomethylurea+in+vivo.">Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo.</a> Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).</li><li>Burbulla, L. F., Kruger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+environmental+and+genetic+pathways+in+the+pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).</li><li>Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. 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A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+gene+expression+in+cultured+cells.">Circadian gene expression in cultured cells.</a> Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).</li><li>Ramanathan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+functions+of+period+genes+revealed+by+novel+adipocyte+and+hepatocyte+circadian+clock+models.">Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004244 (2014).</li><li>Sporl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circadian+clock+in+HaCaT+keratinocytes.">A circadian clock in HaCaT keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).</li><li>Zhang, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+for+modifiers+of+the+circadian+clock+in+human+cells.">A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells.</a> Cell. 139 (1), 199-210 (2009).</li><li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li><li>Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. 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J., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+input+modulates,+but+does+not+determine,+phase+of+peripheral+circadian+oscillators.">Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).</li><li>Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four-hour+rhythms+of+plasma+catecholamines+and+their+relation+to+cardiovascular+parameters+in+healthy+young+men.">Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men.</a> Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+circulating+fibroblast+growth+factor+21+is+related+to+diurnal+changes+in+fatty+acids+in+humans.">Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans.</a> Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+circadian+rhythm+of+DNA+synthesis+in+tumor+cells+by+inhibiting+platelet-derived+growth+factor+signaling.">Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling.</a> J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).</li><li>Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+growth+factor,+circadian+clock,+and+cell+cycle+signaling+in+regenerating+hepatocyte+RXRalpha-deficient+mouse+livers.">Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers.</a> Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).</li><li>Virag, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+poly(ADP-ribose)+polymerase-1:+role+in+oxidative+stress-related+pathologies.">Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies.</a> Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).</li><li>Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+inhibitor+screening+identifies+multiple+protein+kinases+important+for+circadian+clock+oscillations.">Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations.</a> Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).</li><li>Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Cell-autonomous+Circadian+Clock+Rhythms+of+Gene+Expression+Using+Luciferase+Bioluminescence+Reporters.">Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters.</a> J Vis Exp. (67), e4234 (2012).</li><li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li></ol>

En células de mamífero, periodicidad del reloj circadiano está regulada por retroalimentación transcripcional/traslacional interconectados. Heterodímeros de Bmal1 y reloj o Npas2 regular circadiano transcripción de unión a elementos de E-box en los promotores de núcleo CGs, incluyendo Per2 y gritoy numerosos CCGs4. Medida que se acumulan en la célula, heterodímeros de por: Cry postraduccional se modifican y transportados al núcleo para reprimir la actividad transcripci...

El reloj circadiano regula una amplia gama de procesos biológicos de diurna expresión de los genes dormir comportamiento a un ritmo predecible con una periodicidad de aproximadamente 24 h. epidemiológica estudios sugieren fuertemente que alteración crónica de los ritmo aumenta el riesgo de cáncer de mama y próstata en los trabajadores por turnos, incluyendo enfermeras y equipos de vuelo de1,2,3. Estas conclusiones son corroboradas por estudios de roedores, demostrando que la exposición a los ciclos de luz en la noche, o de la luz la luz constante, que imitan la incidencia de tumor aumento de jet-lag y acelera el crecimiento de tumor4,5. Basado en datos de estudios humanos y roedores, la Agencia Internacional para investigación del cáncer clasifica turnos de trabajo como un probable carcinógeno humano (tipo 2A) en 20106.
Previamente, hemos demostrado que una sola dosis cancerígena de la carcinógeno específico de tumor mamario, N- nitroso-N- Metilurea (NMU), interrumpe la expresión circadiana de genes circadianos mayores (CGs) (p. ej., 2 periodo , Per2) y varios genes circadianos controlados (CCGs), incluyendo clave de respuesta del daño de la DNA y reparación de genes (DDRR) en la glándula mamaria de destino (pero no en el hígado). Por otra parte, para reiniciar la expresión circadiana de genes Per2 y desmovilización hacia la normal, un régimen quimiopreventivo dietético L-metil-selenocisteína (MSC) reduce la incidencia de tumores en un 63%. Estos hallazgos fueron los primeros en mostrar un enlace mecánico entre el ritmo circadiano, carcinogénesis química y quimioprevención7,8. Exposición a otros tóxicos medioambientales demostrados para interrumpir la expresión de genes circadianos en vivo también se asocian con mayor riesgo de enfermedades ambientales9,10. Comprensión de los mecanismos que vinculan la disrupción circadiana por tóxicos ambientales y patogenia puede llevar al mecánico los enfoques para la prevención de enfermedades. Sin embargo, estudios encaminados a definir las interacciones entre la exposición y del ritmo circadiano se realizan generalmente en vivo. Un típico en vivo experimento investiga que el impacto en el ritmo circadiano requiere grandes cantidades de animales, como controlan de los tejidos de al menos tres y tres animales expuestos deben ser recogidos cada 3-4 h durante 24 o 48 h. Desarrollo de un sistema validado en vitro que recapitula en vivo observaciones y mecanismos por lo tanto, no sólo reducir el número de animales requeridos, pero reducir dramáticamente los costos experimentales y el requisito de que los investigadores trabajan continuamente durante un período de 24-48 h. Por otra parte, un sistema validado en vitro podría utilizarse para el cribado de alto rendimiento de compuestos o alteración genética que afecta el ritmo circadiano, o su respuesta a estresores ambientales o sustancias tóxicas. Por lo tanto, la combinación estratégica de modelos in vitro e in vivo y los experimentos son necesarios para obtener diferentes perspectivas con enfoque diferente.
En los mamíferos, osciladores circadianos existen no sólo en neuronas especializadas de la escena, sino también en tipos de células más periféricos. Estos relojes moleculares son similares a ésos en líneas celulares de fibroblastos establecidos y en fibroblastos primarios de embriones o animales adultos; sin embargo, hay una necesidad de tejido tipo-específica de modelos celulares11. En consecuencia, estudio de la actividad locomotriz en vivo, SCN explantes ex vivo, y basado en la célula en vitro ensayos en células inmortalizadas fibroblastos son ampliamente utilizados para estudiar defectos circadianos celular autónoma. Sin embargo, no existe evidencia que indica que una en vitro fibroblastos celular ensayo puede recapitular mecanismos circadianos y respuestas presentan en células de otros órganos periféricos en vivo. Diferentes tipos de células pueden tener distintos patrones de expresión génica, metabolismo xenobiótico y desmovilización, y la relación entre toxicidad y expresión de genes circadianos puede ser tipo de la célula específica o modulado por diferentes parámetros fisiológicos. Además, osciladores circadianos en sistemas basados en fibroblastos no hayan sido completamente evaluados para respuestas a sustancias tóxicas ambientales, factores de estrés y agentes preventivos que vinculan la exposición a los mecanismos de prevención y desarrollo de la enfermedad. Por lo tanto, hay una necesidad de facile, validados-tipo de células específicas, en vitro ensayos de bioluminiscencia para estudiar disruptores circadiano ambientales específicas de órgano. Aunque una variedad de modelos de celular reloj (p. ej., en hígado, queratinocitos y células de grasa, así como una línea celular de osteosarcoma) han desarrollado en estos últimos años12,13,14, 15, el ensayo descrito aquí es el primer modelo de reloj celular en células epiteliales de mama y la primera demostración para recapitular en vivo respuesta a estresores ambientales, tóxicos, fármacos y agentes quimiopreventivos.
Renilla LUCIFERASA (rLuc) y luciferasa de la luciérnaga son proteínas monoméricas de 61 30 kDa que no requieren postraduccional de procesamiento para la actividad enzimática y pueden funcionar como un reportero genético inmediatamente después de la traducción. Una vez que el sustrato se asocia con la enzima luciferasa, la reacción bioquímica catalizada genera un destello de luz. Por lo tanto, construcciones de luciferase son ampliamente utilizadas como gene expresión reportero sistema en vitro y en vivo. Sin embargo, en estudios del ritmo circadiano, la utilidad del reportero de luciferasa está limitada por la vida media relativamente larga de la proteína luciferase (T1/2 = 3,68 h) en relación con el período (especialmente a corto plazo) cambios en el gen circadiano expresión; sin embargo, numerosos estudios sobre los años han utilizado con éxito el gen de luciferasa en el vector pGL3, indicando que el luciferase rápidamente degradable puede no ser necesario para denunciar los ritmos circadianos, especialmente para los ritmos con un período más largo, como 24 h. Por lo tanto, un plásmido reportero usando vector luciferase desestabilizada, pGL [Luc2P/Neo], que contiene hPEST (una secuencia de la desestabilización de la proteína) se ha desarrollado, lo que nos permite utilizarlo como un vector reportero circadiano para nuestro actual in vitro ensayo de bioluminiscencia. La proteína codificada por Luc2P tiene una mucho más corta vida media (T1/2 = 0,84 h) y por lo tanto, responde más rápidamente y con una magnitud mayor a los cambios en la actividad transcripcional de tipo silvestre,indicar que puede ser utilizado para monitorizar la expresión rítmica de luciferase regulado por el promotor PER2 exactamente en tiempo real16.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector</td>
			<td>SwitchGear Genomics</td>
			<td>S700000</td>
			<td>customized vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL4.18[Luc2P/Neo] vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>9PIE673</td>
			<td>destabilized luciferase expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224041</td>
			<td>For subcloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA cloning kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K4500-02</td>
			<td>with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sac I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hind III-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3104S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>DNA clean up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Miller&#39;s modification</td>
			<td>TEKNOVA</td>
			<td>L8600</td>
			<td>For transformed E. Coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plate</td>
			<td>TEKNOVA</td>
			<td>L1902</td>
			<td>For white/blue selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>For extraction of plasmide DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree plasmid maxi prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>For extraction of plasmide DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Mammary Epithelial Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td>Mammary Epithelial Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEBM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3151</td>
			<td>Mammary Epithelial Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGM SingleQuot Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4136</td>
			<td>Suppliments &#38; Growth Factors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReagentPack</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5034</td>
			<td>Reagent for subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Wash cells in culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Dilute 10X D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (35 mm)</td>
			<td>BD/Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>cell culture dish suitable to LumiCycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9044707</td>
			<td>For sealing dish with recording medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>64-1500 (CS-40R)</td>
			<td>For sealing dish with recording medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Supplement for growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate (Geniticin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10131035</td>
			<td>Antibiotic for selection of stabliy transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9393</td>
			<td>For colony selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Synchronization agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melatonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5250</td>
			<td>Synchronization agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Synchronization agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>Synchronization agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2912</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IC261</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10658</td>
			<td>Positive control for circadian disruptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylnitrosourea (NMU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1517</td>
			<td>Mammary specific carcinogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylselenocysteine (MSC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6680</td>
			<td>Organic selenium (chemopreventive agent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX527</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7034</td>
			<td>SIRT1 specific inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cambinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0494</td>
			<td>SIRT1 &#38; SIRT2 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 8000</td>
			<td>Quantify nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N805-0200</td>
			<td>For molecular biology experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>Series 8000 DH</td>
			<td>For cell culture at 5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge with refrezerator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td>For molecular biology experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with swing bucket</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80124</td>
			<td>Phase contrast optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Class II A2</td>
			<td>BSL-2 certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LumiCycle 32</td>
			<td>Actimetrics</td>
			<td>Not Available</td>
			<td>Luminoscence detector</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro bioluminescence assay to characterize circadian rhythm in mammary epithelial cells

El ritmo circadiano es un proceso fisiológico fundamental presente en todos los organismos que regula los procesos biológicos que van desde la expresión del gen a dormir comportamiento. En los vertebrados, el ritmo circadiano es controlado por un oscilador molecular que funciona en el núcleo supraquiasmático (SCN; marcapasos central) y las células individuales que comprende los tejidos más periféricos. Lo más importante, alteración del ritmo circadiano por la exposición a la luz en la noche, estresores ambientales o sustancias tóxicas es asociado con mayor riesgo de enfermedades crónicas y el envejecimiento. La capacidad para identificar agentes que pueden perturbar Relojes biológicos central o periféricas y que pueden prevenir o mitigar los efectos de la disrupción circadiana, tiene implicaciones importantes para la prevención de enfermedades crónicas. Aunque modelos de roedores se pueden utilizar para identificar riesgos y agentes que inducen o evitarán/mitigación la disrupción circadiana, estos experimentos requieren de grandes cantidades de animales. Estudios in vivo también requieren infraestructura y recursos importantes y requieren los investigadores trabajar toda la noche. Así, hay una necesidad urgente de un tipo de células apropiadas en vitro sistema a pantalla para ambientales disruptores circadianos y potenciadores en tipos de células de diferentes órganos y enfermedades. Construimos un vector que impulsa a transcripción de la luciferase desestabilizada en células eucarióticas bajo el control del promotor humano del gene de periodo 2 . Esta construcción circadiano reportero fue estable transfected en las células epiteliales mamarias humanas y células circadiano sensible reportero fueron seleccionadas para desarrollar el ensayo de bioluminiscencia en vitro . Aquí, presentamos un protocolo detallado para establecer y validar el análisis. Ofrecemos más información para la prueba de los experimentos de concepto que demuestra la capacidad de nuestro análisis en vitro para recapitular los efectos en vivo de diversos productos químicos en el reloj biológico celular. Los resultados indican que el ensayo puede ser adaptado a una variedad de tipos de células para detectar disruptores ambientales y chemopreventive potenciadores de los relojes circadianos.

Vector de reportero de bioluminiscencia circadiano: PER2 humano impulsado por el promotor la expresión de variante de luciferase desestabilizada
La secuencia de ADN que comprende un fragmento de bp 941 deriva el promotor humano de PER2 utilizado para construir el vector reportero circadiano, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, primero se analizó la presencia de elementos reguladores que regulan expresión d...

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In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

Se presenta un ensayo de bioluminiscencia en vitro para determinar del ritmo circadiano celular en células epiteliales mamarias. Este método utiliza plásmidos de reportero de células de mamífero expresando desestabilizada luciferasa bajo el control del promotor del gen de periodo 2 . Puede ser adaptado a otros tipos de células para evaluar efectos de órgano-específicas en el ritmo circadiano.

In Vitro Ensayo de bioluminiscencia para la caracterización del ritmo circadiano en células epiteliales mamarias

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Investigación

Genética

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenética aleatoria de mutagénesis, utilizando la histona-miniSOG en<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Uso en Vitro y en las células la forma para investigar la molécula pequeña inducida por cambios estructurales Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Caracterización de la histona modificación post-translacional alteraciones en modelos neurodegenerativos Proteinopathy de levadura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Un protocolo in vitro para evaluar los niveles, funciones y genes objetivo asociados de MicroRNA en células tumorales

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

El uso de células tumorales mamarias de ratón en un ensayo de invasión in vitro como medida del comportamiento de las células oncogénicas

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...