Name: enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00
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लेखक डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । जिम लह और एलन Levey, न्यूरोलॉजी के एमोरी विभाग, सहायक टिप्पणियां और सुझावों के लिए । यह काम आंशिक रूप से तेजी से दवा भागीदारी अनुदान (U01AG046161-02), एमोरी अल्जाइमर रोग अनुसंधान केंद्र (P50AG025688) और एजिंग अनुदान (R01AG053960-01) पर एक राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया था N.T.S. करने के लिए इस अनुसंधान भी एमोरी तंत्रिका विज्ञान NINDS कोर सुविधाएं अनुदान, P30NS055077 के Neuropathology कोर द्वारा भाग में समर्थन किया गया था ।

आचार कथन: सभी मस्तिष्क के ऊतकों से प्राप्त किए गए एमोरी अल्जाइमर & #39; एस रोग अनुसंधान केंद्र (ADRC) ब्रेन बैंक. मानव गुजाइश ऊतकों को उचित संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) प्रोटोकॉल के तहत अधिग्रहीत किया गया...

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	<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease.">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991 (1991).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li><li>Ram&#237;rez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+exploration+of+the+influence+of+the+protein+stability+on+amyloid+fibril+formation+in+vitro.">A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).</li><li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Beta+Peptide:+A+Chemist's+Perspective.+Role+in+Alzheimer's+and+Fibrillization.">The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li><li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease.">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li><li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer's+Disease.">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+detergent-insoluble+brain+proteome+linked+to+amyloid+and+tau+in+Alzheimer's+Disease+progression.">Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression.</a> PROTEOMICS. , (2016).</li><li>Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).</li><li>Nizhnikov, A. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+determination+of+widespread+detergent+insolubility,+including+A&#946;+but+not+tau,+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including A&#946; but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> FASEB J. , (2005).</li><li>Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+the+Core+Structure+of+&#945;-Synuclein+Filaments.">Biochemical Characterization of the Core Structure of &#945;-Synuclein Filaments.</a> J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).</li><li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+&#945;-Synuclein+Is+Ubiquitinated+in+&#945;-Synucleinopathy+Lesions.">Phosphorylated &#945;-Synuclein Is Ubiquitinated in &#945;-Synucleinopathy Lesions.</a> J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130 (2006).</li><li>Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Intrinsically+Disordered+Low+Complexity+Domain+is+Required+for+U1-70K+Self-association.">An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association.</a> FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Noguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived,+Toxic,+High+Mass+Amyloid+&#946;-Protein+(A&#946;)+Assembly+from+Alzheimer+Disease+Brains.">Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid &#946;-Protein (A&#946;) Assembly from Alzheimer Disease Brains.</a> J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+&#946;-Amyloid+Protein+Is+Covalently+Modified+when+Dissolved+in+Formic+Acid.">Alzheimer's &#946;-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid.</a> J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).</li><li>Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis.">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+(snRNPs)+aggregate+in+Alzheimer's+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21.">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).</li><li>Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+change,+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein.">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li><li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer's+Disease+(CERAD).+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer's+disease.">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer's+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice.">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li><li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subfraction+of+A&#946;+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer's+disease+brain.">A distinct subfraction of A&#946; is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li></ol>

इस के साथ हम परिचय और एक संक्षिप्त एकल कदम डिटर्जेंट-आंशिक प्रोटोकॉल है कि प्रयोगात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री से लेकर अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है पर चर्चा कार्यात्मक प्रोटीन के लि...

अल्जाइमर रोग (AD), पार्किंसंस रोग (पीडी), हटिंगटन के रोग (एचडी), पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (एस), और बारीकी से संबंधित prion रोगों जैसे Neurodegenerative रोगों के क्रमिक संचय की विशेषता proteinopathies है साथ ही संज्ञानात्मक गिरावट के साथ मस्तिष्क में डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय । 1 , 2 इस साझा रोग विशेषता इन neurodegenerative रोगों के एटियलजि और pathophysiology में एक केंद्रीय भूमिका निभाने के लिए सोचा है । 2 इन समुच्चय आम तौर पर बहुलक amyloid फाइबर से मिलकर बनता है, जो दोहराया प्रोटीन का प्रदर्शन पार β-संरचना की दोहराने इकाइयों से बना रहे हैं । 1 , 2 , 3 , 4 जैव रासायनिक, amyloid समुच्चय अत्यधिक रासायनिक या थर्मल विकार और solubilization,3 जो पारंपरिक जैव रासायनिक तकनीकों के माध्यम से उनकी शुद्धि, विश्लेषण और अध्ययन करने के लिए अद्वितीय चुनौतियों प्रस्तुत करने के लिए प्रतिरोधी रहे हैं । 2 , 5 , ६ , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 आश्चर्य की बात है, डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन अंश neurodegenerativeed प्रोटीन के संचय से जुड़े रोगों के pathophysiology में ज्यादा शोध का ध्यान केंद्रित किया गया है । ६ , 12 , 13 , 14
जैव रासायनिक भिन्नीकरण तकनीक अक्सर गुजाइश मस्तिष्क homogenates से डिटर्जेंट-अघुलनशील अंश को समृद्ध करने के लिए उपयोग किया गया है. ६ , 12 , 13 , 14 सबसे आम तरीकों में से एक के buffers और डिटर्जेंट बढ़ाने के stringency के साथ ऊतक homogenates के अनुक्रमिक निष्कर्षण शामिल है, ultracentrifugation के लिए घुलनशील और अघुलनशील भागों विभाजन के बाद । एक सामान्य रूप से प्रयुक्त अनुक्रमिक भिन्नता प्रोटोकॉल6,14 एक डिटर्जेंट-मुक्त कम नमक में जमे हुए ऊतक के नमूनों की homogenization शामिल है (एलएस) बफर और परिणामी अघुलनशील छर्रों तो क्रमिक रूप से निकाले जाते हैं उच्च नमक युक्त बफ़र्स, गैर ईओण डिटर्जेंट, उच्च सुक्रोज, ईओण डिटर्जेंट और अंत में यूरिया की तरह chaotropes । ६ , 14 इस तरह के एक अनुक्रमिक आंशिक प्रोटोकॉल का एक स्पष्ट दोष पर्याप्त समय और श्रम उंहें पूरा करने के लिए आवश्यक प्रतिबद्धता है । homogenization और ultracentrifugation सहित, एक ठेठ पांच कदम आंशिक प्रोटोकॉल कई घंटे या दिन भी पूरा करने के लिए ले जा सकते हैं । 4 , ६ , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 इसके अतिरिक्त, के रूप में कई रोग प्रोटीन समुच्चय में अघुलनशील रहना सभी लेकिन कठोर शर्तों19,20 उत्पंन अंशों के अधिकांश सीमित मूल्य के हैं । इस प्रकार, कम-कड़े भिंन कदम उच्च नमक सांद्रता और गैर ईओण डिटर्जेंट का उपयोग मोटे तौर पर बेमानी हैं ।
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ईओण डिटर्जेंट N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) एक सरलीकृत एकल कदम डिटर्जेंट आंशिक प्रोटोकॉल के लिए एक उत्कृष्ट उंमीदवार है । 5 , ६ , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 एक denaturing डिटर्जेंट के रूप में, sarkosyl के लिए काफी कड़े है solubilizinged प्रोटीन समुच्चय बीटा से बना-amyloid (Aβ),6,11 के बिना natively तह प्रोटीन मस्तिष्क में विशाल बहुमत solubilize phosphorylated ताऊ (pTau),6 टीआर डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन ४३ (टीडीपी-४३),14 अल्फा-synuclein,12,13 scrapie,23 या U1 स्मॉल न्यूक्लियर ribonucleoproteins (U1 snRNPs) जैसे U1-70K । 5 , 21 , 22 के रूप में sarkosyl सर्वव्यापी anionic डिटर्जेंट सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) की तुलना में कम कठोर है, यह oligomeric उपचार का सामना नहीं कर सकता है कि एक प्रकार का प्रोटीन समुच्चय के कम मजबूत एसडीएस रूपों को बरकरार रखता है । 9
पहले, हम एक संक्षिप्त डिटर्जेंट-अंश प्रोटोकॉल है कि अधिक श्रमसाध्य अनुक्रमिक भिंन तरीके से तुलनीय परिणाम प्राप्त वर्णित है । 5 कम कड़े भिन्नीकरण चरणों को छोड़ कर, हम गुजाइश मानव मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के संवर्धन के लिए एक सतही एकल कदम भिन्नीकरण प्रोटोकॉल विकसित करने में सक्षम थे. 5 इस विस्तृत प्रोटोकॉल वर्णित के साथ साथ प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है पश्चिमी सोख्ता और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटियोमिक् कार्यात्मक प्रोटीन खुलासा और एकत्रीकरण के लिए बीज परख । 5 , ६ , 21

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78441</td>
			<td>protease &#38; phosphatase inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>microtip ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361545</td>
			<td>refrigerated ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA120.1 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>362224</td>
			<td>ultracentrifuge rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343776</td>
			<td>ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS sample buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP solution, neutral pH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37542</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37543</td>
			<td>blocking buffer and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>precast SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B0002</td>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5777-50G</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml polypropylene Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749521-1500</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cordless motor for Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau-2 (pan tau) antibody</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB375</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5450</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MN1020</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2900</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21058</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11374</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Dry Blotting System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB21001</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB23002</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain

इस अध्ययन में, हम मानव गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के संवर्धन के लिए एक संक्षिप्त एकल कदम अंश प्रोटोकॉल का वर्णन । ईओण डिटर्जेंट N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) प्रभावी ढंग से solubilizes natively मस्तिष्क ऊतक में जोड़कर प्रोटीन की अनुमति neurodegenerative proteinopathies की एक विस्तृत श्रृंखला से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के संवर्धन, जैसे अल्जाइमर रोग (AD), पार्किंसंस रोग और पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, और prion रोगों । मानव नियंत्रण और विज्ञापन गुजाइश मस्तिष्क के ऊतकों homogenized और sarkosyl की उपस्थिति में ultracentrifugation द्वारा अवसादी रोग phosphorylated ताऊ, neurofibrillary के कोर घटक सहित डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय को समृद्ध किया गया विज्ञापन में उलझ । वेस्टर्न सोख्ता ने एग्रीगेट phosphorylated-ताऊ और डिटर्जेंट-घुलनशील प्रोटीन, अर्ली Endosome प्रतिजन 1 (EEA1) के नियंत्रण और विज्ञापन मस्तिष्क में अंतर घुलनशीलता का प्रदर्शन किया । Proteomic विश्लेषण में भी β-amyloid (Aβ), ताऊ, snRNP70 (U1-70K) के संवर्धन का पता चला, और apolipoprotein ई (APOE) विज्ञापन मस्तिष्क के sarkosyl में अघुलनशील नियंत्रण के उन लोगों की तुलना में, पिछले ऊतक भिन्नीकरण रणनीतियों के अनुरूप . इस प्रकार, यह सरल संवर्धन प्रोटोकॉल पश्चिमी सोख्ता और कार्यात्मक प्रोटीन सह एकत्रीकरण परख से लेकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटियोमिक् को लेकर प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आदर्श है ।

संक्षिप्त एकल कदम sarkosyl-भिन्नीकरण प्रोटोकॉल नियंत्रण और विज्ञापन गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 1). गु-ए...

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Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

मानव गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय के संवर्धन के लिए एक संक्षिप्त आंशिक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है ।

मानव गुजाइश मस्तिष्क से डिटर्जेंट-अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय का संवर्धन

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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कोशिकाओं से मिलकर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

प्रोटीन पाचन, Ultrafiltration, और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी मानव रक्त प्लाज्मा और सीरम से Exosomes के अलगाव का अनुकूलन करने के लिए

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

अंशांकन-मुक्त इन विट्रो ठहराव में प्रोटीन होमो-oligomerization का उपयोग कर वाणिज्यिक इंस्ट्रूमेंटेशन और नि: शुल्क, खुला स्रोत चमक विश्लेषण सॉफ्टवेयर

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

पेप्टाइड संवर्धन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन सर्वव्यापकता साइटों का पता लगाना

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

ऊतकों में प्रोटीन के स्तर की मजबूत तुलना और विकास के दौरान मानकीकृत मात्रात्मक पश्चिमी Blotting का उपयोग

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

एंजाइमेटिक गतिविधि परख के लिए Filamentous कवक एस्पर्जिलस nidulans के एक टेप टैग की गई हिवन Deacetylase के एक कदम संवर्धन

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase अवरोधक स्क्रीनिंग में स्वयं इकट्ठे मानव प्रोटीन Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

इन्फ्रारेड नैनोस्पेक्ट्रोस्कोपी और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा व्यक्तिगत प्रोटीन सकल की विशेषता

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...