Name: enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00
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Gli autori ringraziano la d. ssa Jim Lah e Allan Levey, Emory dipartimento di neurologia, per suggerimenti e commenti utili. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla Partnership di medicina accelerando concessione (U01AG046161-02), la Emory Alzheimer malattia Research Center (P50AG025688) e un Istituto nazionale su invecchiamento concedere (R01AG053960-01) di N.T.S Questa ricerca è stata anche sostenuta in parte dal nucleo della neuropatologia della sovvenzione Emory neuroscienze NINDS Core strutture, P30NS055077.

etica istruzione: tutti i tessuti del cervello sono stati ottenuti da Emory Alzheimer &#39; s malattia Research Center (ADRC) Brain Bank. Tessuti umani post mortem sono stati acquisiti sotto protocolli appropriati Institutional Review Board (IRB).
 1. omogeneizzazione e frazionamento <ol><li>selezione del tessuto Nota: Frozen tessuto corteccia frontale post mortem da sani di controllo (Ctl) e patologico casi confermati di annuncio sono stati selezionati dalla Emory Ba...

<ol>
	<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease.">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991 (1991).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li><li>Ram&#237;rez-Alvarado, M., Merkel, J. 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Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li><li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease.">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li><li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer's+Disease.">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li><li>Hales, C. 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S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis.">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+(snRNPs)+aggregate+in+Alzheimer's+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21.">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).</li><li>Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+change,+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein.">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li><li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer's+Disease+(CERAD).+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer's+disease.">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer's+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice.">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li><li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subfraction+of+A&#946;+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer's+disease+brain.">A distinct subfraction of A&#946; is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li></ol>

Qui introduciamo e discutere un protocollo di detersivo-frazionamento passo singolo abbreviato che è applicabile a una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno dall'analisi basati sulla spettrometria di massa proteomica funzionale proteina misfolding saggi e western blotting. 5 , 6 , 7 , 10 questa metodologia è forse più efficace quando usato per studiare proteinopathies neurodegen...

Malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD), sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e le malattie da prioni strettamente correlati sono proteinopathies caratterizzata dall'accumulo graduale di aggregati di detersivo-insolubili della proteina nel cervello con l'accompagnamento conoscitivo declino. 1 , 2 questa caratteristica patologica comune è pensata per svolgere un ruolo centrale nell'eziologia e patofisiologia di queste malattie neurodegenerative. 2 questi aggregati consistono tipicamente di fibre amiloidi polimeriche, che sono composti da unità di proteine misfolded espositrici Croce βripetute-struttura. 1 , 2 , 3 , 4 biochimicamente, aggregati amiloidi sono altamente resistenti alla denaturazione termica o chimica e solubilizzazione,3 che presenta sfide uniche per la loro purificazione, analisi e studiano tramite tecniche biochimiche tradizionali. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 non sorprende, la frazione di detersivo-insolubili della proteina è stato al centro di molte ricerche nella patofisiologia delle malattie neurodegenerative che coinvolgono l'accumulo di proteine misfolded. 6 , 12 , 13 , 14
Tecniche di frazionamento biochimici sono stati utilizzati spesso per arricchire la frazione di detersivo-insolubili da omogenati di cervello post mortem. 6 , 12 , 13 , 14 uno dei metodi più comuni comporta l'estrazione sequenza degli omogeneati del tessuto con buffer e detergenti di crescente rigore, seguita da ultracentrifugazione di partizionare le frazioni solubili e insolubili. Un frazionamento sequenziale comunemente usato protocollo6,14 comporta l'omogeneizzazione di campioni di tessuto congelato in un buffer senza detersivo basso contenuto di sale (LS) e i pellet insolubili risultanti quindi vengono estratte in sequenza con buffer contenente sale alto, detergenti non ionici, alta saccarosio, detergenti ionici e infine chaotropes come urea. 6 , 14 un evidente svantaggio di tali protocolli di un frazionamento sequenziale è la notevole di tempo e l'impegno di lavoro necessario per completarle. Omogeneizzazione e ultracentrifugazione, un protocollo tipico cinque fasi frazionamento può richiedere diverse ore o anche giorni per completare. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 inoltre, aggregati di proteine patologiche come molti rimangono insolubili in tutti, ma le più dure condizioni19,20 la maggior parte delle frazioni generate sono di scarso valore. Così, i passaggi di meno-rigorosi frazionamento che utilizzano alte concentrazioni saline e detergenti non ionici sono in gran parte ridondanti.
Gli studi precedenti hanno dimostrato che il detergente ionico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) è un candidato eccellente per un protocollo semplificato passo singolo detergente frazionamento. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 come un detergente denaturante, sarkosyl è sufficientemente rigorosi per solubilizzare la stragrande maggioranza delle proteine in modo nativo piegati nel cervello senza solubilizzanti aggregati di proteine misfolded composti di beta-amiloide (Aβ),6,11 tau fosforilata (pTau),6 TAR DNA-proteina 43 (TDP-43),14 alfa-synuclein,12,13 scrapie,23 o U1 piccole ribonucleoproteine nucleari (U1 snRNPs) come U1 - 70K. 5 , 21 , 22 Come sarkosyl è meno rigorose rispetto l'onnipresente anionici detergente sodio dodecil solfato (SDS), conserva meno robuste forme oligomeriche di aggregati di proteine misfolded che non possono sopportare un trattamento di SDS. 9
In precedenza, abbiamo descritto un protocollo di detersivo-frazionamento abbreviato che ha raggiunto risultati paragonabili alle metodologie di frazionamento sequenziale più laboriose. 5 omettendo i passaggi meno rigorosi di frazionamento, siamo stati in grado di sviluppare un protocollo facile passo singolo frazionamento per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da post mortem del cervello umano. 5 questo protocollo dettagliato qui descritto è adatto per una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno da Western blotting e saggi basati sulla spettrometria di massa proteomica a funzionale misfolding e aggregazione semina. 5 , 6 , 21

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78441</td>
			<td>protease &#38; phosphatase inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>microtip ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361545</td>
			<td>refrigerated ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA120.1 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>362224</td>
			<td>ultracentrifuge rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343776</td>
			<td>ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS sample buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP solution, neutral pH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37542</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37543</td>
			<td>blocking buffer and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>precast SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B0002</td>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5777-50G</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml polypropylene Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749521-1500</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cordless motor for Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau-2 (pan tau) antibody</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB375</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5450</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MN1020</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2900</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21058</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11374</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Dry Blotting System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB21001</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB23002</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain

In questo studio, descriviamo un protocollo abbreviato passo singolo frazionamento per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem. Il detergente ionico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) solubilizza efficacemente nativamente piegati proteine nel tessuto cerebrale permettendo l'arricchimento degli aggregati della proteina detersivo-insolubili da una vasta gamma di proteinopathies neurodegenerative, come Morbo di Alzheimer (annuncio), morbo di Parkinson e sclerosi laterale amiotrofica e malattie da prioni. Controllo umano e tessuti di cervello post mortem AD sono stati omogeneizzati e sedimentato di ultracentrifugazione in presenza di sarkosyl per arricchire di aggregati proteici di detersivo-insolubili tra cui tau fosforilata patologica, il componente principale di neurofibrillary grovigli in annuncio. Macchiarsi occidentale ha dimostrato la solubilità differenziale aggregati fosforilato-tau e la proteina detergente solubile, presto 1 antigene Endosome (EEA1) in controllo e cervello dell'annuncio. Analisi proteomica ha rivelato anche arricchimento di β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) e l'apolipoproteina E (APOE) nelle frazioni sarkosyl-insolubile del cervello dell'annuncio rispetto a quelli di controllo, coerenza con le precedenti strategie di frazionamento del tessuto . Così, questo protocollo semplice arricchimento è ideale per una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno da Western blotting e funzionale della proteina saggi co-aggregazione a basati sulla spettrometria di massa proteomica.

Il protocollo abbreviato passo singolo sarkosyl-frazionamento è stato utilizzato per arricchire di aggregati proteici di detersivo-insolubili da controllo e cervello post mortem dell'annuncio (Figura 1). Proteine da frazioni TH-S, S1, S2 e P2 sono stati risolti da SDS-PAGE, fissato per 15 min in Coomassie blu tampone fissativo seguita dalla macchiatura delicata con buffer colorante Coomassie Brilliant Blue G-250. Il passo di risospensione è facoltativo in q...

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Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Un protocollo di frazionamento abbreviato per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem è descritto.

Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

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Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

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Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo