Name: enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Jim Lah og Allan Levey, Emory Institutt for nevrologi, for nyttige kommentarer og forslag. Dette arbeidet var delvis finansiert av det akselererende medisin partnerskap grant (U01AG046161-02), Emory Alzheimers sykdom Research Center (P50AG025688) og en National Institute on Aging gi (R01AG053960-01) til N.T.S. Denne forskningen ble også støttet delvis av Neuropathology kjernen av Emory nevrovitenskap NINDS Core fasiliteter tilskuddet, P30NS055077.

etikk uttalelse: alle hjernen vev Hentet fra Emory Alzheimers &#39; s sykdom Research Center (ADRC) hjernen Bank. Menneskelig postmortem vev anskaffet under riktig institusjonelle Review Board (IRB) protokoller.
 1. homogenisering og fraksjoneres <ol><li>vev utvalg Merk: frosset postmortem frontal cortex vev fra sunn kontroll (Ctl) og patologisk bekreftede AD tilfeller ble valgt ut fra Emory ADRC hjernen bank (n = 2). Obduksjon neuropathological evaluering av...

<ol>
	<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease.">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991 (1991).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li><li>Ram&#237;rez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+exploration+of+the+influence+of+the+protein+stability+on+amyloid+fibril+formation+in+vitro.">A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).</li><li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Beta+Peptide:+A+Chemist's+Perspective.+Role+in+Alzheimer's+and+Fibrillization.">The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li><li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease.">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li><li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer's+Disease.">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+detergent-insoluble+brain+proteome+linked+to+amyloid+and+tau+in+Alzheimer's+Disease+progression.">Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression.</a> PROTEOMICS. , (2016).</li><li>Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).</li><li>Nizhnikov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Screening+for+Amyloid+Proteins.">Proteomic Screening for Amyloid Proteins.</a> PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).</li><li>Seyfried, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+detergent-insoluble+brain+proteome+in+frontotemporal+lobar+degeneration+using+SILAC+internal+standards.">Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards.</a> J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).</li><li>Woltjer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+determination+of+widespread+detergent+insolubility,+including+A&#946;+but+not+tau,+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including A&#946; but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> FASEB J. , (2005).</li><li>Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+the+Core+Structure+of+&#945;-Synuclein+Filaments.">Biochemical Characterization of the Core Structure of &#945;-Synuclein Filaments.</a> J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).</li><li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+&#945;-Synuclein+Is+Ubiquitinated+in+&#945;-Synucleinopathy+Lesions.">Phosphorylated &#945;-Synuclein Is Ubiquitinated in &#945;-Synucleinopathy Lesions.</a> J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130 (2006).</li><li>Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Intrinsically+Disordered+Low+Complexity+Domain+is+Required+for+U1-70K+Self-association.">An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association.</a> FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Noguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived,+Toxic,+High+Mass+Amyloid+&#946;-Protein+(A&#946;)+Assembly+from+Alzheimer+Disease+Brains.">Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid &#946;-Protein (A&#946;) Assembly from Alzheimer Disease Brains.</a> J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+&#946;-Amyloid+Protein+Is+Covalently+Modified+when+Dissolved+in+Formic+Acid.">Alzheimer's &#946;-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid.</a> J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).</li><li>Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis.">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+(snRNPs)+aggregate+in+Alzheimer's+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21.">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).</li><li>Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+change,+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein.">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li><li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer's+Disease+(CERAD).+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer's+disease.">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer's+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice.">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li><li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subfraction+of+A&#946;+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer's+disease+brain.">A distinct subfraction of A&#946; is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li></ol>

Her vi introdusere og diskutere en forkortet enkeltsteg vaskemiddel-fraksjoneres protokoll som gjelder for en rekke eksperimentelle anvendelser fra masse massespektrometri-baserte Proteomikk analyse funksjonelle protein misfolding analyser og vestlige blotting. 5 , 6 , 7 , 10 denne metodikken er kanskje mest effektive når de brukes til å studere nevrodegenerative proteinopathies som Alzheimer...

Nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og de nært beslektede prionsykdommer er proteinopathies preget av gradvis oppbygging av vaskemiddel-uløselig protein mengdefunksjoner i hjernen med tilhørende kognitive nedgang. 1 , 2 denne delte patologisk funksjonen antas å spille en sentral rolle i etiologien og Patofysiologien ved disse nevrodegenerative sykdommer. 2 disse aggregater vanligvis består av polymere amyloid fiber, som består av repeterende enheter av misfolded protein viser cross β-strukturen. 1 , 2 , 3 , 4 biokjemisk, amyloid aggregater er svært motstandsdyktig mot kjemiske eller termisk rødsprit og solubilization,3 som gir unike utfordringer til rensing, analyse og studere via tradisjonell biokjemiske teknikker. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 ikke overraskende, vaskemiddel-uløselig protein fraksjon har vært fokus for mye forskning i Patofysiologien ved nevrodegenerative sykdommer som involverer akkumulering av misfolded proteiner. 6 , 12 , 13 , 14
Biokjemiske fraksjoneres teknikker har ofte blitt benyttet for å berike vaskemiddel-uløselig brøken fra postmortem hjernen homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 en av de vanligste metodene innebærer sekvensiell utvinning av vev homogenates med buffere og vaskemidler med økende stringens, etterfulgt av ultracentrifugation å partisjonere løselig og uløselig fraksjoner. En brukte sekvensiell fraksjoneres protokollen6,14 innebærer homogenisering av frosne vevsprøver i vaskemiddel uten lav salt (LS) bufferen og resulterende uløselig pellets trekkes deretter sekvensielt med buffere som inneholder høye saltinnholdet, ikke-ioniske vaskemidler, high sukrose, som ionisk vaskemidler og endelig chaotropes urea. 6 , 14 en åpenbare ulempen av slike en sekvensiell fraksjoneres protokoller er betydelig tid og arbeid engasjement kreves for å fullføre dem. Inkludert homogenisering og ultracentrifugation, en typisk fem-trinns fraksjoneres protokoll kan ta flere timer eller dager å fullføre. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 i tillegg så mange patologisk protein aggregater er uløselig i alle unntatt de tøffeste forhold19,20 de fleste av de genererte fraksjonene er av begrenset verdi. Dermed er mindre strenge fraksjoneres trinnene høye salt konsentrasjoner og ikke-ioniske vaskemidler stor grad overflødig.
Tidligere studier har vist at ioniske vaskemiddel N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) er en utmerket kandidat for en forenklet enkeltsteg vaskemiddel fraksjoneres-protokoll. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 som et denaturing vaskemiddel, sarkosyl er strenge nok til solubilize majoriteten av innfødt foldet proteiner i hjernen uten solubilizing misfolded protein aggregater består av beta-amyloid (Aβ),6,11 fosforylert tau (pTau),6 TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43),14 alfa-synuclein,12,13 Skrapesyke,23 eller U1 liten kjernefysiske ribonucleoproteins (U1 snRNPs) som U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Sarkosyl er mindre strenge enn det allestedsnærværende anionic vaskemiddel natrium dodecyl sulfat (SDS), beholder det mindre robust oligomeric former av misfolded protein aggregater som ikke tåler SDS behandling. 9
Tidligere beskrev vi en forkortet vaskemiddel-fraksjoneres-protokoll som oppnådde resultater sammenlignes med de mer arbeidskrevende metodikkene som følge fraksjoneres. 5 ved å utelate mindre strenge fraksjoneres trinnene, kunne vi utvikle en lettvinte enkeltsteg fraksjoneres protokoll for anriking av vaskemiddel-uløselig protein aggregater fra postmortem menneskelige hjerne. 5 denne detaljerte protokollen beskrevet her er godt egnet for en rekke eksperimentelle programmer fra vestlige blotting og masse massespektrometri-baserte Proteomikk funksjonelle protein misfolding og aggregering seeding søk. 5 , 6 , 21

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78441</td>
			<td>protease &#38; phosphatase inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>microtip ultrasonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361545</td>
			<td>refrigerated ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA120.1 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>362224</td>
			<td>ultracentrifuge rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343776</td>
			<td>ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X SDS sample buffer</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP solution, neutral pH</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77720</td>
			<td>reducing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37542</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>37543</td>
			<td>blocking buffer and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NW04120BOX</td>
			<td>precast SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B0002</td>
			<td>SDS-PAGE running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5777-50G</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml polypropylene Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749521-1500</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cordless motor for Pellet Pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td>homogenization tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau-2 (pan tau) antibody</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB375</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5450</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MN1020</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2900</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21058</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11374</td>
			<td>antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Dry Blotting System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB21001</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IB23002</td>
			<td>Gel transfer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain

I denne studien beskriver vi en forkortet enkeltsteg fraksjoneres protokoll for anriking av vaskemiddel-uløselig protein aggregater fra postmortem menneskehjernen. Ioniske vaskemiddel N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) solubilizes effektivt innfødt foldet proteiner i hjernevevet tillater anriking av vaskemiddel-uløselig protein aggregater fra en rekke nevrodegenerative proteinopathies, som Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom og amyotrofisk lateral sklerose, og prionsykdommer. Menneskelig kontroll og AD postmortem hjernen vev var homogenisert og sedimented av ultracentrifugation i nærvær av sarkosyl å berike vaskemiddel-uløselig protein aggregater inkludert patologisk fosforylert tau, kjernen komponenten av neurofibrillary floker i Annonsen. Vestlige blotting vist differensial Løseligheten av aggregert fosforylert-tau og vaskemiddel-løselig protein, tidlig Endosome Antigen 1 (EEA1) i kontroll og AD hjernen. Proteomic analyse avslørte også anriking av β-amyloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K), og apolipoprotein E (APOE) i sarkosyl-uløselig fraksjoner av AD hjernen sammenlignet med de av kontroll, konsekvent med tidligere vev fraksjoneres strategier . Derfor er denne enkle berikelse protokollen ideelt for en rekke eksperimentelle programmer spenner fra vestlige blotting og funksjonelle protein co aggregering analyser masse massespektrometri-baserte Proteomikk.

Forkortet enkeltsteg sarkosyl-fraksjoneres protokollen ble brukt til å berike vaskemiddel-uløselig protein aggregater av kontroll og AD postmortem hjernen (figur 1). Proteiner fra TH-S, S1, S2 og P2 fraksjoner ble løst av SDS-side, fast i 15 min i Coomassie blå etappe, den stabiliserende buffer etterfulgt av mild flekker med Coomassie briljant blå G-250 flekker buffer. Rørets er valgfritt siden det var umulig å oppdage nivåene av protein i S2 fraksjon...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain at JoVE.com

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

En forkortet fraksjoneres protokoll for anriking av vaskemiddel-uløselig protein aggregater fra postmortem hjernen er beskrevet.

Anriking av vaskemiddel-uløselig Protein aggregater fra Postmortem hjernen

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøyelse, ultrafiltrasjon og størrelse utelukkelse kromatografi å optimalisere isolering av Exosomes fra menneskelig blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust sammenligning av Protein nivå over vev og gjennom utvikling med standardiserte kvantitative vestlige Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step berikelse av en TAP-Tagged Histone deacetylase av trådformede sopp Aspergillus nidulans for enzymatisk aktivitet analysen

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase inhibitor screening i selv-monterte Human protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriserer individuelle protein aggregater av infrarød Nanospectroscopy og Atomic Force mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...