Name: a novel clinical grade isolation method for human kidney perivascular stromal cells
Uploaded: 2017-08-07T13:00:00
Duration: 9 min 5 s
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Diese Forschung wird finanziell von der Europäischen Gemeinschaft siebten Rahmenprogramm (RP7/2007-2013) unter Grant Vertragsnummer 305436 STELLAR.

The local medical ethical committee and ethical advisory board of the European consortium (STELLAR) approved the research and collection of human transplant grade kidneys discarded mainly for surgical reasons. Research consent was given for all kidneys.
1. Preparations for Cell Culture
<ol>
	<li>Prepare a pool of platelet lysates.
	<ol>
		<li>Store the platelets that have expired for less than 2 d in -80 &#176;C until use (for a maximum of 1 year). 
		NOTE: The platelets were originally sourced from a commercial vendor. Hospital surplus material distributed by the local blood bank were obtained.</li>
		<li>Thaw the platelets of at least 5 donors (preferably 10) O/N at 4 &#176;C.</li>
		<li>Pool the platelets in a large sterile bottle, transfer to conical centrifuge tubes and spin down for 10 min at 1,960 x g at 4 &#176;C. 
		NOTE: The volume of platelets depends on the number of donors and the amount of hospital surplus material per donor.</li>
		<li>Pipette the supernatant to blood bags (50 mL/bag) through the barrel of a 50 mL syringe. Store at -80 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparation of cell culture medium.
	<ol>
		<li>Defrost one bag of platelet lysates in a water bath at 37 &#176;C.</li>
		<li>Add 1 L (i.e. 2 bottles) of Minimum Essential Medium - alpha modification (alphaMEM), 5 mL 200 mM glutamine, and 20 mL of penicillin (5,000 U/mL)/streptomycin (5,000 &#181;g/mL) (pen/strep) to the bag.</li>
		<li>Incubate for 3 h at 37 &#176;C.</li>
		<li>Shake the bag for degelling by gently tapping on the bag when the bag is resting on a flat surface.</li>
		<li>Filter the 5% platelet lysates medium by pulling the lysates through the filter of the transfusion system with a sterile 50 mL syringe.</li>
		<li>Aliquot the medium in 50 mL tubes and store in -80 &#176;C until use. 
		NOTE: Every new batch of platelet lysates is tested in cell culture and compared to the previous batch by growing cells of interest (bmMSCs or kPSCs) to confluency in both batches. In cell numbers and viability, the kPSCs or bmMCs grown in the new batch should not differ more than 10%, and the marker expression of CD73, CD90, CD105 and CD31, CD34 and CD45 as analyzed by flow cytometry should not differ. The methods of cell culture are described in section 6 of the protocol (Culture of kPSC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Preparations for Cell Harvest
<ol>
	<li>Preparation of solutions.
	<ol>
		<li>Prepare the plain medium by adding 10 mL of pen/strep to 500 mL (1 bottle) of Dulbecco&#39;s Minimum Essential Medium (DMEM)-F12.</li>
		<li>Prepare the washing medium by adding 50 mL of Normal Human Serum (NHS) and 10 mL of pen/strep to 1 bottle of DMEM-F12.</li>
		<li>Prepare the enzyme-stock buffer by adding 2.9 mL 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1.2 mL NaHCO3 2.5% [w/v] and 160 &#181;L CaCl2 (1 M) to 160 mL University of Wisconsin solution.</li>
		<li>Prepare the collagenase solution by slowly adding 20 mL of enzyme stock buffer to the bottle of GMP-grade collagenase containing &#62;2,000 U/bottle collagenase. Dissolve at 4 &#176;C for approximately 40 min. Gently shake several times during the dissolving period.</li>
		<li>Prepare the freeze medium by adding 5 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) to 45 mL NHS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparation of perfusion tray (Figure 1A).
	<ol>
		<li>Clean the flow cabin and cover with surgical drapes. Heat a water bath to approximately 40 - 45 &#176;C to heat the perfusion tray to 37 &#176;C. Put on surgical gowns and surgical gloves.</li>
		<li>Connect a sterilized perfusion tray to the water bath to preheat the perfusion tray with warm water. Make sure that there is no air in the perfusion tray by starting with the perfusion tray in the vertical position. If necessary add more water to the water bath to prevent air infusion into the perfusion tray.</li>
		<li>Place the LS25 tube in the pump. Leave both sterile ends of the tube in the flow cabinet. Place a Kocher&#39;s forceps on one end of the tube and allow to rest on the bottom of the perfusion tray. Place a sterile gauze on top of the tube to prevent obstruction. Attach a Luer connector on the other tube end.</li>
		<li>Add approximately 100 mL of plain medium into the perfusion tray and start flushing the tube on a pump speed of 100 mL/min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kidney Cell Isolation
<ol>
	<li>Preparation of the kidney.
	<ol>
		<li>Remove the kidney from the double sterile bags and place on the sterile perfusion tray (Figure 1B). Remove the perirenal adipose tissue and kidney capsule with scissors and gentle tearing (Figure 1C) and identify the renal artery on the aortic patch as shown in Figure 1D.</li>
		<li>Cannulate the renal artery with the accessory spike, fix with a sterilized tie-rip, and attach to the pump tube end with the Luer connector while the pump is on. If the tubes are not completely filled, first add more medium to the tray and flush tubes by starting the pump (Figure 1E - F). Flush the kidney with plain medium via the pump with a flow of 100 mL/min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Collagenase treatment and kidney cell isolation.
	<ol>
		<li>Add collagenase (20 mL, &#62;2,000 U) and DNase (2.5 mL, 1 mg/mL) to the perfusion tray (Figure 1G). Turn the kidney from time to time gently by hand. Wait until the kidney becomes soft and the perfusion liquid becomes less transparent (approximately 30 - 40 min).</li>
		<li>Gently massage the kidney (Figure 1H) until a cell suspension is obtained (Figure 1I). Remove non-digested material and the spike in the renal artery.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Washing and collection of kidney cells.
	<ol>
		<li>Add 50 mL of the NHS to the cell suspension. Drain the cell suspension from the perfusion tray by putting the pump at low flow and placing the tube first connected to the kidney above the 50 mL tubes (Figure 1J).</li>
		<li>Centrifuge at 300 x g for 7 min at 4 &#730;C and remove the supernatant. Wash the pellets with washing medium containing 10% NHS and again centrifuge at 300 x g for 7 min. Repeat washing once more. Measure the volume of the cell pellets and add an equal volume of cell culture medium.</li>
		<li>Either cryopreserve the cells from here by adding freezing medium 1:1 to the cell suspension and store in cryogenic vials according to standard protocols, or continue to culture the cells (section 4). 
		NOTE: The cell suspension contains cell clumps and requires extra steps to obtain single cells, which results in an increase in cell death. Therefore, the cells are kept in suspension and are not counted at this stage.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Cell Culture of Crude Kidney Cells
<ol>
	<li>Add approximately 1 mL of the cell suspension to 24 mL of alphaMEM 5% platelet lysates (cell culture medium) in a T175 cell culture flask (Figure 1K) and culture at 37 &#176;C, 5% CO2. Remove the medium and cell debris after 2 d&#160;from the adherent cells and refresh the medium with 25 mL of cell culture medium.</li>
	<li>Refresh the culture medium twice a week by removing half of the medium (12.5 mL) and adding fresh medium (12.5 mL) using aseptic techniques.</li>
	<li>Culture until confluent (usually 5 - 7 d) (Figure 1L). Remove the medium, wash twice with PBS and trypsinize the cells by adding 5 mL trypsin to each T175 flask for 5 min at 37 &#176;C. Wash in culture medium and centrifuge at 490 x g for 5 min and remove the supernatant.</li>
</ol>
5. Cell Enrichment for NG2 by Magnetic Cell Separation (Figure 1M)
<ol>
	<li>Prepare the cell separation buffer according to manufacturer&#39;s protocol.</li>
	<li>Resuspend the trypsinized kPSCs in 10 mL cell separation buffer. Centrifuge at 490 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the cells in 300 &#181;L cell separation buffer.</li>
	<li>Add 100 &#181;L FcR blocking reagen/5 x 107 cells, add 100 &#181;L anti-melanoma (NG2) beads per 5 x 107 cells, and incubate for 30 min at 4 &#176;C. Separate the NG2-positive fraction according to manufacturer&#39;s protocol. Add 10 mL of medium and centrifuge cells for 5 min at 490 x g.</li>
	<li>Count the cells using a B&#252;rker counting chamber according to manufacturer&#39;s protocol. Seed the cells in a culture flask (approximately 4 x 103 cells/cm2) and incubate. 
	NOTE: Seed the cells in the following concentrations: &#60;250,000 in a T25 flask, 250,000 - 500,000 in a T75 flask, and 700,000 - 800,000 in a T175 flask. After magnetic cell enrichment, a positive fraction of approximately 1 - 2% is isolated. However, as this step is cell enrichment and not cell sorting, other cell types will be present in the culture (Figure 1N). After several passages (usually around 4 - 5), only a homogenous kPSC-population is present (Figure 1P).</li>
</ol>
6. Culture of kPSCs
<ol>
	<li>Refresh the medium twice a week by removing half of the medium and replace it with freshly thawed culture medium (Figure 1N). 
	NOTE: The kPSCs tend to be more viable and proliferative when only half of the medium is refreshed.</li>
	<li>Passaging of kPSCs. 
	NOTE: Passage the kPSCs at either 90 - 100% confluency, or when 3D structures appear (see Figure 1O), or when there hasn&#39;t been cell growth for more than a week. The latter two particularly might occur at early passages after cell enrichment. In this case, after passaging, the cells will usually start to grow again in monolayer culture (Figure 1P).
	<ol>
		<li>Remove the medium from the 90 - 100% confluent cells (keep the medium for later use). Wash the flask twice with PBS (1 mL in T25, 5 mL in T75, 10 mL in T175). Add trypsin (0.5 mL in T25, 2 mL in T75, 5 mL in T175) and incubate for 5 min at 37 &#176;C. Add the old medium to the flask and resuspend gently.</li>
		<li>Transfer to a 15&#160;or 50 mL tube (depending on the volume) and centrifuge at 490 x g for 5 min. Count the viable cells and plate &#60;250,000 in a T25, 250,000 - 500,000 in a T75, or 700,000 - 800,000 in a T175 (approximately 4 x 103 cells/cm2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test the kPSCs at passage 5 or 6 (e.g., scratch assay, section 7). 
	NOTE: Characterize the propagated cells by flow cytometry using standard protocols. Marker expression of NG2, PDGFR-&#946;, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC should all be positive and CD31, CD34, CD45 and HLA-DR should be negative. Test for mycoplasma, bacteria and fungi in the culture medium according to standard protocols of the clinical microbiology lab. Test the kPSCs functionally in a kidney epithelial wound scratch assay. Experiments are usually performed with sterile, flow cytometry-confirmed homogeneous kPSC populations with wound healing capacity between passage 6-8.</li>
	<li>Cryopreserve the kPSCs by adding 0.5 mL cryopreservation medium to 0.5 mL cell suspension (2 million cells per mL of culture medium) using standard protocols. 
	NOTE: After thawing, seed the kPSCs at a higher density (106&#160;cells in a T175).</li>
</ol>
7. Functional Test of kPSCs: Kidney Epithelial Wound Scratch Assay
<ol>
	<li>Culture the kPSCs in a 6-well plate at a density of 200,000 cells/well in 2 mL culture medium. After 48 h of culture at 37 &#176;C, 5% CO2, collect the supernatant. This is the conditioned medium.</li>
	<li>Seed the HK-2 (proximal tubular epithelial cells)17 in 2 mL of Proximal Tubular Epithelial Cell (PTEC) medium consisting of a 1:1 ratio of DMEM-F12 supplemented with insulin (5 mg/mL), transferrin (5 mg/mL), selenium (5 ng/mL), hydrocortisone (36 ng/mL), triiodothyrinine (40 pg/mL), epidermal growth factor (10 ng/mL) and pen/strep, in a density of 500,000 cells per well in a 6-well cell culture plate.</li>
	<li>Culture for 48 h at 37 &#176;C, 5% CO2. Remove the cell culture medium of the HK-2s and create a scratch wound in the monolayer of HK-2s by making a scratch with the tip of a yellow pipette point from the top to the bottom of the well. Wash the HK-2s with PBS and add the conditioned medium of the kPSCs or control medium. Mark on the bottom of the plate the area to be imaged. 
	NOTE: The HK-2s should be confluent. Image two areas per well.</li>
	<li>Image the scratch at 4, 8, 12 and 24 h at the same marked position with an inverted bright-field microscope.</li>
	<li>Measure the scratch area in Image J using the polygon selection tool to determine the percentage of closure.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+for+fibroblasts+in+different+populations+of+hematopoietic+cells+as+detected+by+the+in+vitro+colony+assay+method.">Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.</a> Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Pittenger, M. 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D.G.L., M.A.E., und T.J.R. mit einer Patentanmeldung bezüglich dieser Forschung verbunden sind. Die anderen Autoren haben nichts preisgeben.

Perivaskuläre Zellen wurden von vielen verschiedenen menschlichen solide Organe, einschließlich Fett, Knorpel, Bauchspeicheldrüse und Niere9,15,16isoliert. Die meisten Methoden basieren jedoch auf kleine Proben von Gewebe, die seziert und danach mit Verdauungsenzymen behandelt. Darüber hinaus erfolgt dies in der Regel nicht mit klinischen Grade Produkte. Dies macht diese Strategien weniger geeignet für direkte klinische Übersetzung befinden sich große Mengen an klinischen Grade Zellen notwendig.
Hier zeigen wir eine neuartige Isolationsmethode des menschlichen kPSCs für ganze Organe anhand der Perfusion mit klinischen Grade Enzyme und Materialien. Das Protokoll ist vom klinischen Langerhans-Inseln Isolierung Protokoll derzeit im Einsatz für die klinische Anwendung in unserem Zentrum18angepasst.
Dies ist die erste klinische Grade-Methode, wo große Mengen von kPSCs erreicht werden können. Die Variabilität der Zellausbeute ist weitgehend Geber angewiesen. Wenn die Zellausbeute erhalten wir derzeit von einem Bruchteil der rohen Zellsuspension von drei verschiedenen Gebern, in der Theorie extrapoliert ist konnte eine durchschnittliche Rendite von 2,7 x 1012 kPSCs pro Spender erreicht werden. MSC-Therapie besteht in der Regel aus 2 Zelle Infusionen mit 1-2 x 106 Zellen/kg Körper Gewicht4, genügen diese Zellzahlen allogene Behandlung von mehreren Patienten.
Ein entscheidender Schritt in der Isolierung-Prozedur ist die Dauer der Kollagenase Verdauung. Wenn die Verdauung Periode zu kurz ist, bleiben große Klumpen des Gewebes, die schwerer zu Kultur werden. Wenn die Perfusion Periode zu lang ist, kann erhöhte Zelltod beobachtet werden. Daher, sobald die Niere weich und die Flüssigkeiten weniger transparent zu werden beginnt, die Niere sollte sanft massiert und die Kollagenase-Behandlung abgebrochen werden sollte.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Kultur der Zellen nach der NG2 Zelle Bereicherung. Manchmal nach der NG2 Zelle Bereicherung starten die perivaskuläre Zellen nicht zu vermehren oder in 3D Strukturen zu wachsen beginnen. In diesem Fall wenn die Zellen trypsiniert und eingesät, startet die Zellen in der Regel in Monolayer Kultur wachsen.
Als Ausgangsmaterial, dienten menschliche Transplantation Grade Nieren hauptsächlich aus chirurgischen Gründen verworfen. Dies sind funktionelle Organe ohne großen Fibrose. Wir anerkennen, dass dies möglicherweise eine Einschränkung, da dies eine relativ seltene und schwer zu Orgel Quelle zu erhalten. Explantierten Nieren möglicherweise eine andere Quelle; jedoch, je nach dem Grund der Niere Explantation diese Nieren enthalten mehr Fibrose und somit Myofibroblasts, und daher vorsichtig vorzugehen, da Myofibroblasts könnten isoliert und statt perivaskuläre Zellen kultiviert.
Wie die kPSCs isoliert mit diesem Protokoll Show Organo-typisches Eigenschaften mit Niere epithelialen Wunde heilende Fähigkeiten15, Zell-Therapie mit kPSCs bei Nierenerkrankungen und Transplantation wäre eine interessante zukünftige Anwendung. Zu diesem Zweck gibt es mehrere Strategien der Zelle/Zelle Produktlieferung. Die erste Strategie ist IV-Infusion von kPSCs, wie derzeit in klinischen Studien BmMSC verwendet. Eine weitere interessante Anwendung ist die Verwendung von kPSCs oder kPSC ausgeschieden Faktoren bei der Perfusion der Maschine vor der Transplantation. Auf diese Weise könnte die Qualität der explantierten Niere verbessern die nach der Transplantation zu verbesserten Nierenfunktion führen könnten. Für beide Strategien sind kPSCs eine interessante neue Zelle Quelle für klinische Zwecke weiter zu erkunden.

Mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) sind modulierende Immunzellen, die ursprünglich aus dem Knochenmark isoliert wurden. Sie zeichnen sich durch ihre Spindel förmigen Morphologie, Fähigkeit, in Fett, Knochen und Knorpel und Kunststoff Termintreue zu unterscheiden. MSCs express die stromale Marker CD73, CD90, CD105 und negativ für die Marker CD31 und CD451,2,3. MSCs sind ein viel versprechender Kandidat für die Zelltherapie aufgrund ihrer Gewebe homöostatische und immunmodulatorische Kapazitäten. BmMSCs werden derzeit in klinischen Studien für verschiedene Krankheiten, einschließlich Nierenerkrankungen und Nierentransplantation wie an anderer Stelle überprüft4geprüft.
Bisher zeigte sich, dass perivaskuläre Zellen aus mehreren verschiedenen solide Organe, einschließlich Fettgewebe, Plazenta und Skelettmuskulatur mit MSCs9Merkmale teilen. Allerdings zeigen diese Zellen auch Gewebe-spezifische Funktionen die organotypischen Reparatur10führen kann. Menschlichen myokardialen perivaskuläre Zellen, z. B. angeregt angiogenen Antworten nach Hypoxie und differenziert in Kardiomyozyten, während perivaskuläre Zellen isoliert von anderen Geweben nicht diese Potenziale11zeigte.
Perivaskuläre Stromazellen Zellen können auch von der Maus12,13,14 und menschliche Niere15,16isoliert werden. Wir haben ausgiebig gekennzeichnet kPSCs und verglich diese mit BmMSCs. Wir festgestellt, dass kPSCs, ähnlich wie BmMSCs, immunsuppressive Kapazitäten und vaskulären Plexus Bildung unterstützen können. Allerdings gibt es Unterschiede zwischen der Zelltypen als kPSCs zeigte eine organotypischen transkriptionelle Ausdruck Signatur, einschließlich der nephrogenen Transkriptionsfaktoren, HoxD10 und HoxD11 Gewebe. kPSCs, im Gegensatz zu BmMSCs, nicht unterziehen, Myofibroblast Transformation nach Stimulation mit TGF-β und waren nicht in der Lage, sich in Adipozyten differenzieren. Darüber hinaus beschleunigt kPSCs epitheliale Integrität in einem Nieren röhrenförmige epithelialen Wunde kratzen Assay, ein Phänomen, das nicht mit BmMSCs beobachtet wurde. Diese erweiterten Wunde Reparatur wurde durch Hepatozyten-Wachstumsfaktor Freisetzung vermittelt. Darüber hinaus verbessert kPSCs Niere Verletzungen in einem Mausmodell der akuten Nierenversagens Verletzungen15. Daher kPSCs überlegene renal Reparatur Kapazitäten zu haben scheinen und sind eine interessante neue Quelle für die Zelltherapie bei Nierenerkrankungen.
Um kPSCs Zelle Therapie Zwecken nutzen zu können, sollte kPSCs in gewissem Sinne klinische Grade mit klinischen Grade Enzyme und Protokollen isoliert werden. Um mehrere Patienten mit kPSCs von 1 Spender behandeln zu können, sollte darüber hinaus ausreichend Zellzahlen erzielt werden. Hier zeigen wir im Detail, das klinische Grade isoliert Verfahren der kPSCs von ganzen Transplantation Grade Nieren, nachgiebig ausreichende Zahl von Zellen für Klinische Zelltherapie verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="619">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Baxter bags</td>
			<td style="width:117px;">Fenwal</td>
			<td style="width:119px;">R4R-7004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human platelets</td>
			<td>Sanquin</td>
			<td></td>
			<td>hospital surplus material expired for less than 2 days is used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">platelet lysate</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable sterile bottles</td>
			<td style="width:117px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">09-761-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500ml PP centrifuge tubes</td>
			<td style="width:117px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">a-MEM medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glutamax</td>
			<td style="width:117px;">thermo fisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pen/strep&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">transfusion system</td>
			<td>Codan</td>
			<td>455609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM-F12</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>11320-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">normal human serum</td>
			<td style="width:117px;">Sanquin</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes 1M</td>
			<td style="width:117px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE-17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3 7.5%</td>
			<td style="width:117px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-613E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 1M</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UW</td>
			<td style="width:117px;">Bridge to life</td>
			<td style="width:119px;">32911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td style="width:117px;">Leo Pharma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">collagenase NB1 GMP grade</td>
			<td>SERVA</td>
			<td style="width:119px;">17455.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">surgical drapes</td>
			<td style="width:117px;">3M Nederland</td>
			<td style="width:119px;">DH999969404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">perfusion pump</td>
			<td>metrohm</td>
			<td>x007528300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pump head</td>
			<td>metrohm</td>
			<td>x077202600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">perfusion tray</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS25 masterflex tubes</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-96410-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">accessory spike</td>
			<td style="width:117px;">Gambro DASCO</td>
			<td style="width:119px;">6038020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pulmozyme</td>
			<td style="width:117px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:117px;">greiner</td>
			<td style="width:119px;">690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture flask 75 cm2</td>
			<td style="width:117px;">greiner</td>
			<td style="width:119px;">658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">culture flask 175 cm2</td>
			<td style="width:117px;">greiner</td>
			<td style="width:119px;">661160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>t4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FcR blocking reagent</td>
			<td>miltenyi</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti melanoma beads (NG2)</td>
			<td>miltenyi</td>
			<td>130-090-452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cellstrainer 70 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LS columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS magnet</td>
			<td style="width:117px;">miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD34 FITC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45 APC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>555485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD146 PE</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>550315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NG2 APC</td>
			<td style="width:117px;">R&#38;D</td>
			<td>FAB2585A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD90 PE</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>555596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HLA ABC APC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>555555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD105 FITC</td>
			<td>Ancell</td>
			<td>326-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HLA DR APC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>559866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD56 PE</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>555516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD73 PE</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>550257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD31 FITC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>555445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD133 PE</td>
			<td style="width:117px;">miltenyi</td>
			<td>130-090-853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PDGF-r&#160;</td>
			<td style="width:117px;">R&#38;D</td>
			<td>mab 1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IgG1 FITC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>345815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IgG1 PE</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>345816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IgG1 APC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>345818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IgG2b PE</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>555743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">goat anti mouse PE</td>
			<td style="width:117px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">R0480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">Merck</td>
			<td>822335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITS (insul, transferrin, selenium)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td>I1884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">triiodothyrinine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">epidermal growth factor</td>
			<td>sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immortalized human renal PTEC (HK2)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td>courtesey of M. Ryan, university college Dublin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel clinical grade isolation method for human kidney perivascular stromal cells

Mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) sind homöostatische und Immunsystem modulierende Gewebezellen, die wohltuende Wirkung bei Nierenerkrankungen und Transplantation gezeigt haben. Perivaskuläre Stromazellen Zellen (EAP) teilen Eigenschaften mit Knochenmark MSCs (BmMSCs). Jedoch besitzen sie auch, wahrscheinlich aufgrund lokaler Prägung, Gewebe-spezifische Eigenschaften und spielen eine Rolle bei der lokalen Gewebe Homöostase. Diese Gewebespezifität führen bestimmte Gewebereparatur, auch innerhalb der menschlichen Niere. Wir zeigten bisher, dass menschliche Niere EAP (kPSCs) Niere epitheliale Wundheilung während BmMSCs nicht dieses Potenzial hatte verbessert haben. Darüber hinaus können kPSCs Niere Verletzungen in Vivolindern. Daher bilden kPSCs eine interessante Quelle für Zelltherapie, insbesondere für Nierenerkrankungen und Nierentransplantation. Hier zeigen wir die detaillierte Isolation und Kultur-Methode für kPSCs von Transplantation-Grade menschliche Nieren basierend auf ganze Organ Perfusion von Verdauungs-Enzymen über die Nierenarterie und Bereicherung für die perivaskuläre Marker NG2. Auf diese Weise großzellige Mengen erhalten, die für die zelluläre Therapie eignen.

Die klinische Grade kPSCs Isolationsmethode ist in Abbildung 1zusammengefasst. Grobe Nierenzellen sind von menschlichen Transplantation Grade Nieren von Kollagenase Perfusion isoliert. Die daraus resultierende Zellsuspension ist bis zum Zusammenfluss in 5 % Thrombozyten Lysates kultiviert. Dann ist die perivaskuläre Stromazellen Zelle Bruchteil isoliert basierend auf NG2 Ausdruck.
kPSCs sind aus Kunststoff anhaftende spindelförmige Zellen (Abb. 2A) und positiv für die stromale Marker CD73, CD90, CD105 und perivaskuläre Marker NG2, PDGFR-B und CD146, während negativ für CD31, CD34, CD45 und HLA-DR (Abbildung 2B). In der Regel eine homogene Bevölkerung von kPSCs erreichen Sie in der Passage 4 und kPSCs erreichen Seneszenz um Durchgang 9-10 (Abbildung 2C). Wir empfehlen daher Experimente zwischen 5-8 Durchgang durchführen.
Um die Funktionsfähigkeit der isolierten kPSCs zu bewerten, führen wir einen in-vitro- Niere epithelialen Wunde kratzen Assay auf jede neue Charge von kPSCs, wie zuvor gezeigt, dass die konditionierte Medium der kPSCs beschleunigen kann epitheliale Wundheilung in dieser Kratzer Assay-15. Das kPSC konditionierten Medium erfolgt durch Kultivierung kPSCs für 48 h in AlphaMEM 5 % Thrombozyten Lysates und den Überstand zu sammeln. Als nächstes verewigt menschliche Niere proximale Röhrchen Epithelzellen (HK-2)17 sind bis zum Zusammenfluss kultiviert und dann Kratzen Wunde gemacht. Dann entweder die konditionierte Medium der kPSCs oder Kontrolle Medium wird hinzugefügt, um die Brunnen und die Geschwindigkeit der Wundheilung wird gemessen. Wenn die konditionierte Medium der kPSCs hinzugefügt wird, schließt die Wunde deutlich schneller (Abbildung 2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Klinische Grade Isolation Methode des menschlichen kPSCs. Transplantation Grade Nieren sind kanülierte durchströmt mit Kollagenase über die Nierenarterie (A - G) und die daraus resultierende Zellsuspension wird gewaschen und entweder kryokonserviert oder in Kultur (H - K). Nachdem die Zellen Konfluenz (L) erreicht haben, durchgeführt NG2 Zelle Bereicherung ist (M). Zellen sind trypsiniert wenn sie entweder konfluierende, sind nicht mehr vermehren oder wenn 3D-Strukturen (N - P) angezeigt. Die Freigabekriterien für kPSCs sind Sterilität, Marker Ausdruck und die Fähigkeit, röhrenförmigen epitheliale Wundheilung (Q) zu verbessern. Pfeil: Nierenarterie. Maßstabsleiste = 200 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Charakterisierung des menschlichen kPSCs. Ein) kPSCs sind spindelförmig, Kunststoff adhärente Zellen. ( B) kPSCs sind positiv für mesenchymalen Marker CD73, CD90, CD105, perivaskuläre Marker NG2, PDGFR-β und CD146, während negativ für CD31, CD34 und CD45. kPSCs express MHC-Klasse ich (HLA-ABC) jedoch keine Klasse II (HLA-DR). ( C) Wuchsmerkmalen von drei verschiedenen kPSC Spender aus Durchflusszytometrie bestätigt homogene NG2 positive Populationen (Abschnitt 4). kPSCs erreichen Seneszenz um Durchgang 9-10. D) kPSCs sind in der Lage, Niere epithelialen Reparatur in einer Wunde kratzen Assay zu verbessern. Repräsentative Bilder von Kontrolle und kPSC bedingt Medium bei t = 0, 4, 8 und 12 h gezeigt. Maßstabsleiste a) = 200 µm, in D) = 100 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Hier präsentieren wir eine neue klinische Grade Isolation und Kultur Methode zur Niere perivaskuläre Stromazellen Zellen (kPSCs) anhand der gesamten Organ Perfusion mit Verdauungsenzymen und NG2-Zelle Bereicherung. Mit dieser Methode ist es möglich, ausreichende Zellzahlen für Zelltherapie erwerben.

Eine neue klinische Grade Isolationsmethode für menschliche Niere perivaskuläre Stromazellen Zellen

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

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