Name: a novel clinical grade isolation method for human kidney perivascular stromal cells
Uploaded: 2017-08-07T13:00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells at JoVE.com

Это исследование получил финансирование от Европейского сообщества, седьмой рамочной программы (FP7/2007-2013) под Грант номер договора 305436 STELLAR.

The local medical ethical committee and ethical advisory board of the European consortium (STELLAR) approved the research and collection of human transplant grade kidneys discarded mainly for surgical reasons. Research consent was given for all kidneys.
1. Preparations for Cell Culture
<ol>
	<li>Prepare a pool of platelet lysates.
	<ol>
		<li>Store the platelets that have expired for less than 2 d in -80 &#176;C until use (for a maximum of 1 year). 
		NOTE: The platelets were originally sourced from a commercial vendor. Hospital surplus material distributed by the local blood bank were obtained.</li>
		<li>Thaw the platelets of at least 5 donors (preferably 10) O/N at 4 &#176;C.</li>
		<li>Pool the platelets in a large sterile bottle, transfer to conical centrifuge tubes and spin down for 10 min at 1,960 x g at 4 &#176;C. 
		NOTE: The volume of platelets depends on the number of donors and the amount of hospital surplus material per donor.</li>
		<li>Pipette the supernatant to blood bags (50 mL/bag) through the barrel of a 50 mL syringe. Store at -80 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparation of cell culture medium.
	<ol>
		<li>Defrost one bag of platelet lysates in a water bath at 37 &#176;C.</li>
		<li>Add 1 L (i.e. 2 bottles) of Minimum Essential Medium - alpha modification (alphaMEM), 5 mL 200 mM glutamine, and 20 mL of penicillin (5,000 U/mL)/streptomycin (5,000 &#181;g/mL) (pen/strep) to the bag.</li>
		<li>Incubate for 3 h at 37 &#176;C.</li>
		<li>Shake the bag for degelling by gently tapping on the bag when the bag is resting on a flat surface.</li>
		<li>Filter the 5% platelet lysates medium by pulling the lysates through the filter of the transfusion system with a sterile 50 mL syringe.</li>
		<li>Aliquot the medium in 50 mL tubes and store in -80 &#176;C until use. 
		NOTE: Every new batch of platelet lysates is tested in cell culture and compared to the previous batch by growing cells of interest (bmMSCs or kPSCs) to confluency in both batches. In cell numbers and viability, the kPSCs or bmMCs grown in the new batch should not differ more than 10%, and the marker expression of CD73, CD90, CD105 and CD31, CD34 and CD45 as analyzed by flow cytometry should not differ. The methods of cell culture are described in section 6 of the protocol (Culture of kPSC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Preparations for Cell Harvest
<ol>
	<li>Preparation of solutions.
	<ol>
		<li>Prepare the plain medium by adding 10 mL of pen/strep to 500 mL (1 bottle) of Dulbecco&#39;s Minimum Essential Medium (DMEM)-F12.</li>
		<li>Prepare the washing medium by adding 50 mL of Normal Human Serum (NHS) and 10 mL of pen/strep to 1 bottle of DMEM-F12.</li>
		<li>Prepare the enzyme-stock buffer by adding 2.9 mL 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1.2 mL NaHCO3 2.5% [w/v] and 160 &#181;L CaCl2 (1 M) to 160 mL University of Wisconsin solution.</li>
		<li>Prepare the collagenase solution by slowly adding 20 mL of enzyme stock buffer to the bottle of GMP-grade collagenase containing &#62;2,000 U/bottle collagenase. Dissolve at 4 &#176;C for approximately 40 min. Gently shake several times during the dissolving period.</li>
		<li>Prepare the freeze medium by adding 5 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) to 45 mL NHS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparation of perfusion tray (Figure 1A).
	<ol>
		<li>Clean the flow cabin and cover with surgical drapes. Heat a water bath to approximately 40 - 45 &#176;C to heat the perfusion tray to 37 &#176;C. Put on surgical gowns and surgical gloves.</li>
		<li>Connect a sterilized perfusion tray to the water bath to preheat the perfusion tray with warm water. Make sure that there is no air in the perfusion tray by starting with the perfusion tray in the vertical position. If necessary add more water to the water bath to prevent air infusion into the perfusion tray.</li>
		<li>Place the LS25 tube in the pump. Leave both sterile ends of the tube in the flow cabinet. Place a Kocher&#39;s forceps on one end of the tube and allow to rest on the bottom of the perfusion tray. Place a sterile gauze on top of the tube to prevent obstruction. Attach a Luer connector on the other tube end.</li>
		<li>Add approximately 100 mL of plain medium into the perfusion tray and start flushing the tube on a pump speed of 100 mL/min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kidney Cell Isolation
<ol>
	<li>Preparation of the kidney.
	<ol>
		<li>Remove the kidney from the double sterile bags and place on the sterile perfusion tray (Figure 1B). Remove the perirenal adipose tissue and kidney capsule with scissors and gentle tearing (Figure 1C) and identify the renal artery on the aortic patch as shown in Figure 1D.</li>
		<li>Cannulate the renal artery with the accessory spike, fix with a sterilized tie-rip, and attach to the pump tube end with the Luer connector while the pump is on. If the tubes are not completely filled, first add more medium to the tray and flush tubes by starting the pump (Figure 1E - F). Flush the kidney with plain medium via the pump with a flow of 100 mL/min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Collagenase treatment and kidney cell isolation.
	<ol>
		<li>Add collagenase (20 mL, &#62;2,000 U) and DNase (2.5 mL, 1 mg/mL) to the perfusion tray (Figure 1G). Turn the kidney from time to time gently by hand. Wait until the kidney becomes soft and the perfusion liquid becomes less transparent (approximately 30 - 40 min).</li>
		<li>Gently massage the kidney (Figure 1H) until a cell suspension is obtained (Figure 1I). Remove non-digested material and the spike in the renal artery.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Washing and collection of kidney cells.
	<ol>
		<li>Add 50 mL of the NHS to the cell suspension. Drain the cell suspension from the perfusion tray by putting the pump at low flow and placing the tube first connected to the kidney above the 50 mL tubes (Figure 1J).</li>
		<li>Centrifuge at 300 x g for 7 min at 4 &#730;C and remove the supernatant. Wash the pellets with washing medium containing 10% NHS and again centrifuge at 300 x g for 7 min. Repeat washing once more. Measure the volume of the cell pellets and add an equal volume of cell culture medium.</li>
		<li>Either cryopreserve the cells from here by adding freezing medium 1:1 to the cell suspension and store in cryogenic vials according to standard protocols, or continue to culture the cells (section 4). 
		NOTE: The cell suspension contains cell clumps and requires extra steps to obtain single cells, which results in an increase in cell death. Therefore, the cells are kept in suspension and are not counted at this stage.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Cell Culture of Crude Kidney Cells
<ol>
	<li>Add approximately 1 mL of the cell suspension to 24 mL of alphaMEM 5% platelet lysates (cell culture medium) in a T175 cell culture flask (Figure 1K) and culture at 37 &#176;C, 5% CO2. Remove the medium and cell debris after 2 d&#160;from the adherent cells and refresh the medium with 25 mL of cell culture medium.</li>
	<li>Refresh the culture medium twice a week by removing half of the medium (12.5 mL) and adding fresh medium (12.5 mL) using aseptic techniques.</li>
	<li>Culture until confluent (usually 5 - 7 d) (Figure 1L). Remove the medium, wash twice with PBS and trypsinize the cells by adding 5 mL trypsin to each T175 flask for 5 min at 37 &#176;C. Wash in culture medium and centrifuge at 490 x g for 5 min and remove the supernatant.</li>
</ol>
5. Cell Enrichment for NG2 by Magnetic Cell Separation (Figure 1M)
<ol>
	<li>Prepare the cell separation buffer according to manufacturer&#39;s protocol.</li>
	<li>Resuspend the trypsinized kPSCs in 10 mL cell separation buffer. Centrifuge at 490 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the cells in 300 &#181;L cell separation buffer.</li>
	<li>Add 100 &#181;L FcR blocking reagen/5 x 107 cells, add 100 &#181;L anti-melanoma (NG2) beads per 5 x 107 cells, and incubate for 30 min at 4 &#176;C. Separate the NG2-positive fraction according to manufacturer&#39;s protocol. Add 10 mL of medium and centrifuge cells for 5 min at 490 x g.</li>
	<li>Count the cells using a B&#252;rker counting chamber according to manufacturer&#39;s protocol. Seed the cells in a culture flask (approximately 4 x 103 cells/cm2) and incubate. 
	NOTE: Seed the cells in the following concentrations: &#60;250,000 in a T25 flask, 250,000 - 500,000 in a T75 flask, and 700,000 - 800,000 in a T175 flask. After magnetic cell enrichment, a positive fraction of approximately 1 - 2% is isolated. However, as this step is cell enrichment and not cell sorting, other cell types will be present in the culture (Figure 1N). After several passages (usually around 4 - 5), only a homogenous kPSC-population is present (Figure 1P).</li>
</ol>
6. Culture of kPSCs
<ol>
	<li>Refresh the medium twice a week by removing half of the medium and replace it with freshly thawed culture medium (Figure 1N). 
	NOTE: The kPSCs tend to be more viable and proliferative when only half of the medium is refreshed.</li>
	<li>Passaging of kPSCs. 
	NOTE: Passage the kPSCs at either 90 - 100% confluency, or when 3D structures appear (see Figure 1O), or when there hasn&#39;t been cell growth for more than a week. The latter two particularly might occur at early passages after cell enrichment. In this case, after passaging, the cells will usually start to grow again in monolayer culture (Figure 1P).
	<ol>
		<li>Remove the medium from the 90 - 100% confluent cells (keep the medium for later use). Wash the flask twice with PBS (1 mL in T25, 5 mL in T75, 10 mL in T175). Add trypsin (0.5 mL in T25, 2 mL in T75, 5 mL in T175) and incubate for 5 min at 37 &#176;C. Add the old medium to the flask and resuspend gently.</li>
		<li>Transfer to a 15&#160;or 50 mL tube (depending on the volume) and centrifuge at 490 x g for 5 min. Count the viable cells and plate &#60;250,000 in a T25, 250,000 - 500,000 in a T75, or 700,000 - 800,000 in a T175 (approximately 4 x 103 cells/cm2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test the kPSCs at passage 5 or 6 (e.g., scratch assay, section 7). 
	NOTE: Characterize the propagated cells by flow cytometry using standard protocols. Marker expression of NG2, PDGFR-&#946;, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC should all be positive and CD31, CD34, CD45 and HLA-DR should be negative. Test for mycoplasma, bacteria and fungi in the culture medium according to standard protocols of the clinical microbiology lab. Test the kPSCs functionally in a kidney epithelial wound scratch assay. Experiments are usually performed with sterile, flow cytometry-confirmed homogeneous kPSC populations with wound healing capacity between passage 6-8.</li>
	<li>Cryopreserve the kPSCs by adding 0.5 mL cryopreservation medium to 0.5 mL cell suspension (2 million cells per mL of culture medium) using standard protocols. 
	NOTE: After thawing, seed the kPSCs at a higher density (106&#160;cells in a T175).</li>
</ol>
7. Functional Test of kPSCs: Kidney Epithelial Wound Scratch Assay
<ol>
	<li>Culture the kPSCs in a 6-well plate at a density of 200,000 cells/well in 2 mL culture medium. After 48 h of culture at 37 &#176;C, 5% CO2, collect the supernatant. This is the conditioned medium.</li>
	<li>Seed the HK-2 (proximal tubular epithelial cells)17 in 2 mL of Proximal Tubular Epithelial Cell (PTEC) medium consisting of a 1:1 ratio of DMEM-F12 supplemented with insulin (5 mg/mL), transferrin (5 mg/mL), selenium (5 ng/mL), hydrocortisone (36 ng/mL), triiodothyrinine (40 pg/mL), epidermal growth factor (10 ng/mL) and pen/strep, in a density of 500,000 cells per well in a 6-well cell culture plate.</li>
	<li>Culture for 48 h at 37 &#176;C, 5% CO2. Remove the cell culture medium of the HK-2s and create a scratch wound in the monolayer of HK-2s by making a scratch with the tip of a yellow pipette point from the top to the bottom of the well. Wash the HK-2s with PBS and add the conditioned medium of the kPSCs or control medium. Mark on the bottom of the plate the area to be imaged. 
	NOTE: The HK-2s should be confluent. Image two areas per well.</li>
	<li>Image the scratch at 4, 8, 12 and 24 h at the same marked position with an inverted bright-field microscope.</li>
	<li>Measure the scratch area in Image J using the polygon selection tool to determine the percentage of closure.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+for+fibroblasts+in+different+populations+of+hematopoietic+cells+as+detected+by+the+in+vitro+colony+assay+method.">Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.</a> Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li><li>Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+translation+of+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+in+transplantation.">Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation.</a> Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).</li><li>Reinders, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+allograft+rejection+after+renal+transplantation:+results+of+a+phase+I+study.">Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).</li><li>Perico, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+mesenchymal+stromal+cells+and+kidney+transplantation:+a+pilot+study+of+safety+and+clinical+feasibility.">Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).</li><li>Perico, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+and+kidney+transplantation:+pretransplant+infusion+protects+from+graft+dysfunction+while+fostering+immunoregulation.">Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation.</a> Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+living-related+kidney+transplants:+a+randomized+controlled+trial.">Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial.</a> JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Sacchetti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+Identical+"Mesenchymal+Stem+Cells"+at+Different+Times+and+Sites:+Human+Committed+Progenitors+of+Distinct+Origin+and+Differentiation+Potential+Are+Incorporated+as+Adventitial+Cells+in+Microvessels.">No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).</li><li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myocardial+pericytes:+multipotent+mesodermal+precursors+exhibiting+cardiac+specificity.">Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity.</a> Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).</li><li>Dekel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+nontubular+sca-1+lin-+multipotent+stem/progenitor+cells+from+adult+mouse+kidney.">Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting+duct-derived+cells+display+mesenchymal+stem+cell+properties+and+retain+selective+in+vitro+and+in+vivo+epithelial+capacity.">Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity.</a> J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).</li><li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities.">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).</li><li>Leuning, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical-Grade+Isolated+Human+Kidney+Perivascular+Stromal+Cells+as+an+Organotypic+Cell+Source+for+Kidney+Regenerative+Medicine.">Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Transl Med. , (2016).</li><li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+resident+mesenchymal+stem+cells+in+human+glomeruli.">Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli.</a> Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).</li><li>Ryan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HK-2:+an+immortalized+proximal+tubule+epithelial+cell+line+from+normal+adult+human+kidney.">HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney.</a> Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).</li><li>Nijhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycemic+Stability+Through+Islet-After-Kidney+Transplantation+Using+an+Alemtuzumab-Based+Induction+Regimen+and+Long-Term+Triple-Maintenance+Immunosuppression.">Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression.</a> Am J Transplant. , (2015).</li></ol>

D.G.L., M.A.E., и T.J.R. связаны с патентной заявки относительно этого исследования. Другие авторы имеют ничего не разглашать.

Периваскулярной клетки были изолированы от многих различных человека твердых органов, включая поджелудочной железы, жира, хряща и почек9,,1516. Большинство методов, однако, основаны на небольшие образцы ткани, которые анализировали и потом лечили пищеварительные ферменты. Кроме того это обычно не выполняется с клинической класс продуктов. Это делает эти стратегии менее подходит для прямого клинический перевод которых необходимо большое количество клинических класса клеток.
Здесь мы покажем Роман изоляции метод человеческого kPSCs для целых органов, основанные на перфузии с клинической класс ферментов и материалами. Протокол приспособлен от изоляции протокол клинических островков Лангерганса в настоящее время для клинического применения в нашем центре18.
Это первый метод клинического класса, где может быть достигнуто большое количество kPSCs. Изменчивость в ячейке урожайности является во многом зависит от доноров. Однако когда экстраполируется доходность клетки, которые мы в настоящее время получить от фракции сырой клеток подвеска трех различных доноров, в теории, средняя урожайность 2.7 x 10-12 kPSCs за доноров может быть достигнуто. Как MSC терапии обычно состоит из 2 клетки инфузии с 1-2 х 106 клеток/кг веса тела4, эти числа клеток являются достаточными для аллогенной лечения нескольких больных.
Один важный шаг в процедуре изоляции является продолжительность коллагеназы пищеварение. Когда задан слишком короткий период пищеварения, останется большие clumps из ткани, которая будет труднее культуры. Когда период перфузии является слишком долго, может наблюдаться увеличение клеточной гибели. Поэтому как только почка начинает становиться мягкой и менее прозрачной жидкости, функции почек следует осторожно массируют и коллагеназы лечение должно быть прекращено.
Другим важным шагом является культура клеток после обогащения клеток NG2. Иногда после обогащения клеток NG2 периваскулярной клетки не начинают размножаться или начинают расти в трехмерных структур. В этом случае когда клетки trypsinized и заполнения, клетки обычно начинают расти в монослойном культивировании.
Как исходный материал, были использованы человека трансплантации почки класс отбрасываются главным образом для хирургического. Это функциональных органов без крупных фиброз. Мы признаем, что это может быть ограничение, как это случается относительно редко и трудно получить орган источник. Описаны функции почек может быть еще одним источником; Однако в зависимости от причины эксплантация почек, эти почки может содержать больше фиброз и таким образом миофибробласты, и поэтому следует проявлять осторожность, поскольку миофибробласты могут быть изолированы и культивировали вместо периваскулярной клетки.
Как изолированные kPSCs с этим протоколом шоу органо Инт свойства с почкой эпителиальных раны исцеление потенциала15, клеточной терапии с kPSCs при заболеваниях почек и пересадки будет интересное будущее применение. Для этой цели существует несколько стратегий клеток/доставки продукции. Первая стратегия является IV вливания kPSCs, как в настоящее время используется в клинических исследованиях показано. Еще одна интересная приложения является использование kPSCs или экскретируется ССКП факторы перфузии машины до пересадки. Таким образом может улучшить качество explanted почки, которые могут привести к улучшению почки после пересадки. Для обеих стратегий kPSCs являются интересный новый источник клеток для дальнейшего изучения клинических целей.

Мезенхимальных стромальных клеток (МСК), модулирующее клетки иммунной системы, которые были первоначально выделены из костного мозга. Они характеризуются их шпинделя форме морфологии, способности дифференцироваться в жир, кости и хряща и пластиковые присоединения. MSCs Экспресс стромальные маркеры CD73, CD90, CD105 во время негативные для маркеров CD31 и CD451,2,3. MSCs являются перспективным кандидатом на клеточной терапии из-за их ткани гомеостаза и иммуномодулирующим потенциала. bmMSCs в настоящее время изучаются в клинических испытаниях для ряда заболеваний, включая заболевания почек и пересадки почки как обзор других4.
Ранее было показано, что периваскулярной клетки от нескольких различных твердых органов, включая жировой ткани, плаценты и скелетных мышц разделяют характеристик с MSCs9. Однако эти клетки также демонстрируют Ткани специальные функции, которые могут привести к organotypic ремонт10. Клетки человека миокарда периваскулярной, например, стимулировали ангиогенных ответы после гипоксии и дифференцированной в кардиомиоцитов, в то время как периваскулярной клетки изолированы от других тканей не показывать эти потенциалы11.
Периваскулярной стромальные клетки также могут быть изолированы от мыши12,13,14 и нарушениями функции почек15,16. Мы широко характеризуется kPSCs и сравнить их в bmMSCs. Мы обнаружили, что kPSCs, похож на bmMSCs, иммунодепрессивные потенциал и может поддерживать формирование сосудистого сплетения. Однако есть ткани конкретные различия между типами клеток, как показали organotypic transcriptional выражение подписи, включая нефрогенной транскрипционных факторов, HoxD10 и HoxD11 kPSCs. kPSCs, в отличие от bmMSCs, не проходят Миофибробласт трансформации после стимуляции с TGF-β и были способны дифференцироваться в адипоцитов. Кроме того kPSCs ускоренного эпителиальных целостности в почки трубчатых эпителиальных рану скретч assay, явление, которое не наблюдалось с bmMSCs. Это расширение рану ремонт был опосредуется через релиз фактора роста гепатоцитов. Кроме того kPSCs смягчены травмы почек в мышиной модели острой почечной травмы15. Поэтому kPSCs кажется, Улучшенный почечной ремонт потенциала и интересный новый источник для клеточной терапии при заболеваниях почек.
Для того, чтобы иметь возможность использовать kPSCs для целей терапии клеток, kPSCs должен быть изолирован на основе клинических класс с клинической класс ферментов и протоколы. Кроме того чтобы иметь возможность лечить несколько пациентов с kPSCs от 1 донора, должно быть получено достаточное число клеток. Здесь мы покажем в деталях, клинические класса изоляции процедура kPSCs от всего трансплантации почки класс, давая достаточное количество клеток для клинического клеточной терапии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="619">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Baxter bags</td>
			<td style="width:117px;">Fenwal</td>
			<td style="width:119px;">R4R-7004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human platelets</td>
			<td>Sanquin</td>
			<td></td>
			<td>hospital surplus material expired for less than 2 days is used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">platelet lysate</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable sterile bottles</td>
			<td style="width:117px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">09-761-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500ml PP centrifuge tubes</td>
			<td style="width:117px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">a-MEM medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glutamax</td>
			<td style="width:117px;">thermo fisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pen/strep&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">transfusion system</td>
			<td>Codan</td>
			<td>455609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM-F12</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>11320-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">normal human serum</td>
			<td style="width:117px;">Sanquin</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes 1M</td>
			<td style="width:117px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE-17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3 7.5%</td>
			<td style="width:117px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-613E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 1M</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UW</td>
			<td style="width:117px;">Bridge to life</td>
			<td style="width:119px;">32911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin</td>
			<td style="width:117px;">Leo Pharma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">collagenase NB1 GMP grade</td>
			<td>SERVA</td>
			<td style="width:119px;">17455.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">surgical drapes</td>
			<td style="width:117px;">3M Nederland</td>
			<td style="width:119px;">DH999969404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">perfusion pump</td>
			<td>metrohm</td>
			<td>x007528300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pump head</td>
			<td>metrohm</td>
			<td>x077202600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">perfusion tray</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS25 masterflex tubes</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-96410-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">accessory spike</td>
			<td style="width:117px;">Gambro DASCO</td>
			<td style="width:119px;">6038020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pulmozyme</td>
			<td style="width:117px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">culture flasks 25 cm2</td>
			<td style="width:117px;">greiner</td>
			<td style="width:119px;">690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture flask 75 cm2</td>
			<td style="width:117px;">greiner</td>
			<td style="width:119px;">658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">culture flask 175 cm2</td>
			<td style="width:117px;">greiner</td>
			<td style="width:119px;">661160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>t4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FcR blocking reagent</td>
			<td>miltenyi</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti melanoma beads (NG2)</td>
			<td>miltenyi</td>
			<td>130-090-452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cellstrainer 70 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LS columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS magnet</td>
			<td style="width:117px;">miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD34 FITC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45 APC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>555485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD146 PE</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>550315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NG2 APC</td>
			<td style="width:117px;">R&#38;D</td>
			<td>FAB2585A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD90 PE</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>555596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HLA ABC APC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>555555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD105 FITC</td>
			<td>Ancell</td>
			<td>326-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HLA DR APC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>559866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD56 PE</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>555516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD73 PE</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>550257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD31 FITC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>555445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD133 PE</td>
			<td style="width:117px;">miltenyi</td>
			<td>130-090-853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PDGF-r&#160;</td>
			<td style="width:117px;">R&#38;D</td>
			<td>mab 1263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IgG1 FITC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>345815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IgG1 PE</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>345816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IgG1 APC</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>345818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IgG2b PE</td>
			<td style="width:117px;">BD&#160;</td>
			<td>555743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">goat anti mouse PE</td>
			<td style="width:117px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">R0480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">Merck</td>
			<td>822335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITS (insul, transferrin, selenium)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td>I1884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">triiodothyrinine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">epidermal growth factor</td>
			<td>sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immortalized human renal PTEC (HK2)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td>courtesey of M. Ryan, university college Dublin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel clinical grade isolation method for human kidney perivascular stromal cells

Мезенхимальные стромальные клетки (Майкрософт) (MSCs) являются ткани гомеостатических иммунной и модулирующее клетки, которые показали благотворное воздействие при заболеваниях почек и пересадки. Периваскулярной стромальные клетки (Чок) имеют характеристики с костного MSCs (bmMSCs). Однако они также обладают, скорее из-за местных импринтинг, ткани специфические свойства и играть определенную роль в местных тканей гомеостаза. Эта специфика ткани может привести к конкретным репарации тканей, также в нарушениях функции почек. Ранее мы показали, что человеческая почка Чок (kPSCs) расширили почек эпителиальных заживления в то время как bmMSCs не имеет этот потенциал. Кроме того kPSCs может улучшить почек травмы в естественных условиях. Таким образом kPSCs представляют собой интересный источник для клеточной терапии, особенно для болезней почек и пересадки почки. Здесь мы покажем подробный метод изоляции и культуры в kPSCs от пересадки класса человека почки, основанные на целом орган перфузии пищеварительных ферментов через почечной артерии и обогащения для маркера периваскулярной NG2. Таким образом можно получить крупноклеточный количеств, которые подходят для клеточной терапии.

Метод изоляции kPSCs клинические класса приводится на рисунке 1. Сырой почечных клеток изолированы от человеческого трансплантации почки класс, коллагеназа перфузии. Результате суспензию клеток культивируемых до притока в 5% тромбоцитов лизатов. А затем периваскулярной стромальные клетки фракции изолированных на основе NG2 выражения.
kPSCs пластиковые адэрентных веретеновидной формы клетки (рисA) и являются положительными стромальные маркеры CD73, CD90, CD105 и периваскулярной маркеров NG2, PDGFR-B и CD146, при отрицательной CD31, CD34, CD45 и HLA-DR (рис. 2B). Как правило однородное население kPSCs можно добраться на проход 4 и kPSCs достигают старение вокруг проход 9-10 (рис. 2C). Поэтому мы рекомендуем выполнять эксперименты между прохождения 5-8.
Для оценки функциональных возможностей изолированных kPSCs, мы выполняем в vitro почек эпителиальных раны скретч assay на каждый новый пакет kPSCs, как мы ранее показал, что обусловлено среднего kPSCs может ускорить эпителиальных заживления ран в этой скретч пробирного15. ССКП кондиционером среднего производится выращивание kPSCs за 48 ч в alphaMEM 5% тромбоцитов лизатов и собирая супернатант. Далее увековечен человеческая почка проксимальных канальцах эпителиальных клеток (HK-2)17 культивируемых до притока и затем производится скретч рану. Затем либо кондиционером среднего kPSCs или управления среды добавляется к скважинам и измеряется скорость заживления ран. При добавлении кондиционером среднего kPSCs, рана закрывает значительно быстрее (Рисунок 2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig1.jpg"> 
Рисунок 1 : Клинические изоляции класса метод человеческого kPSCs. Трансплантации почки класса являются канюлированной увлажненную с коллагеназы через почечной артерии (A - G) и промывают результате суспензию клеток и либо криоконсервированных или введены в культуру (H - K). После того, как клетки достигают confluency (L), NG2 обогащение клеток исполнил (M). Клетки trypsinized, когда они либо вырожденная, перестали пролиферирующих или когда 3D структуры появляются (N - P). Критерии выпуска для kPSCs являются стерильности, маркер выражения и возможность повышения трубчатых эпителиальных заживление ран (Q). Стрелка: почечной артерии. Шкалы бар = 200 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig1large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig2.jpg"> 
Рисунок 2: Характеристика человека kPSCs. ) KPSCs являются веретеновидной формы, пластиковые адэрентных клеток. KPSCs B) являются позитивными для мезенхимальных маркеры CD73, CD90, CD105, периваскулярной маркеры NG2, PDGFR-β и CD146, при отрицательной CD31, CD34 и CD45. kPSCs Экспресс MHC-класса я (HLA-ABC), но не класс II (HLA-DR). C) роста характеристик трех различных ССКП доноров из проточной цитометрии подтвердил однородной NG2 позитивные населения (на прохождение 4). kPSCs достичь старение вокруг проход 9-10. KPSCs D) имеют возможность повышения эпителиальных ремонт почек в рану скретч assay. Представитель изображения управления среднего и среднего ССКП кондиционером при t = 0, 4, 8 и 12 h показываются. Линейки в A) = 200 мкм, в D) = 100 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig2large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells at JoVE.com

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Здесь мы представляем Роман клинических класс изоляции и культуры метод для почек периваскулярной стромальные клетки (kPSCs), основанный на весь орган перфузии с пищеварительные ферменты и обогащения NG2-клеток. С помощью этого метода можно получить достаточного числа клеток для клеточной терапии.

Роман клинических класс изоляции метод человеческая почка периваскулярной стромальные клетки

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Метод мышей Изоляция Островок и субкапсулярной трансплантации почек

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Экспериментальные Генерация Карцинома-Associated Фибробласты (CAFS) из молочной железы человека Фибробласты

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

Роман позвоночника Стабилизация Способ получения Contusive с повреждением спинного мозга

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Два Методы Создание первичных клеток человека эндометрия стромальных от гистерэктомии образцов

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Изоляция, криоконсервации и культура клеток человека Амнион Эпителиальные для клинического применения

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

Доклинические Ортотопическая мышиной модели рака простаты человека

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Выделение и культуры первичных эндотелиальных клеток от клыка артериями и венами

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Подробный протокол потоотделения мониторинга с использованием нового, Малый, беспроводное устройство

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Клинический протокол производства жировой ткани производные стромальные сосудистой дроби для потенциальных регенерации хряща

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...