Name: discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques
Uploaded: 2017-06-30T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af National Cancer Institute (NCI) Grants U54CA143798 og U54CA143907 for at etablere Physical Sciences-Oncology Centers (PS-OC&#39;er) hos henholdsvis Dana-Farber Cancer Institute og University of Southern California. SM Mumenthaler modtog en PS-OC transnetwork award, der understøttede nogle af dette arbejde. Vi vil gerne udtrykke vores dybeste taknemmelighed til vores filantropiske tilhængere, især Stephenson-familien, Emmet, Toni og Tessa, for deres donation af Operetta HCS-platformen. Vi vil også gerne takke J. Foo til vejledning, og Center for Anvendte Molekylærmedicin holdmedlemmer: D. Agus for klinisk vejledning og mentorskap, K. Patsch for meningsfuldt diskussioner med eksperimentelt design, R. Rawat for hjælp i billedanalyseprotokoller , J. Katz for teknisk assistance med Operetta, og P. Macklin og D. Ruderman for nyttige diskussioner og feedback.

1. Cell Culture BEMÆRK: Her blev fænotypiske responser af NSCLC-celler (H3255) til EGFR-målingsmidlet, erlotinib, undersøgt, når de blev dyrket med lungfibroblaster (CCD-19Lu GFP). For det samme datasæt blev fluorescensbaseret og morfologi-baseret klassificering af de to cellepopulationer (H3255 og CCD-19Lu GFP) for at eksemplificere deres konkordans udført. Dog skal kun en klassificeringsmetode anvendes og skal vælges ud fra ansøgningen. <ol><li> Forbered 500 ml RPMI-1640 suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS og 1% penicillin / streptomycin. BEMÆRK: Vækstmediet og kosttilskud kan erstattes efter behov for andre celletyper. </li><li> Kulturceller i 10 cm 3 plader som rene populationer i 5% CO 2 ved 37 ° C og passerer den ved passende forhold hver 3-4 dage. </li></ol> 2. Fremstilling af celler <ol><li> For at forberede en celle suspension, fjern cEll medier og vaskeceller med 5 ml 1 x phosphatbufferet saltvand (PBS). </li><li> Aspirer fra PBS&#39;en, tilsættes 1 ml 0,05% trypsin opvarmet til 37 ° C og inkuberes i 5 minutter (eller indtil cellerne ikke længere klæber til plade) ved 37 ° C. </li><li> For at neutralisere trypsin tilsættes 4 ml RPMI til H3255 og CCD-19Lu GFP plader og pipetter celleopløsningerne i 15 ml koniske rør. </li><li> Centrifuge celler ved 150 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Aspirer off supernatanten og resuspender cellepellets i 10 ml RPMI-medier i koniske rør for at forberede sig på såning. </li></ol> 3. Cell Plating <ol><li> Tæl cellerne for at standardisere såning. <ol><li> Inverter rør for at blande celler i opløsning. Pipetter 10 μl af hver cellesuspension i et mikrocentrifugerør og tilsæt 10 μL trypanblå. </li><li> Pipetter 10 μL af denne opløsning i en celle tæller dias og indsæt i automatiseret celle tæller. BEMÆRK: Andre metoder til celletælling ( dvs.. Hæmocytometer) kan anvendes. </li><li> Gentag celleantalet mindst tre gange, eller indtil de opnåede tæller er konsistente. </li></ol></li><li> Frø celler på en multi-brønds plade BEMÆRK: Antallet af plader til frø afhænger af antallet af tidspunkter, der vil blive afbildet. Alternativt kan en plade genoptimeres over tid, hvis cellerne transduceres med histon-2B-GFP (eller andre stabile lentivirale nukleare pletter, der tilvejebringer tilstrækkelig nuklear segmentering). <ol><li> Seet i alt 1.500 celler / brønd i 100 μl RPMI. Forbered tre celle suspensioner til plade tre cellepopulationer: H3255, CCD-19Lu GFP og 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Udfør hver i tre eksemplarer med identiske pladeopsætninger for hvert tidspunkt. BEMÆRK: Indledende såningstætheder bør optimeres for hver cellelinje og pladestørrelse. </li><li> Frøceller i 3 x 96 brøndsplader ved anvendelse af en flerkanalspipette. Inkuber celler O / N ved 37 ° C, 5% C02. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Doseringsdosering <ol><li> Tilsæt DMSO til erlotinibpulver til opnåelse af en endelig erlotinib stamopløsning med en koncentration på 10 mM. BEMÆRK: Lægemidlet kan erstattes efter ønske. </li><li> Fortynd stoffet med celledyrkningsmedium til 2x den endelige koncentration med den højeste endelige koncentration ved 10 μM og serielt fortyndet fire gange ved et 1:10 forhold, for i alt fem lægemiddelkoncentrationer og ingen lægemiddelkontrol. BEMÆRK: Hvis koncentrationen af ​​DMSO er lig med eller overstiger 0,1% v / v ved den højeste dosis af lægemidlet, bør den nej medicinsk kontrol indeholde ækvivalent mængde DMSO for at sikre, at de observerede virkninger ikke skyldes DMSO-toksicitet. </li><li> Pipetter 100 μL lægemiddelopløsning i den passende brønd til en endelig lægemiddelkoncentration på 1 x fortyndet i medier. </li></ol> 5. Billedforsamling BEMÆRK: Billeder blev erhvervet på dag 0, 2 og 3. Afhængigt af celletyper og cellulære processer, der studeres, oDe ønskede tidspunkter kan undersøges. <ol><li> Stainceller til at forberede sig til billeddannelse. <ol><li> Færdiggør farvestofopløsningen ved følgende slutkoncentrationer. <ol><li> Til fluorescensbaseret klassificering skal der fremstilles 5 μg / ml nuklear plet og 5 μM dødcellefarvning i PBS (se tabel over materialer ). </li><li> For morfologibaseret klassificering skal der fremstilles 5 μg / ml nuklear plet, 5 μM dødcellefarvning og 5 μM cellefarvning i PBS (se tabel over materialer ). </li></ol></li><li> Tilsæt 20 μL farvestofopløsning til hver brønd. Inkubér i 30 minutter ved 37 ° C beskyttet mod lys. </li></ol></li><li> Optimer og erhverve billeder. <ol><li> Fjern brøndpladen fra inkubatoren, aftør bunden af ​​pladen med 70% EtOH, og læg pladen i billedkammeret. </li><li> På fanen &#39;Setup&#39; skal du klikke på knappen &#39;+&#39; under &#39;Kanalvalg&#39; for at tilføje passende kanaler tilBillede ( dvs. lysfelt, nuklear plet, døde celle pletter, GFP og RFP signaler). </li><li> Klik på &#39;Layout Selection&#39;, og tag z-stablede testbilleder hver 2 μm startende ved 0 μm og slutter ved 20 μm for at identificere fokusplanet. Indtast denne afstand for hver kanal under &#39;Højde&#39;. </li><li> Klik på &#39;Snapshot&#39; under hver kanal for at evaluere intensiteter og optimere eksponeringstider. Indtast højere eller lavere værdier under &#39;Tid&#39; efter behov. </li><li> På højre side af skærmen fremhæves passende brønde (skal afbildes) på skematisk skema. I nedenstående brønde fremhæves de 25 felter, der skal afbildes på samme måde. </li><li> Under &#39;Kør eksperiment&#39; skal du identificere pladen i &#39;Plate Name&#39; på venstre faneblad og klikke på &#39;Start&#39; knappen (nedenunder) for at køre billedoptagelsesprotokollen med et 10X mål for at generere gråskala TIFF-billeder i de ovennævnte kanaler. BEMÆRK: Trin-for-trin instForhold til billedbehandling kan variere mellem instrumenter, men parameterværdier skal stadig optimeres. </li><li> Gentag billeddannelsen på dag to og tre. </li></ol></li></ol> 6. Billedanalyse BEMÆRK: Alle billedanalyser blev udført ved hjælp af proprietær software. Men fordi dette ikke er offentligt tilgængelig, blev der også udarbejdet sammenlignelige analyser på CellProfiler 2.2 og CellProfiler Analyst 2.0 med en kort protokol, der er angivet nedenfor, og detaljeret protokol leveres som supplerende materiale (testbilleder er allerede indlæst i rørledninger for at teste workflow). Billederne fra dette eksperiment blev grupperet sammen pr. Brønd, således at hver brønd kunne indlæses individuelt. CellProfiler pipelines nedenfor indeholder et regelmæssigt udtryk, der analyserer metadataoplysninger fra hvert billedfilnavn og gør det muligt at gruppere billederne yderligere efter kanal. <ol><li> Download og installer open source software: &#39;CellProfiler9; Og &#39;CellProfiler Analyst&#39;. Accepter alle standardindstillinger og add-ons under installationen. </li><li> Klassificere heterocellulære kulturer i subpopulationer. <ol><li> Åbn &#39;CellProfiler&#39; software, klik &#39;Fil&#39; | &#39;Importrørledning&#39; | &#39;Fra fil&#39; og vælg den relevante fil (&quot;Fluorescence_Classification.cppipe&quot; til fluorescensbaseret klassificering , eller &quot;Morphology_Classification.cppipe&quot; til morfologi-baseret klassificering). BEMÆRK: Disse filer indeholder protokoller til grundlæggende billedbehandling og kerner / celle segmentering. På grund af den ujævne Hoechst-farve, der er tilstede på tværs af disse celler, blev kerne segmenteret og forstørret og derefter anvendt til at maskere billedet for at muliggøre segmentering af kerner med lavere intensiteter. <ol><li> Vælg den fluorescensbaserede klassifikationsrørledning for at klassificere celler som enten H3255 eller CCD-19Lu baseret på eGFP-intensitet, og for at beregne morfologiske egenskaber. BEMÆRK: CCD-19Lu-celler blev transduceret med GFP. </li><li> Vælg den morfologi-baserede klassifikationsrørledning for at segmentere kerner og celler og beregne morfologiske funktioner. BEMÆRK: Yderligere downstream analyse i &#39;CellProfiler Analyst&#39; er nødvendig for klassificering. Døde celler klassificeres via fluorescensbaseret klassificering. </li></ol></li><li> Klik på &#39;View Output Settings&#39; nederst til venstre på skærmen. Vælg placeringen af ​​billedfilerne for analyse (&#39;Standardindføringsmappe&#39;) og destinationen for den udvundne data (&#39;Standard output-mappe&#39;). </li><li> Klik på &#39;Analysér billeder&#39; for at starte analysen. Når analysen er færdig, klik på &#39;OK&#39; og gå til &#39;Standard Output Folder&#39; for at se de beregnede data. BEMÆRK: Eksempelparameterværdier og billeder er tilgængelige i Supplemental File 1-CellProfilerProtocol.pdf . </li><li> For morfologi-baserede klassificering (kun) gør følgende. <ol><li> Åbn &#39;CellProfiler Analyst&#39; software, vælg databaseegenskabsfilen, der genereres i CellProfiler, og klik på &#39;Åbn&#39;. </li><li> Klik på fanen &#39;Klassificator&#39; øverst til venstre på skærmen. For at kalde tilfældige cellebilleder fra eksperiment, klik på &#39;Hent&#39;; Billeder vises i det uklassificerede vindue. </li></ol></li><li> Klassificere celler manuelt som positiv (H3255) eller negativ (CCD-19Lu) ved at markere og trække celler til passende bin (se Supplemental File 2-Pipeline.pdf : Figur B ). Efter at have klassificeret mindst 50 celler pr. Underbefolkning, skal du klikke på &#39;Train Classifier&#39; og derefter klikke på &#39;Check Progress&#39;. BEMÆRK: Celler klassificeres via en bruger-overvåget tilfældig skovmaskinindlæringsalgoritme 12 . Hvis nøjagtigheden ikke er over godkendt tærskel (&gt; 90%), kan det være nødvendigt at gå tilbage og optimere celle segmentering på &#39;CellProfiler&#39;, eller cellerne er måske ikke ideelle til classiFying ved morfologi. </li><li> Klik på &quot;Score alle&quot; for at generere en tabel med celleantal for hver subpopulation. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kanemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+proliferative+activity+of+human+fetal+neural+stem/progenitor+cells+using+indirect+measurements+of+viable+cells+based+on+cellular+metabolic+activity.">Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity.</a> J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).</li><li>Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+pH+dependence+of+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium+bromide-formazan+absorption+on+chemosensitivity+determined+by+a+novel+tetrazolium-based+assay.">Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay.</a> Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).</li><li>Hsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+polyphenols+induce+differentiation+and+proliferation+in+epidermal+keratinocytes.">Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).</li><li>Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+in+image-based+profiling+of+perturbations.">Applications in image-based profiling of perturbations.</a> Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).</li><li>Sero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+and+the+microenvironment+regulate+nuclear+translocation+of+NF-kappaB+in+breast+epithelial+and+tumor+cells.">Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells.</a> Mol Syst Biol. 11 (3), 790 (2015).</li><li>Chen, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclassification+of+prostate+cancer+circulating+tumor+cells+by+nuclear+size+reveals+very+small+nuclear+circulating+tumor+cells+in+patients+with+visceral+metastases.">Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases.</a> Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).</li><li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound.">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li><li>Paraiso, K. H., Smalley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast-mediated+drug+resistance+in+cancer.">Fibroblast-mediated drug resistance in cancer.</a> Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens.">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9, 482 (2008).</li><li>Dao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+interactive+data+exploration,+analysis+and+classification+of+large+biological+image+sets.">CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).</li><li>Garvey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+image-based+method+for+quantitatively+studying+context-dependent+cell+population+dynamics.">A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics.</a> Sci Rep. 6, 29752 (2016).</li><li>Juarez, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+differences+in+cell+line+population+dynamics+using+CellPD.">Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD.</a> BMC Syst Biol. 10 (1), 92 (2016).</li><li>Mumenthaler, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Microenvironmental+Heterogeneity+on+the+Evolution+of+Drug+Resistance+in+Cancer+Cells.">The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells.</a> Cancer Inform. 14, 19-31 (2015).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features. 
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately. 
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations. 
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.

Cellebaserede analyser har været en arbejdshest i grundforskning og stofudviklingsindstillinger. Begrænsningerne af disse standardanalyser er imidlertid blevet mere og mere tydelige med uoverensstemmelsen mellem in vitro og kliniske data og svigtet af de fleste lægemidler for at modtage FDA-godkendelse. Her præsenterer vi en ny metode til udnyttelse af kvantitativ billeddannelse til samtidig analyse af heterocellulære fænotyper som reaktion på relevante, sammenfaldende miljømæssige stimuli. Traditionelle cellebaserede analyser, der anvendes til at måle celle-levedygtighed, indbefatter: trypanblåtekskluderingsassays, MTT / MTS og Annexin V-FITC-flowcytometrifarvning. Trypan Blue Exclusion analyser, mens de er enkle og billige, kræver et stort antal celler, er tidskrævende og påvirkes ofte af brugerforstyrrelser 1 . MTT- og MTS-analyser måler indirekte celle-levedygtighed gennem målinger af mitokondriens metaboliske hastighed. Det metaboliske aktiviTy for celler kan påvirkes af forskellige kulturbetingelser (såsom medie eller iltkoncentration), hvilket fører til unøjagtige resultater og forhindrer standardisering på tværs af celletyper og betingelser 2 , 3 . En anden stor ulempe ved disse teknikker er deres manglende evne til at skelne mellem flere celletyper - de fleste biologiske systemer er heterocellulære. Selvom flowcytometrimetoder har evnen til at skelne mellem flere cellepopulationer, kræves celleetiketter, dynamisk prøveudtagning er udfordrende, og når der anvendes vedhæftende celler, bliver denne applikation tidskrævende og fejlagtig. Andre vigtige cellulære fænotyper, herunder morfologiske ændringer, forekommer som reaktion på miljøstimuli, men er ikke fanget af traditionelle cellebaserede assays. Profilering celle tilstande gennem morfologisk karakterisering og kortlægning ligheder over prøver er et kraftfuldt, upartisk værktøj med aEvne til at give en ny indsigt i mange aspekter af grundlæggende og translationel forskning, herunder basisk cellebiologi og stofopdagelse 4 . Desuden er tumorcellemorfologi blevet vist at korrelere med tumorundertyper 5 og aggressivitet 6 . Det er derfor af stor interesse at studere disse cellulære træk og hvordan de vedrører specifikke miljøforstyrrelser. Derudover kan man anvende forskelle i morfologiske egenskaber til at diskriminere mellem subpopulationer i co-kultur systemer. Fluorescensmærkningsceller har nedfald ( dvs. ændring af egencelleegenskaber, tidskrævende), og derfor er yderligere metoder til klassificering af celletyper fordelagtige. Mikroskopi-baseret billeddannelse er en alternativ metode til profilering af cellulære fænotyper på en multiplekset, kvantitativ og robust måde. I dette manuskript anvender vi vores kvantitative billedbehandlingsrørledning for at fremhæve evolutioNary dynamik af heterogene cellepopulationer inden for en tumor. Vi fokuserer på samspillet mellem ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) celler og cancer-associerede fibroblaster (CAF&#39;er), den mest fremherskende stromalcelletype, der findes i tumorer. CAF&#39;er er blevet impliceret i tumorinitiering, progression og terapeutisk respons; Derfor kan udførelse af fænotypiske analyser på tumorceller i fravær af CAF&#39;er være vildledende 7 , 8 , 9 . Specifikt vurderede vi virkninger af CAF&#39;er på tumorceller som reaktion på erlotinib, et lille molekyle målrettet mod Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), der ofte anvendes til klinisk behandling af NSCLC. Vi udnyttede en højindholds screeningsplatform og den tilhørende billedanalysesoftware til evaluering; Men i et forsøg på at gøre denne metode tilgængelig for andre forskere har vi også udviklet en sammenlignelig downstream-protokol ved hjælp af open source-softwaren:CellProfiler 10 og CellProfiler Analyst 11 . De fleste billedbaserede screeningsanalyser med høj indhold analyseres med kommercialiseret software, der er specifik for en given instrumentmodel. Resultater er vanskelige at replikere i andre laboratorier med forskellige software, fordi de underliggende algoritmer ofte er proprietære. Ved anvendelse af denne billedbaserede pipeline blev celleproliferation, død og morfologi af hver subpopulation af en heterocellulær kultur som svar på lægemiddelbehandling under anvendelse af både fluorescens- og morfologi-baseret klassificering målt. Den følgende protokol giver en robust metode til sondering af komplekse cellulære processer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:191px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">FBS</td>
			<td style="width:127px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15-140-122</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20 slides with trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450003</td>
			<td>cell counter slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">96-well plates</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td>clear bottom black plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Erlotinib</td>
			<td style="width:127px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">E-4007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">DMSO</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">317275-100ML</td>
			<td>solution to resuspend drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Hoechst</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">H21491</td>
			<td>nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td>dead cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Cell Tracker Orange CMRA</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
			<td>whole cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Operetta high content imaging system</td>
			<td style="width:127px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:127px;">Broad Institue</td>
			<td style="width:119px;">version 2.2.0 (rev 9969f42)</td>
			<td>http://cellprofiler.org/releases/</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 &#186;C at 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">15 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:240px;">10 cm2 cell culture plates</td>
			<td style="width:127px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques

Cellulære processer er komplekse og skyldes samspillet mellem flere celletyper og deres omgivelser. Eksisterende cellebiologiteknikker tillader ofte ikke nøjagtig fortolkning af dette samspil. Ved hjælp af en kvantitativ billeddannelsesbaseret tilgang præsenterer vi en højindholdsprotokol til karakterisering af de dynamiske fænotypiske responser ( dvs. morfologiske forandringer, proliferation, apoptose) af heterogene cellepopulationer for ændringer i miljømæssige stimuli. Vi fremhæver vores evne til at skelne mellem celletyper baseret på enten fluorescensintensitet eller iboende morfologiske funktioner afhængigt af applikationen. Denne platform muliggør en mere omfattende karakterisering af subpopulationsrespons til forstyrrelse, mens der anvendes kortere tid, mindre mængder reagenser og lavere sandsynlighed for fejl end traditionelle cellebiologiske analyser. I nogle tilfælde kan cellepopulationer imidlertid være vanskelige at identificere og kvantificere baseret på kompleks celluLar funktioner og vil kræve yderligere fejlfinding; Vi fremhæver nogle af disse forhold i protokollen. Vi demonstrerer denne ansøgning ved hjælp af respons på stof i en kræftmodel; Det kan dog let anvendes mere bredt til andre fysiologiske processer. Denne protokol gør det muligt for en at identificere subpopulationer inden for et co-kultur system og karakterisere den enkelte respons af hver til eksterne stimuli.

Vi dannede et billedsæt bestående af 25 felter / brønd, 54 brønde / plade (3 cellepopulationer x 6 lægemiddelkoncentrationer x 3 replikater) på tværs af tre plader til i alt 4.050 individuelle billeder. Billedsætene, der blev genereret i løbet af eksperimentet, blev analyseret ved hjælp af proprietær software (se materialetabellen) for at udvinde forskellige kvantitative egenskaber af celler ( dvs. morfologi, fluorescens), som derefter kunne anvendes til at klassificere cellepopulationer. Men fordi den anvendte kommercielle software har begrænset adgang, blev der skabt sammenlignelige downstream-rørledninger i CellProfiler og CellProfiler Analyst. Heterocellulær klassificering i subpopulationer Nuclei blev identificeret og segmenteret baseret på DNA-pletten (her Hoechst), og cellepopulationer blev klassificeret enten baseret på fluorescens eller moRfologi ( figur 1 ). Til fluorescensbaseret klassifikation blev fibroblasterne (CCD-19Lu) tidligere transduceret med GFP-lentivirus. GFP-intensitetsniveauerne blev målt for hver kerne, og de, der blev beregnet over den accepterede tærskel (baseret på baggrundssignalet) blev klassificeret som CCD-19Lu, mens de nedenfor blev identificeret som tumorceller (H3255). Til morfologi-baseret klassificering blev celler farvet tidligere med en ikke-toksisk cellulær plet (se materialebordet), og dette blev anvendt til at identificere og segmentere cytoplasmaet. En maskininlæringsalgoritme blev uddannet med ~ 50-100 celler fra hver population. Morfologiske egenskaber blev identificeret, der var signifikant forskellige mellem populationerne, som derefter blev anvendt til at designe en lineær klassifikator for at skelne mellem CCD-19Lu og H3255 celler. Fluorescens- og morfologi-klassifikationsprotokollerne var 97,4% (n = 1403) konkordant ved at skelne mellem de to cellepopulationerAtioner i ubehandlede betingelser og 92,5% (n = 916) concordant i lægemiddelbehandlede tilstande (1 μM erlotinib) ( figur 2 ). Fænotypiske analyser af delpopulationer Ud over at diskriminere mellem celletyper, havde vi til formål at karakterisere fænotypiske egenskaber for hver subpopulation. Multiplexing analyser sparer tid og reagenser, tilføjer konsistens og giver yderligere information om det system, der undersøges. Der er mange potentielle fænotypiske udgange, og man bør vælge dem ud fra spørgsmål af interesse. Her blev ændringer i cellemorfologi og levedygtighedsstatus som reaktion på erlotinibbehandling undersøgt. Efter tre dages behandling af lægemidler blev der observeret et fald i nukleare områder og en forøgelse af cellulære arealer af H3255-cellerne ( figur 3A ). Den gennemsnitlige forskel i nukleare område mellemDe &quot;ingen lægemiddel&quot; og &quot;lægemiddel&quot; behandlede populationer viste sig at være statistisk signifikante via en tosidet type 2 (ligevariant) t- test ( p = 7,92 x 10-16 ). Vi antager, at denne observation er et cellulært svar på den stress, der pålægges lægemiddelbehandling. Det er også af interesse at undersøge, om et lægemiddel har en cytotoksisk virkning ( dvs. forøgelse af antallet af døde celler over tid) eller cytostatisk ( dvs. fald i antallet af cellefødsler over tid) på cellerne, da dette har en dybtgående klinisk virkning. For eksempel inducerer en cytostatisk lægemiddelvirkning vækstarrest, men eliminerer ikke cellerne fra tumoren, således er der potentiale for cancerceller at genoplive celleproliferation, når lægemidlet er fjernet. Narkotikaeffekter kan ofte være afhængige af kontekst, koncentration og celletype. Vi har tidligere observeret erlotinib fremkaldelse af et cytotoksisk respons i en celletype, mens der vises acYtostatisk respons i en anden 13 . Traditionelle levedygtighedsassays udsender relativ celleantal og diskriminerer derfor ikke mellem vækstarrestationer og celledød. Derefter blev døde celler identificeret baseret på propidiumiodidfarvning ( figur 3B ). Både cytotoksiske og cytostatiske virkninger af erlotinib på H3255-celler blev observeret med en stigning i antallet af dødsfald og et fald i antallet af fødsler efter lægemiddelbehandling ( figur 3C ). Det er værd at bemærke, at antallet af døde celler falder efter dag 1, sandsynligvis på grund af celleklaration. CCD-19Lu-celler blev ikke påvirket af lægemidlet. En yderligere fordel ved denne platform er dannelsen af ​​kvantitative data. I vores co-kultureksperiment blev der for eksempel fundet en initial subpopulation af 1.118 (75.8%) H3255 celler til 2.817 (87.9%) eller 396 (57.2%) efter tre dage uden eller med erlotinIb behandling ( figur 4 ). Fordi vi kan generere faktiske celleantal i stedet for relativ procentdel (som med flowcytometri metoder), konkluderer vi, at ændringen i sammensætning under lægemiddelbehandling skyldes et fald i H3255 celler og ikke en stigning i CCD-19Lu. Det er ikke noget værd at dødelighederne kan undervurderes på grund af celleklaration, hvilket er vanskeligt at vurdere eksperimentelt og sandsynligvis adskiller sig fra forskellige celletyper. <img alt="figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> Figur 1: Oversigt over billedanalyseprotokollen. To potentielle downstream-billedanalysepipeliner til klassificering af heterocellulære populationer ved brug af enten morfologi-baseret klassificering eller fluorescensbaseret klassificering. Skalestænger = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her</a>E for at se en større version af denne figur. <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> Figur 2: Konkordans mellem morfologi og fluorescensbaseret klassificering. ( A ) Concordance plot, der viser overlapningen af ​​de to klassifikationsprotokoller. De samme celler blev klassificeret som H3255 under anvendelse af både morfologi- og fluorescensbaseret klassificering. De to protokoller var i overensstemmelse med klassificering for 97,4% (n = 1403) af ubehandlede celler og 92,5% (n = 916) af celler behandlet med erlotinib (Bemærk: Det hvide område er for lille til at visualisere). ( B ) 10X billeder, der viser eksempler på god og dårlig sammenhæng mellem fluorescensbaseret og morfologi-baseret klassificering. De hvide pile peger på celler, der blev inkonsekvent klassificeret mellem platforme. Inputbillede: blåkerner (Hoechst); Grøn - CCD19Lu (GFP). ClassiFication billeder: Rød - H3255; Grøn - CCD-19Lu. Skalestang = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> Figur 3: Multiplexerede fænotypiske målinger fra en enkelt eksperimentel opsætning. ( A ) Morfologiske træk, såsom kerne- og celleareal, blev beregnet på enkeltcellens niveau i nærvær og fravær af lægemiddel. Bemærk: Celleområder, der måler mindre end 100 μm 2, blev betragtet som affald og udelukket fra analyser. Box-plot afbilder median med første og tredje kvartilområder og 95% konfidensinterval fejlstænger. ( B ) H3255 (blå) og CCD-19Lu (grønne) celler blev co-dyrket, og døde celler blev identificeret baseret på intensiteten af ​​propidIumiodidfarvning (rød) og afbildet ved anvendelse af et 10X objektiv. Skalestang = 1 mm (toppanel); 100 μm (nederste billeder). ( C ) Samlet antal levende og døde celler blev beregnet over tre dage med eller uden lægemiddelbehandling med et tydeligt fald i antallet af levende celler og stigning i døde celler med tilsætning af erlotinib. Fejlstænger repræsenterer standardfejl af gennemsnittet baseret på tre replikater. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> Figur 4: Subpopulation Dynamics over Time. Repræsentative 10X billeder af brønde indeholdende H3255 (blå) og CCD-19Lu (grøn) på dag 0 eller dag 3 med og uden lægemiddel. Celler tilhørende hver subpopulation blev talt, og proportionaldiagrammer viser aÆndring i befolkningens sammensætning på tværs af prøver. Skalestænger = 1 mm (midterpaneler, shpwn i; nærmeste panel), 1 mm (topbillede), 100 μm (bundbilleder). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques at JoVE.com

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Vi har udviklet en ny protokol til undersøgelse af heterocellulær populationsdynamik som reaktion på forstyrrelser. Dette manuskript beskriver en billedbaseret platform, der producerer kvantitative datasæt til samtidig karakterisering af flere cellulære fænotyper af heterocellulære populationer på en robust måde.

Diskrimination og karakterisering af heterocellulære populationer ved anvendelse af kvantitative billedteknikker

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Identifikation og karakterisering af protein glycosylation bruge specifikke endo-og exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analyse af Autophagy hjælp Advanced 3D fluorescensmikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Måling Intracellular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Ændringer i human Sperm med fire teknikker: Konventionel fluorometri, Stoppet Flow fluorometri, Flowcytometri og Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse af mRNA molekyler under anvendelse Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker til analyse af ekstracellulær Vesikler anvendelse af flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Udvikling og karakterisering af<em&gt; In vitro</em&gt; Mikrokar Netværk og kvantitative målinger af endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; jeg</sub&gt; Og nitrogenoxid Produktion

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Teknikker til Imaging prometafasen og Metafase af Meiose I i Fast<em&gt; Drosophila</em&gt; oocyter

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...