Name: discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques
Uploaded: 2017-06-30T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door National Cancer Institute (NCI) Grants U54CA143798 en U54CA143907 om respectievelijk respectievelijk Physical Sciences-Oncology Centers (PS-OC&#39;s) te vinden bij het Dana-Farber Cancer Institute en University of Southern California. SM Mumenthaler heeft een PS-OC Transnetwork Award ontvangen die een deel van dit werk ondersteunt. We willen onze diepste dank uitspreken aan onze filantropische supporters, met name de Stephenson-familie, Emmet, Toni en Tessa, voor hun donatie van het Operetta HCS-platform. Wij danken ook J. Foo voor begeleiding en de teamleden van de Center for Applied Molecular Medicine: D. Agus voor klinische begeleiding en mentorskap, K. Patsch voor zinvolle discussies met experimenteel ontwerp, R. Rawat voor hulp in beeldanalyseprotocollen , J. Katz voor technische bijstand bij de Operetta, en P. Macklin en D. Ruderman voor nuttige discussies en feedback.

1. Celcultuur OPMERKING: hier werden fenotypische reacties van NSCLC-cellen (H3255) naar het EGFR-targetingmiddel, erlotinib, gecombineerd met longfibroblasten (CCD-19Lu GFP) onderzocht. Voor dezelfde dataset werd fluorescentie gebaseerde en morfologie gebaseerde classificatie van de twee celpopulaties (H3255 en CCD-19Lu GFP) om hun concordantie te laten zien, uitgevoerd. Echter, slechts één classificatie methode moet worden gebruikt en moet gekozen worden op basis van de applicatie. <ol><li> Bereid 500 ml RPMI-1640 aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS en 1% penicilline / streptomycine. OPMERKING: Het groeimedium en supplementen kunnen zo nodig vervangen worden voor andere celtypes. </li><li> Cultuurcellen in 10 cm 3 platen als zuivere populaties in 5% CO 2 bij 37 ° C en passeer de bij elke geschikte verhouding elke 3-4 dagen. </li></ol> 2. Bereiding van cellen <ol><li> Om een ​​celsuspensie te bereiden, verwijder cEll media en wascellen met 5 ml 1X fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Aspireren uit de PBS, voeg 1 ml 0,05% trypsine toe tot 37 ° C en incubeer gedurende 5 minuten (of totdat cellen niet langer aan de plaat worden gehecht) bij 37 ° C. </li><li> Om trypsine te neutraliseren, voeg 4 ml RPMI aan H3255 en CCD-19Lu GFP platen toe en pipet de celoplossingen in 15 ml conische buizen. </li><li> Centrifugeer cellen bij 150 xg gedurende 5 min bij RT. </li><li> Aspiratie van de supernatant en resellerende celpellets in 10 ml RPMI media in conische buizen om voor te bereiden op het zaaien. </li></ol> 3. Cell Plating <ol><li> Tel de cellen om het zaaien te standaardiseren. <ol><li> Inverteer buizen om cellen in oplossing te mengen. Pipetteer 10 μl van elke celsuspensie in een microcentrifugebuis en voeg 10 μL trypan blauw toe. </li><li> Pipetteer 10 μL van deze oplossing in een celtellende dia en plaats in een geautomatiseerde celteller. OPMERKING: Andere methoden van celtelling ( dwz. Hemocytometer) kunnen worden gebruikt. </li><li> Herhaal de celtelling ten minste drie keer, of tot de verkregen cijfers consistent zijn. </li></ol></li><li> Zaadcellen op een multi-well plaat OPMERKING: Het aantal borden naar zaad is afhankelijk van het aantal tijdspunten dat wordt afgebeeld. Als alternatief kan één plaat over de tijd opnieuw worden afgebeeld als de cellen worden getransduceerd met histone-2B-GFP (of andere stabiele lentivirale nucleaire vlekken die voldoende nucleaire segmentatie verschaffen). <ol><li> Zaad in totaal 10000 cellen / putje in 100 μl RPMI. Bereid drie celsuspensies op drie celpopulaties van plaat: H3255, CCD-19Lu GFP en 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Voer elk in drievoud met identieke plaatopstellingen voor elk tijdstip uit. OPMERKING: De initiële zeedichtheden moeten worden geoptimaliseerd voor elke cellijn en plaatgrootte. </li><li> Zaadcellen in 3 x 96-putjes platen met behulp van een multikanaalspipet. Incubeer cellen O / N bij 37 ° C, 5% CO 2 . </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Drugsdosering <ol><li> Voeg DMSO toe aan erlotinibpoeder om een ​​uiteindelijke oplossing van erlotinib voorraad van 10 mM concentratie te maken. OPMERKING: Het geneesmiddel kan als gewenst worden gesubstitueerd. </li><li> Verdun het geneesmiddel met celcultuurmedium tot 2x de uiteindelijke concentratie met de hoogste eindconcentratie bij 10 uM en verdubbel viermaal vier keer bij een 1:10 verhouding, voor een totaal van vijf geneesmiddelconcentraties en geen drugssturing. OPMERKING: Als de concentratie van DMSO gelijk is aan of hoger is dan 0,1% v / v bij de hoogste dosis van geneesmiddelen, dient de geen geneesmiddelcontrole equivalente hoeveelheid DMSO te bevatten om ervoor te zorgen dat de waargenomen waargenomen effecten niet te wijten zijn aan DMSO toxiciteit. </li><li> Pipette 100 μL geneesmiddeloplossing in de juiste put voor een uiteindelijke geneesmiddelconcentratie van 1x verdund in media. </li></ol> 5. Image Acquisition OPMERKING: Beelden werden op dagen 0, 2 en 3 verworven. Afhankelijk van de celsoorten en de cellulaire processen die worden bestudeerd, oDaarbij kunnen gewenste tijdspunten worden bestudeerd. <ol><li> Vlekcellen om voor beeldvorming voor te bereiden. <ol><li> Maak de kleurstofoplossing op bij de volgende eindconcentraties. <ol><li> Voor de fluorescentie gebaseerde classificatie, berei 5 μg / ml nucleaire vlek en 5 μM dode cel vlek in PBS (zie Tabel van Materialen ). </li><li> Voor morfologie gebaseerde classificatie bereiden 5 μg / mL kernvlek, 5 μM dode celvlek en 5 μM celvlek in PBS (zie Tabel van Materialen ). </li></ol></li><li> Voeg 20 μL kleurstofoplossing toe aan elke put. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C beschermd tegen licht. </li></ol></li><li> Optimaliseer en verwerven afbeeldingen. <ol><li> Verwijder de putplaat van de incubator, veeg de bodem van de plaat met 70% EtOH en plaats de plaat in de beeldkamer. </li><li> Klik in het tabblad &#39;Setup&#39; op de knop &#39;+&#39; onder &#39;Channel Selection&#39; om de juiste kanalen toe te voegen aanAfbeelding ( dwz brightfield, nucleaire vlek, dode celvlek, GFP en RFP signalen). </li><li> Klik op &#39;Lay-out Selection&#39; en neem z-gestapelde testafbeeldingen elke 2 μm vanaf 0 μm en eindig op 20 μm om het focusvlak te identificeren. Voer deze afstand in voor elk kanaal onder &#39;Hoogte&#39;. </li><li> Klik op &#39;Snapshot&#39; onder elk kanaal om intensiteiten te evalueren en de belichtingstijden te optimaliseren. Voer hogere of lagere waarden in onder &#39;Tijd&#39; zoals vereist. </li><li> Aan de rechterkant van het scherm markeert u passende bronnen (die worden afgebeeld) op de schematische plaat. In de onderstaande schema&#39;s markeer de vijfentwintig velden die op een vergelijkbare manier worden afgebeeld. </li><li> Onder &#39;Run Experiment&#39; identificeert u de plaat in &#39;Plate Name&#39; op het linker tabblad en klikt u op de knop &#39;Start&#39; (onder) om het beeldverhaalprotocol met een 10X-object te richten om grijze TIFF-afbeeldingen te genereren in de hiervoor genoemde kanalen. OPMERKING: stap-voor-stap instRuwingen voor beeldvormingsprotocol kunnen verschillen tussen instrumenten, maar parameterwaarden moeten nog geoptimaliseerd worden. </li><li> Herhaal de afbeeldingen op dag twee en drie. </li></ol></li></ol> 6. Beeldanalyse OPMERKING: Alle beeldanalyses werden uitgevoerd met behulp van eigen software. Omdat dit echter niet publiekelijk beschikbaar is, werden vergelijkbare analyses ook ontworpen op CellProfiler 2.2 en CellProfiler Analyst 2.0, met een kort protocol hieronder en gedetailleerd protocol dat als aanvullend materiaal wordt geleverd (testafbeeldingen zijn al in pijplijnen geladen om de workflow te testen). De afbeeldingen van dit experiment werden per keer samengevoegd, zodat elke bron individueel geladen kon worden. De onderstaande pijpleidingen van CellProfiler bevatten een regelmatige expressie die metadata informatie uit elke afbeeldingbestandsnaam analyseert en de afbeeldingen verder kunnen groeperen per kanaal. <ol><li> Download en installeer de open source software: &#39;CellProfiler9; En &#39;CellProfiler Analyst&#39;. Aanvaar alle standaardopties en add-ons tijdens de installatie. </li><li> Herken heterocellulaire culturen in subpopulaties. <ol><li> Open &#39;CellProfiler&#39; software, klik op &#39;Bestand&#39; | &#39;Import Pipeline&#39; | &#39;Uit bestand&#39; en selecteer het juiste bestand (&#39;Fluorescence_Classification.cppipe&#39; voor fluorescentie gebaseerde classificatie , of &#39;Morphology_Classification.cppipe&#39; voor morfologie-gebaseerde classificatie). OPMERKING: Deze bestanden bevatten protocollen voor basisafbeelding en kern- / celsegmentatie. Vanwege de ongelijke Hoechst-vlek die aanwezig is over deze cellen, werden kernen gesegmenteerd en vergroten en vervolgens gebruikt om het beeld te maskeren om segmenten van kernen met lagere intensiteiten mogelijk te maken. <ol><li> Selecteer de fluorescentie-gebaseerde classificatiepijpleiding om cellen als H3255 of CCD-19Lu te classificeren op basis van eGFP-intensiteit, en om morfologische eigenschappen te berekenen. OPMERKING: CCD-19Lu-cellen werden getransduceerd met GFP. </li><li> Selecteer de morfologie gebaseerde classificatie pijpleiding om segmenten van kernen en cellen te definiëren en om morfologische eigenschappen te berekenen. OPMERKING: Voor verdere indeling is verder nader onderzoek nodig in &#39;CellProfiler Analyst&#39;. Dode cellen worden geclassificeerd door middel van fluorescentie gebaseerde classificatie. </li></ol></li><li> Klik onderaan op het scherm op &#39;Uitvoerinstellingen weergeven&#39;. Selecteer de locatie van de afbeeldingsbestanden voor analyse (&#39;Default Input Folder&#39;) en de bestemming voor de geëxtraheerde gegevens (&#39;Default Output Folder&#39;). </li><li> Klik op &#39;Analyses Images&#39; om de analyse te starten. Wanneer de analyse is voltooid, klikt u op &#39;OK&#39; en gaat u naar de &#39;Standaarduitvoermap&#39; om de berekende gegevens te bekijken. OPMERKING: Voorbeeldparameterwaarden en afbeeldingen zijn beschikbaar in Aanvullende Bestand 1-CellProfilerProtocol.pdf . </li><li> Voor de morfologie gebaseerde classificatie (alleen) doe het volgende. <ol><li> Open &#39;CellProfiler Analyst&#39; software, selecteer het database eigenschappen bestand dat is gegenereerd in CellProfiler, en klik op &#39;Open&#39;. </li><li> Klik op het tabblad &#39;Classificeren&#39; boven in het scherm. Om willekeurige celafbeeldingen van experiment te beluisteren, klikt u op &#39;Halen&#39;; Afbeeldingen verschijnen in het niet-geclassificeerde venster. </li></ol></li><li> Categoriseer je cellen handmatig als positief (H3255) of negatief (CCD-19Lu) door cellen te selecteren en naar de juiste bin te slepen (zie Aanvullend Bestand 2-Pipeline.pdf : Figuur B ). Na het classificeren van ten minste 50 cellen per subpopulatie, klikt u op &#39;Train Classifier&#39; en vervolgens op &#39;Progress Check&#39;. OPMERKING: Cellen worden ingedeeld via een door gebruikers gecontroleerde willekeurige forest machine learning algoritme 12 . Als de nauwkeurigheid niet hoger is dan de goedgekeurde drempelwaarde (&gt; 90%), kan het nodig zijn om celsegmentatie terug te gaan en te optimaliseren op &#39;CellProfiler&#39;, of de cellen zijn mogelijk niet ideaal voor classiSteken door morfologie. </li><li> Klik op &#39;Score All&#39; om een ​​tabel met celtellingen te genereren voor elke subpopulatie. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kanemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+proliferative+activity+of+human+fetal+neural+stem/progenitor+cells+using+indirect+measurements+of+viable+cells+based+on+cellular+metabolic+activity.">Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity.</a> J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).</li><li>Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+pH+dependence+of+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium+bromide-formazan+absorption+on+chemosensitivity+determined+by+a+novel+tetrazolium-based+assay.">Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay.</a> Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).</li><li>Hsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+polyphenols+induce+differentiation+and+proliferation+in+epidermal+keratinocytes.">Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).</li><li>Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+in+image-based+profiling+of+perturbations.">Applications in image-based profiling of perturbations.</a> Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).</li><li>Sero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+and+the+microenvironment+regulate+nuclear+translocation+of+NF-kappaB+in+breast+epithelial+and+tumor+cells.">Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells.</a> Mol Syst Biol. 11 (3), 790 (2015).</li><li>Chen, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclassification+of+prostate+cancer+circulating+tumor+cells+by+nuclear+size+reveals+very+small+nuclear+circulating+tumor+cells+in+patients+with+visceral+metastases.">Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases.</a> Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).</li><li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound.">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li><li>Paraiso, K. H., Smalley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast-mediated+drug+resistance+in+cancer.">Fibroblast-mediated drug resistance in cancer.</a> Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens.">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9, 482 (2008).</li><li>Dao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+interactive+data+exploration,+analysis+and+classification+of+large+biological+image+sets.">CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).</li><li>Garvey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+image-based+method+for+quantitatively+studying+context-dependent+cell+population+dynamics.">A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics.</a> Sci Rep. 6, 29752 (2016).</li><li>Juarez, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+differences+in+cell+line+population+dynamics+using+CellPD.">Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD.</a> BMC Syst Biol. 10 (1), 92 (2016).</li><li>Mumenthaler, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Microenvironmental+Heterogeneity+on+the+Evolution+of+Drug+Resistance+in+Cancer+Cells.">The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells.</a> Cancer Inform. 14, 19-31 (2015).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features. 
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately. 
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations. 
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.

Cell-based tests zijn een werkhorse in basisonderzoek en drug ontwikkeling instellingen. De beperkingen van deze standaardbepalingen zijn echter steeds meer zichtbaar met de discordantie tussen in vitro en klinische data en het mislukken van de meeste geneesmiddelen om FDA-goedkeuring te ontvangen. Hier presenteren we een nieuwe methode voor het gebruik van kwantitatieve beeldvorming om tegelijkertijd heterocellulaire fenotypes te analyseren in reactie op relevante, samen voorkomende milieu-stimuli. Traditionele cellen gebaseerde assays die worden gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te meten omvatten: trypan blue exclusion assays, MTT / MTS en Annexin V-FITC flow cytometry staining. Trypan Blue Exclusion Assays, die eenvoudig en goedkoop zijn, hebben een groot aantal cellen nodig, zijn tijdrovend en worden vaak beïnvloed door gebruikers vooroordeel 1 . MTT- en MTS-analyses bepalen indirect de levensvatbaarheid van cellen door metingen van mitochondriale metabolische snelheid. Echter, de metabolische activiTijden van cellen kunnen beïnvloed worden door verschillende kweekomstandigheden (zoals media of zuurstofconcentratie), wat leidt tot onnauwkeurige resultaten en voorkomt normalisatie over celtypen en condities 2 , 3 . Een ander belangrijk nadeel van deze technieken is hun onvermogen om onderscheid te maken tussen meerdere celtypes - de meeste biologische systemen zijn heterocellulair. Hoewel stromingscytometriemethoden het vermogen hebben om te onderscheiden tussen meerdere celpopulaties, zijn er celletiketten vereist, dynamische bemonstering is uitdagend en bij toepassing van hechtende cellen wordt deze applicatie tijdrovend en fout gevoelig. Andere belangrijke cellulaire fenotypes, waaronder morfologische veranderingen, optreden in reactie op milieu-stimuli, maar worden niet opgevangen door traditionele cel-gebaseerde assays. Profiele celstaten door middel van morfologische karakterisering en mapping overeenkomsten over monsters is een krachtig, onbevooroordeeld instrument met de aMogelijkheid om nieuwe inzichten te geven in veel aspecten van basis- en translatieonderzoek, met inbegrip van basiscelbiologie en drugsontdekking 4 . Bovendien is aangetoond dat tumorcelmorfologie verband houdt met tumor subtypes 5 en agressiviteit 6 . Daarom is het van groot belang om deze mobiele functies te bestuderen en hoe ze betrekking hebben op specifieke milieuverstoringen. Daarnaast kan men verschillen in morfologische kenmerken gebruiken om te onderscheiden tussen subpopulaties in co-cultuur systemen. Fluorescent labeling cellen hebben downfalls ( dwz het veranderen van inherente cel eigenschappen, tijdrovend) en daarom zijn extra methoden om celtypen te classificeren voordelig. Microscopie gebaseerde beeldvorming is een alternatieve methode voor het profileren van cellulaire fenotypes op een multiplexed, kwantitatieve en robuuste manier. In dit manuscript passen we onze kwantitatieve beeldvormingspijpleiding toe om de evolutio te markerenNijndynamiek van heterogene celpopulaties binnen een tumor. We richten ons op de interactie tussen cellen met niet-kleine celkanker (NSCLC) en kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF&#39;s), het meest voorkomende stromale celtype dat in tumoren voorkomt. CAF&#39;s zijn betrokken bij tumorinitiatie, progressie en therapeutische respons; Daarom kan het uitvoeren van fenotypische analyses op tumorcellen bij afwezigheid van CAF&#39;s misleidende 7 , 8 , 9 zijn . Specifiek hebben we de effecten van CAF&#39;s op tumorcellen geëvalueerd in reactie op erlotinib, een klein molecuul dat de Epidermale Groeifactor Receptor (EGFR) richt, die vaak wordt gebruikt bij de klinische behandeling van NSCLC. We hebben gebruik gemaakt van een hoogwaardig screeningsplatform en de bijbehorende beeldanalysesoftware voor evaluatie; Echter, in een poging om deze methodologie toegankelijk te maken voor andere onderzoekers, hebben we ook een vergelijkbaar downstream protocol ontwikkeld met behulp van de open source software:CellProfiler 10 en CellProfiler Analyst 11 . De meeste beeld gebaseerde high-content screening analyses worden geanalyseerd met gecommercialiseerde software specifiek voor een bepaald instrument model. Resultaten zijn moeilijk te repliceren in andere laboratoria met verschillende software omdat de onderliggende algoritmen vaak eigendom zijn. Met behulp van deze beeldgebaseerde pijplijn werden cel proliferatie, dood en morfologie van elke subpopulatie van een heterocellulaire cultuur als reactie op medicijnbehandeling met behulp van zowel fluorescentie- als morfologie gebaseerde classificatie gemeten. Het volgende protocol biedt een robuuste methodologie voor het onderzoeken van complexe cellulaire processen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:191px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">FBS</td>
			<td style="width:127px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15-140-122</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20 slides with trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450003</td>
			<td>cell counter slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">96-well plates</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td>clear bottom black plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Erlotinib</td>
			<td style="width:127px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">E-4007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">DMSO</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">317275-100ML</td>
			<td>solution to resuspend drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Hoechst</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">H21491</td>
			<td>nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td>dead cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Cell Tracker Orange CMRA</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
			<td>whole cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Operetta high content imaging system</td>
			<td style="width:127px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:127px;">Broad Institue</td>
			<td style="width:119px;">version 2.2.0 (rev 9969f42)</td>
			<td>http://cellprofiler.org/releases/</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 &#186;C at 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">15 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:240px;">10 cm2 cell culture plates</td>
			<td style="width:127px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques

Cellulaire processen zijn complex en voortvloeien uit het interactie tussen meerdere celtypes en hun omgeving. Bestaande celbiologie technieken staan ​​vaak niet toe voor een nauwkeurige interpretatie van dit interactie. Met behulp van een kwantitatieve beeldvormende aanpak presenteren wij een protocol met een hoog gehalte voor het karakteriseren van de dynamische fenotypische responsen ( dwz morfologische veranderingen, proliferatie, apoptose) van heterogene celpopulaties voor veranderingen in milieu-stimuli. We benadrukken ons vermogen om onderscheid te maken tussen celtypes, gebaseerd op fluorescentieintensiteit of inherente morfologische eigenschappen, afhankelijk van de toepassing. Dit platform zorgt voor een meer uitgebreide karakterisering van subpopulatie respons op verstoring, terwijl kortere tijd, kleinere hoeveelheden reagentia, en lagere kans op fout dan traditionele celbiologie analyses gebruikt worden. In sommige gevallen kan celpopulaties echter moeilijk zijn te identificeren en te kwantificeren op basis van complexe celluLar functies en vereist extra probleemoplossing; We onderstrepen enkele van deze omstandigheden in het protocol. We tonen deze applicatie aan met behulp van reactie op drugs in een kankermodel; Het kan echter makkelijker toegepast worden op andere fysiologische processen. Dit protocol maakt het mogelijk om subpopulaties binnen een co-cultuur systeem te identificeren en de specifieke respons van elk naar externe stimuli te karakteriseren.

We gegenereerd een beeldset bestaande uit 25 velden / putjes, 54 putten / plaatjes (3 celpopulaties x 6 geneesmiddelconcentraties x 3 replicaten), over drie platen voor in totaal 4.050 individuele afbeeldingen. De in de loop van het experiment gegenereerde beeldsets werden geanalyseerd met behulp van proprietary software (zie tabel van materialen) om verschillende kwantitatieve eigenschappen van cellen te trekken ( dwz morfologie, fluorescentie) die vervolgens gebruikt kan worden om cel subpopulaties te classificeren. Aangezien de gebruikte commerciële software beperkte toegang heeft, werden vergelijkbare downstream-pijpleidingen in CellProfiler en CellProfiler Analyst gemaakt. Heterocellulaire classificatie in subpopulaties Nuclei werden geïdentificeerd en gesegmenteerd op basis van de DNA-vlek (hier Hoechst) en celpopulaties werden ingedeeld op basis van fluorescentie of moRfologie ( figuur 1 ). Voor fluorescentie gebaseerde classificatie werden de fibroblasten (CCD-19Lu) eerder getransduceerd met GFP-lentivirus. De GFP-intensiteitsniveaus werden gemeten voor elke kern en die welke werden berekend boven de aanvaarde drempel (gebaseerd op het achtergrondsignaal) werden geclassificeerd als CCD-19Lu, terwijl die hieronder werden geïdentificeerd als tumorcellen (H3255). Voor morfologie gebaseerde classificatie werden cellen eerder gekleurd met een niet-toxische cellulaire vlek (zie de tabel van materialen) en dit werd gebruikt om de cytoplasma te identificeren en te segmenteren. Een machine algoritme werd getraind met ~ 50-100 cellen van elke populatie. Morfologische eigenschappen werden geïdentificeerd die significant verschillend waren tussen de populaties, die vervolgens gebruikt werden om een ​​lineaire classifier te ontwerpen om te onderscheiden tussen CCD-19Lu en H3255 cellen. De classificatieprotocollen voor fluorescentie en morfologie waren 97,4% (n = 1403) concordant bij het onderscheiden van de twee cel populatieAtions in onbehandelde condities en 92,5% (n = 916) concordant bij geneesmiddelbehandelde condities (1 μM erlotinib) ( Figuur 2 ). Fenotypische analyses van subpopulaties Naast het onderscheiden van celtypes streven we naar fenotypische eigenschappen van elke subpopulatie. Multiplexing assays bespaart tijd en reagentia, voegt consistentie toe en geeft aanvullende informatie over het systeem dat wordt onderzocht. Er zijn veel potentiële fenotypische outputs en men moet ze kiezen op basis van de vragen van belang. Hier werden veranderingen in de celmorfologie en levensvatbaarheidsstatus in reactie op erlotinibbehandeling onderzocht. Na drie dagen medicijnbehandeling werd een daling van het nucleaire gebied en een toename van het cellulair gebied van de H3255-cellen ( Figuur 3A ) waargenomen. Het gemiddelde verschil in kerngebied tussenDe populaties van &quot;geen geneesmiddel&quot; en &quot;drug&quot; werden statistisch significant gevonden door middel van een dubbelzijdige type-2 (gelijke variantie) t- test ( p = 7,92 x 10 -16 ). Wij veronderstellen dat deze waarneming een cellulaire reactie is op de stress die wordt opgelegd door middel van geneesmiddelenbehandeling. Het is ook van belang om te onderzoeken of een geneesmiddel cytotoxisch is (dat wil zeggen een toename van het aantal dode cellen in de loop van de tijd) of cytostatische ( dwz afname in aantal celgeborenen over de tijd) effect op cellen, aangezien dit een grote klinische impact heeft. Bijvoorbeeld induceert een cytostatische drugseffect groei arrestatie maar elimineert de cellen niet van de tumor, dus er is het potentieel voor kankercellen om de proliferatie van de cel opnieuw in te tappen zodra het geneesmiddel verwijderd is. Drugseffecten kunnen vaak context, concentratie en afhankelijk celltype zijn. We hebben voorheen erlotinib waargenomen dat een cytotoxische reactie in één celtype werd geëxploiteerd, terwijl ac blijkt te wordenYtostatische respons in een andere 13 . Traditionele levensvatbaarheidsassays uitvoeren relatief cijfersnummer en onderscheiden derhalve niet tussen groeistoornissen en celdood. Hierin werden dode cellen geïdentificeerd op basis van propidiumjodide vlekken ( Figuur 3B ). Beide cytotoxische en cytostatische effecten van erlotinib op H3255-cellen werden waargenomen, met een toename van het aantal sterfgevallen en een afname van het aantal geboortes na de behandeling van geneesmiddelen ( Figuur 3C ). Het is op te merken dat het aantal dode cellen daalt na dag 1, waarschijnlijk als gevolg van celcorrectie. CCD-19Lu-cellen werden niet beïnvloed door het geneesmiddel. Een extra voordeel van dit platform is de opwekking van kwantitatieve data. Bijvoorbeeld in ons co-cultuur experiment werd een eerste subpopulatie van 1.118 (75.8%) H3255 cellen gevonden na 2.8 dagen (87.9%) of 396 (57.2%) zonder of met erlotineIb behandeling, respectievelijk ( figuur 4 ). Omdat we daadwerkelijke celtellingen kunnen genereren in plaats van relatief percentage (zoals bij flow cytometrie methoden) concluderen we dat de verandering in samenstelling tijdens de behandeling van geneesmiddelen het gevolg is van een daling van H3255 cellen en niet een toename van CCD-19Lu. Het is niets waard dat de sterftecijfers onderschat kunnen worden door celcorrectie, die moeilijk experimenteel kan worden beoordeeld en waarschijnlijk verschilt over celtypes. <img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> Figuur 1: Overzicht van het Protocol voor Beeldanalyse. Twee mogelijke stroomafwaartse beeldanalysepijpleidingen om heterocellulaire populaties te classificeren met behulp van een op morfologie gebaseerde classificatie of op fluorescentie gebaseerde classificatie. Schaalstaven = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">Klik alstublieft op haar</a>E om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> Figuur 2: Concordantie tussen Morfologie en Fluorescentie gebaseerde classificatie. ( A ) Concordance plot die de overlapping van de twee classificatieprotocollen toont. De zelfde cellen werden ingedeeld als H3255 met behulp van zowel morfologie- als fluorescentie gebaseerde classificatie. De twee protocollen waren in overeenstemming, met classificatie voor 97,4% (n = 1403) van onbehandelde cellen en 92,5% (n = 916) van de cellen die werden behandeld met erlotinib (Opmerking: het witte gebied is te klein om te visualiseren). ( B ) 10X beelden die voorbeelden tonen van goede en slechte concordantie tussen fluorescentie gebaseerde en morfologie gebaseerde classificatie. De witte pijlen wijzen op cellen die inconsequent zijn ingedeeld tussen platforms. Input image: blue-nuclei (Hoechst); Groen - CCD19Lu (GFP). classiFicatie beelden: Red - H3255; Groen - CCD-19Lu. Schaalbalk = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> Figuur 3: Multiplexe fenotypische metingen uit een enkele experimentele instelling. ( A ) Morfologische kenmerken, zoals kernen en celgebied, werden berekend op het enkelcelniveau in aanwezigheid en afwezigheid van geneesmiddel. Opmerking: celoppervlakken die kleiner zijn dan 100 μm 2 werden beschouwd als puin en werden uitgesloten van analyses. Box-grafiek toont mediaan met eerste en derde kwartielbereik en 95% confidence interval error bars. ( B ) H3255 (blauw) en CCD-19Lu (groene) cellen werden gecultiveerd en dode cellen werden geïdentificeerd op basis van de intensiteit van propideIum iodide vlek (rood) en afgebeeld met behulp van een 10X objectief. Schaalbalk = 1 mm (bovenpaneel); 100 μm (onderafbeeldingen). ( C ) Totaal aantal levende en dode cellen werden over drie dagen berekend met of zonder geneesmiddelbehandeling, met een duidelijke afname in het aantal levende cellen en toename van de doodcellen met toevoeging van erlotinib. Foutbanden vertegenwoordigen standaardfout van het gemiddelde op basis van drie replicaten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> Figuur 4: Subpopulatie Dynamiek over Tijd. Representatieve 10X beelden van putten die H3255 (blauw) en CCD-19Lu (groen) bevatten op dag 0 of dag 3 met en zonder medicijnen. Cellen die behoren tot elke subpopulatie werden geteld en proportionele taartdiagrammen tonen de aCtual verandering in populatie samenstelling over monsters. Schaalstaven = 1 mm (middenpanelen, ingepakt in; achterste paneel), 1 mm (bovenste beeld), 100 μm (onderafbeeldingen). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques at JoVE.com

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

We hebben een nieuw protocol ontwikkeld voor het bestuderen van heterocellulaire populatie dynamiek in reactie op verstoringen. Dit manuscript beschrijft een beeldvormend platform dat kwantitatieve datasets produceert voor gelijktijdige karakterisering van meerdere cellulaire fenotypen van heterocellulaire populaties op een robuuste manier.

Discriminatie en karakterisering van heterocellulaire populaties met behulp van kwantitatieve beeldvormingstechnieken

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Technieken voor Imaging Ca 2 + Signalering in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Micro-mechanische karakterisatie van Lung weefsel met behulp van Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Meten Intracellulaire Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Technieken voor Imaging prometaphase metafase van de meiose I in Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...