Name: discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques
Uploaded: 2017-06-30T15:00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av National Cancer Institute (NCI) Grants U54CA143798 og U54CA143907 for å etablere Fysisk Vitenskap-Oncology Centers (PS-OCs) ved henholdsvis Dana-Farber Cancer Institute og University of Southern California. SM Mumenthaler mottok en PS-OC transnetwork-pris som støttet noe av dette arbeidet. Vi ønsker å uttrykke vår dypeste takknemlighet til våre filantropiske tilhørere, spesielt Stephenson-familien, Emmet, Toni og Tessa, for deres donasjon av Operetta HCS-plattformen. Vi vil også takke J. Foo for veiledning, og senter for anvendt molekylærmedisinteam: D. Agus for klinisk veiledning og mentorskap, K. Patsch for meningsfulle diskusjoner med eksperimentell design, R. Rawat for hjelp i bildeanalyseprotokoller , J. Katz for teknisk assistanse med operettaen, og P. Macklin og D. Ruderman for nyttige diskusjoner og tilbakemeldinger.

1. Cell Culture MERK: Her er fenotypiske responser av NSCLC-celler (H3255) til EGFR-målingsmiddelet, erlotinib, undersøkt ved samtidig kultivering med lungefibroblaster (CCD-19Lu GFP). For det samme datasettet ble fluorescensbasert og morfologi-basert klassifisering av de to cellepopulasjonene (H3255 og CCD-19Lu GFP) for å eksemplifisere deres konkordans utført. Imidlertid må bare én klassifiseringsmetode brukes og bør velges basert på søknaden. <ol><li> Forbered 500 ml RPMI-1640 tilsatt 10% varmeinaktivert FBS og 1% penicillin / streptomycin. MERK: Vekstmediet og kosttilskudd kan erstattes etter behov for andre celletyper. </li><li> Kulturceller i 10 cm 3 plater som rene populationer i 5% CO 2 ved 37 ° C og passerer det ved passende forhold hver tredje til fire dager. </li></ol> 2. Fremstilling av celler <ol><li> For å klargjøre en cellesuspensjon, fjern cEll media og vaskeceller med 5 ml 1 x fosfatbuffert saltvann (PBS). </li><li> Aspirer av PBS, tilsett 1 ml 0,05% trypsin oppvarmet til 37 ° C og inkuber i 5 minutter (eller til celler ikke lenger er festet til plate) ved 37 ° C. </li><li> For å nøytralisere trypsin, tilsett 4 ml RPMI til H3255 og CCD-19Lu GFP-plater og piper celleløsningene i 15 ml koniske rør. </li><li> Sentrifuger celler ved 150 xg i 5 minutter ved RT. </li><li> Aspirer av supernatanten og resuspender cellepellets i 10 ml RPMI media i koniske rør for å forberede seg på såing. </li></ol> 3. Cell Plating <ol><li> Telle cellene for å standardisere såing. <ol><li> Inverter rør for å blande celler i oppløsning. Pipetter 10 μl av hver cellesuspensjon i et mikrocentrifugerør og tilsett 10 μL trypanblå. </li><li> Pipetter 10 μL av denne løsningen i en celle telling lysbilde og sett inn i automatisert celle teller. MERK: Andre metoder for celletelling ( dvs.. Hemocytometer) kan brukes. </li><li> Gjenta celletallet minst tre ganger, eller til oppnådde teller er konsistente. </li></ol></li><li> Sædceller på en multi-brønnplate MERK: Antall plater til frø er avhengig av antall tidspunkter som skal avbildes. Alternativt kan en plate bli reflektert over tid hvis cellene transduseres med histon-2B-GFP (eller andre stabile lentivirale nukleære flekker som gir tilstrekkelig kjernesegmentering). <ol><li> Ses totalt 1500 celler / brønn i 100 μl RPMI. Klargjør tre celle suspensjoner til plate tre cellepopulasjoner: H3255, CCD-19Lu GFP og 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Utfør hver i tre eksemplarer med identiske plateoppsett for hvert tidspunkt. MERK: Initial sjødensitet bør optimaliseres for hver cellelinje og tallerkenstørrelse. </li><li> Frøceller i 3 x 96 brønnplater ved hjelp av en flerkanalspipett. Inkubér celler O / N ved 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Doseringsdosering <ol><li> Tilsett DMSO til erlotinibpulver for å lage en endelig erlotinib stamløsning med 10 mM konsentrasjon. MERK: Legemidlet kan erstattes etter ønske. </li><li> Fortynn stoffet med cellekulturmedium til 2x sluttkonsentrasjonen med den høyeste sluttkonsentrasjonen ved 10 μM og serielt fortynnet fire ganger ved et 1:10 forhold, for totalt fem legemiddelkonsentrasjoner og ingen medisinsk kontroll. MERK: Hvis konsentrasjonen av DMSO er lik eller overstiger 0,1% v / v ved høyest dosisdose, bør ingen medisinsk kontroll inneholde tilsvarende mengde DMSO for å sikre at observerte virkninger ikke skyldes DMSO-toksisitet. </li><li> Pipetter 100 μL medikamentoppløsning i riktig brønn for en endelig medisinsk konsentrasjon på 1 x fortynnet i media. </li></ol> 5. Image Acquisition MERK: Bilder ble ervervet på dagene 0, 2 og 3. Avhengig av celletyper og cellulære prosesser som studeres, oDe ønskede tidspunkter kan studeres. <ol><li> Stainceller for å forberede seg på avbildning. <ol><li> Fargestoffer oppløses ved følgende sluttkonsentrasjoner. <ol><li> For fluorescensbasert klassifisering, lag 5 μg / ml nuklear flekk og 5 μM dødcelle flekk i PBS (se tabell over materialer ). </li><li> For morfologi-basert klassifisering, lag 5 μg / ml nuklear flekk, 5 μM dødcelleflekk og 5 μM celleflekk i PBS (se tabell over materialer ). </li></ol></li><li> Tilsett 20 μL fargestoffløsning til hver brønn. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C beskyttet mot lys. </li></ol></li><li> Optimaliser og kjøp bilder. <ol><li> Fjern brønnplaten fra inkubatoren, tørk bunnen av platen med 70% EtOH, og legg platen i bildekammeret. </li><li> I kategorien &#39;Oppsett&#39; klikker du på &#39;+&#39; knappen under &#39;Kanalvalg&#39; for å legge til passende kanaler tilBilde ( dvs. lysfelt, nukleær flekk, dødcelleflekk, GFP og RFP signaler). </li><li> Klikk &quot;Layout Selection&quot;, og ta z-stablet testbilder hver 2 μm ved 0 μm og slutt på 20 μm for å identifisere fokusplanet. Skriv inn denne avstanden for hver kanal under &#39;Høyde&#39;. </li><li> Klikk på &quot;Stillbilde&quot; under hver kanal for å evaluere intensiteter og optimalisere eksponeringstidene. Skriv inn høyere eller lavere verdier under &#39;Tid&#39; etter behov. </li><li> På høyre side av skjermen markerer du passende brønner (som skal vises) på platen skjematisk. I brønnene som er skjematisk under, markere de tjuefem feltene som skal avbildes på samme måte. </li><li> Under &#39;Run Experiment&#39;, merk platen i &#39;Plate Name&#39; på venstre faneblad, og klikk på &#39;Start&#39; -knappen (under) for å kjøre bildeoppkjøpsprotokollen med et 10X-mål for å generere gråskala-TIFF-bilder i de nevnte kanalene. MERK: Steg-for-trinn instForandringer for bildebehandlingsprotokoll kan variere mellom instrumenter, men parameterverdier bør fortsatt optimaliseres. </li><li> Gjenta bildebehandlingen på dagene to og tre. </li></ol></li></ol> 6. Bildeanalyse MERK: All bildeanalyse ble utført ved hjelp av proprietær programvare. Men fordi dette ikke er offentlig tilgjengelig, ble også sammenlignbare analyser utformet på CellProfiler 2.2 og CellProfiler Analyst 2.0, med en kort protokoll som er oppført nedenfor og detaljert protokoll som tilleggsutstyr (testbilder er allerede lastet inn i rørledninger for å teste arbeidsflyten). Bildene fra dette eksperimentet ble gruppert sammen per brønn slik at hver brønn kunne lastes individuelt. CellProfiler-rørledningene nedenfor inneholder et vanlig uttrykk som analyserer metadatainformasjon fra hvert bildefilnavn og lar bildene grupperes videre etter kanal. <ol><li> Last ned og installer open source-programvaren: &#39;CellProfiler9; Og &#39;CellProfiler Analyst&#39;. Godta alle standardalternativer og tilleggsprogrammer under installasjonen. </li><li> Klassifiser heterocellulære kulturer i subpopulasjoner. <ol><li> Åpne &#39;CellProfiler&#39; -programvaren, klikk &#39;File&#39; | &#39;Importrørledning&#39; | &#39;Fra fil&#39; og velg riktig fil (&quot;Fluorescence_Classification.cppipe&quot; for fluorescensbasert klassifisering , eller &quot;Morphology_Classification.cppipe&quot; for morfologi-basert klassifisering). MERK: Disse filene inneholder protokoller for grunnleggende bildebehandling og kjerner / celle segmentering. På grunn av den ujevne Hoechst-flekken som er tilstede over disse cellene, ble kjerne segmentert og forstørret, og deretter brukt til å maskere bildet for å tillate segmentering av kjerner med lavere intensiteter. <ol><li> Velg fluorescensbasert klassifiseringsrørledning for å klassifisere celler som enten H3255 eller CCD-19Lu basert på eGFP-intensitet, og å beregne morfologiske funksjoner. MERK: CCD-19Lu-celler ble transdusert med GFP. </li><li> Velg den morfologibaserte klassifikasjonsrøret for å segmentere kjerner og celler, og beregne morfologiske funksjoner. MERK: Ytterligere nedstrømsanalyse i &#39;CellProfiler Analyst&#39; er nødvendig for klassifisering. Døde celler klassifiseres via fluorescensbasert klassifisering. </li></ol></li><li> Klikk på &#39;Vis utdatainnstillinger&#39; nederst til venstre på skjermen. Velg plasseringen av bildefiler for analyse (&#39;Standardinnmatingsmappe&#39;) og destinasjonen for utvunnet data (&#39;Standardutmatingsmappe&#39;). </li><li> Klikk på &quot;Analyser bilder&quot; for å starte analysen. Når analysen er fullført, klikk &quot;OK&quot; og gå til &quot;Standard Output Folder&quot; for å vise de beregnede dataene. MERK: Eksempelparameterverdier og bilder er tilgjengelige i Supplemental File 1-CellProfilerProtocol.pdf . </li><li> For morfologi-basert klassifisering (bare) gjør følgende. <ol><li> Åpne &#39;CellProfiler Analyst&#39; -programvare, velg databaseegenskapsfilen som er generert i CellProfiler, og klikk &#39;Åpne&#39;. </li><li> Klikk kategorien &#39;Klassifiserer&#39; øverst til venstre på skjermen. For å ringe tilfeldige cellebilder fra eksperiment, klikk på &quot;Hent&quot;; Bilder vil vises i det uklassifiserte vinduet. </li></ol></li><li> Klassifiser celler manuelt som positivt (H3255) eller negativt (CCD-19Lu) ved å velge og dra celler til riktig bin (se Supplemental File 2-Pipeline.pdf : Figur B ). Etter å ha klassifisert minst 50 celler per subpopulasjon, klikk &#39;Tren klassifiserer&#39;, og klikk deretter &#39;Sjekk fremgang&#39;. MERK: Celler klassifiseres via en bruker-overvåket tilfeldig algoritme for skovmaskin 12 . Hvis nøyaktigheten ikke er over godkjent grense (&gt; 90%), kan det være nødvendig å gå tilbake og optimalisere celle segmentering på &#39;CellProfiler&#39;, eller cellene er kanskje ikke ideelle for classiFying av morfologi. </li><li> Klikk på &quot;Score alle&quot; for å generere et bord med celleverdier for hver subpopulasjon. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kanemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+proliferative+activity+of+human+fetal+neural+stem/progenitor+cells+using+indirect+measurements+of+viable+cells+based+on+cellular+metabolic+activity.">Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity.</a> J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).</li><li>Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+pH+dependence+of+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium+bromide-formazan+absorption+on+chemosensitivity+determined+by+a+novel+tetrazolium-based+assay.">Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay.</a> Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).</li><li>Hsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+polyphenols+induce+differentiation+and+proliferation+in+epidermal+keratinocytes.">Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).</li><li>Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+in+image-based+profiling+of+perturbations.">Applications in image-based profiling of perturbations.</a> Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).</li><li>Sero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+and+the+microenvironment+regulate+nuclear+translocation+of+NF-kappaB+in+breast+epithelial+and+tumor+cells.">Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells.</a> Mol Syst Biol. 11 (3), 790 (2015).</li><li>Chen, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclassification+of+prostate+cancer+circulating+tumor+cells+by+nuclear+size+reveals+very+small+nuclear+circulating+tumor+cells+in+patients+with+visceral+metastases.">Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases.</a> Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).</li><li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound.">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li><li>Paraiso, K. H., Smalley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast-mediated+drug+resistance+in+cancer.">Fibroblast-mediated drug resistance in cancer.</a> Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens.">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9, 482 (2008).</li><li>Dao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+interactive+data+exploration,+analysis+and+classification+of+large+biological+image+sets.">CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).</li><li>Garvey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+image-based+method+for+quantitatively+studying+context-dependent+cell+population+dynamics.">A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics.</a> Sci Rep. 6, 29752 (2016).</li><li>Juarez, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+differences+in+cell+line+population+dynamics+using+CellPD.">Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD.</a> BMC Syst Biol. 10 (1), 92 (2016).</li><li>Mumenthaler, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Microenvironmental+Heterogeneity+on+the+Evolution+of+Drug+Resistance+in+Cancer+Cells.">The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells.</a> Cancer Inform. 14, 19-31 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features. 
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately. 
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations. 
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.

Cellbaserte analyser har vært en arbeidshest i grunnleggende forsknings- og stoffutviklingsinnstillinger. Begrensningene i disse standardanalysene har imidlertid blitt tydeligere med uoverensstemmelsen mellom in vitro og kliniske data og sviktet i de fleste medisiner for å motta FDA-godkjenning. Her presenterer vi en ny metode for utnyttelse av kvantitativ bildebehandling for samtidig å analysere heterocellulære fenotyper som respons på relevante, sammenfallende miljøstimuli. Tradisjonelle cellebaserte analyser som brukes til å måle celle-levedyktighet inkluderer: trypanblå ekskluderingsanalyser, MTT / MTS og Annexin V-FITC-flowcytometri-farging. Trypan Blue Exclusion-analyser, mens de er enkle og billige, krever et stort antall celler, er tidkrevende, og er ofte påvirket av brukerforstyrrelser 1 . MTT- og MTS-analyser måler indirekte celle-levedyktighet gjennom målinger av mitokondriell metabolisk hastighet. Men den metabolske aktiviTy av celler kan påvirkes av forskjellige kulturbetingelser (som media eller oksygenkonsentrasjon), noe som fører til unøyaktige resultater og forhindrer standardisering over celletyper og forhold 2 , 3 . En annen stor ulempe ved disse teknikkene er deres manglende evne til å skille mellom flere celletyper - de fleste biologiske systemer er heterocellulære. Selv om strømningscytometri-metoder har mulighet til å skille mellom flere cellepopulasjoner, er det nødvendig med celleetiketter, dynamisk prøvetaking er utfordrende, og når du bruker vedhæftende celler, blir denne applikasjonen tidkrevende og feilproblemer. Andre viktige cellulære fenotyper, inkludert morfologiske forandringer, forekommer som respons på miljøstimuli, men er ikke fanget av tradisjonelle cellebaserte analyser. Profiling celle stater gjennom morfologisk karakterisering og kartlegging likheter over prøver er et kraftig, upartisk verktøy med aEvne til å gi ny innsikt i mange aspekter av grunnleggende og translationell forskning, inkludert grunnleggende cellebiologi og legemiddelfunn 4 . Videre har tumorcellemorfologi vist seg å korrelere med tumor subtypes 5 og aggressivitet 6 . Det er derfor av stor interesse å studere disse cellulære funksjonene og hvordan de relaterer seg til spesifikke miljøforstyrrelser. I tillegg kan man bruke forskjeller i morfologiske egenskaper for å diskriminere mellom subpopulasjoner i medkultursystemer. Fluorescensmerkende celler har nedfall ( dvs. endring av inneboende celleegenskaper, tidkrevende) og derfor er ytterligere metoder for å klassifisere celletyper fordelaktige. Mikroskopibasert bildebehandling er en alternativ metode for profilering av cellulære fenotyper på en multiplekset, kvantitativ og robust måte. I dette manuskriptet bruker vi vår kvantitative bildebehandlingsrørledning for å markere evolutioNary dynamikk av heterogene cellepopulasjoner i en tumor. Vi fokuserer på samspillet mellom ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) -celler og kreft-assosierte fibroblaster (CAF), den mest utbredte stromalcelletypen som finnes i svulster. CAF har blitt implicert i tumorinduksjon, progresjon og terapeutisk respons; Derfor kan utførelse av fenotypiske analyser på tumorceller i fravær av CAFs være misvisende 7 , 8 , 9 . Spesifikt vurderte vi effekter av CAF på tumorceller som respons på erlotinib, et lite molekyl som målretter mot Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) som ofte brukes i klinisk behandling av NSCLC. Vi benyttet en high-end screening plattform og den tilhørende bildeanalysen programvare for evaluering; Men i et forsøk på å gjøre denne metoden tilgjengelig for andre forskere har vi også utviklet en sammenlignbar nedstrømsprotokoll ved hjelp av open source-programvaren:CellProfiler 10 og CellProfiler Analyst 11 . De fleste bildebaserte høyindholdsscreeningsanalyser analyseres med kommersialisert programvare som er spesifikk for en gitt instrumentmodell. Resultatene er vanskelige å replikere i andre laboratorier med annen programvare fordi de underliggende algoritmene ofte er proprietære. Ved bruk av denne bildebaserte pipeline ble celleproliferasjon, død og morfologi for hver subpopulasjon av en heterocellulær kultur som respons på medikamentbehandling ved bruk av både fluorescens- og morfologibasert klassifisering målt. Følgende protokoll gir en robust metode for å undersøke komplekse cellulære prosesser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:191px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">FBS</td>
			<td style="width:127px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15-140-122</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20 slides with trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450003</td>
			<td>cell counter slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">96-well plates</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td>clear bottom black plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Erlotinib</td>
			<td style="width:127px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">E-4007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">DMSO</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">317275-100ML</td>
			<td>solution to resuspend drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Hoechst</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">H21491</td>
			<td>nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td>dead cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Cell Tracker Orange CMRA</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
			<td>whole cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Operetta high content imaging system</td>
			<td style="width:127px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:127px;">Broad Institue</td>
			<td style="width:119px;">version 2.2.0 (rev 9969f42)</td>
			<td>http://cellprofiler.org/releases/</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 &#186;C at 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">15 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:240px;">10 cm2 cell culture plates</td>
			<td style="width:127px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques

Cellular prosesser er komplekse og skyldes samspillet mellom flere celletyper og deres miljø. Eksisterende cellebiologi teknikker tillater ofte ikke nøyaktig tolkning av dette samspillet. Ved hjelp av en kvantitativ bildebasert tilnærming presenterer vi en høyinnholdsprotokoll for å karakterisere de dynamiske fenotypiske responsene ( dvs. morfologiske endringer, proliferasjon, apoptose) av heterogene cellepopulasjoner til endringer i miljøstimuli. Vi markerer vår evne til å skille mellom celletyper basert på enten fluorescensintensitet eller iboende morfologiske funksjoner, avhengig av applikasjonen. Denne plattformen tillater en mer omfattende karakterisering av subpopulasjonsrespons på forstyrrelser mens man bruker kortere tid, mindre mengder reagenser og lavere sannsynlighet for feil enn tradisjonelle cellebiologiske analyser. I noen tilfeller kan imidlertid cellepopulasjoner være vanskelige å identifisere og kvantifisere basert på kompleks celluLar funksjoner og vil kreve ekstra feilsøking; Vi fremhever noen av disse omstendighetene i protokollen. Vi demonstrerer denne applikasjonen ved hjelp av respons på stoff i en kreftmodell; Det kan imidlertid lett brukes mer bredt til andre fysiologiske prosesser. Denne protokollen tillater en å identifisere subpopulasjoner innenfor et samkultur system og karakterisere den spesielle responsen til hver til eksterne stimuli.

Vi genererte et bilde sett bestående av 25 felt / brønn, 54 brønner / plate (3 cellepopulasjoner x 6 legemiddelkonsentrasjoner x 3 replikater), på tvers av tre plater for totalt 4.050 individuelle bilder. Bildesettene som ble generert i løpet av forsøket ble analysert ved hjelp av proprietær programvare (se tabell over materialer) for å trekke ut ulike kvantitative egenskaper av celler ( dvs. morfologi, fluorescens) som deretter kunne brukes til å klassifisere cellepopulasjoner. Men fordi den kommersielle programvaren som brukes har begrenset tilgang, ble det opprettet sammenlignbare nedstrøms rørledninger i CellProfiler og CellProfiler Analyst. Heterocellulær klassifisering i subpopulasjoner Nuklein ble identifisert og segmentert basert på DNA-flekken (her Hoechst) og cellepopulasjoner ble klassifisert enten basert på fluorescens eller moRfologi ( figur 1 ). For fluorescensbasert klassifisering ble fibroblastene (CCD-19Lu) tidligere transdusert med GFP-lentivirus. GFP-intensitetsnivåene ble målt for hver kjerne, og de som ble beregnet over den aksepterte grense (basert på bakgrunnssignalet) ble klassifisert som CCD-19Lu mens de nedenfor ble identifisert som tumorceller (H3255). For morfologi-basert klassifisering ble celler tidligere farget med en ikke-giftig cellulær flekk (se tabell over materialer) og dette ble brukt til å identifisere og segmentere cytoplasma. En maskinlæringsalgoritme ble trent med ~ 50-100 celler fra hver populasjon. Morfologiske egenskaper ble identifisert som var signifikant forskjellig mellom populasjonene, som deretter ble brukt til å designe en lineær klassifikator for å skille mellom CCD-19Lu og H3255-celler. Fluorescens- og morfologi-klassifikasjonsprotokollene var 97,4% (n = 1403) konsistente ved å skille mellom de to cellefolkeneAtioner i ubehandlede forhold og 92,5% (n = 916) konkordant i legemiddelbehandlede forhold (1 μM erlotinib) ( figur 2 ). Fenotypiske analyser av delpopulasjoner I tillegg til å diskriminere mellom celletyper, hadde vi som mål å karakterisere fenotypiske egenskaper for hver subpopulasjon. Multipleksanalyser sparer tid og reagenser, legger til konsistens og gir ytterligere informasjon om systemet som studeres. Det er mange potensielle fenotypiske utganger, og man bør velge dem basert på spørsmålene av interesse. Her ble endringer i cellemorfologi og levedyktighetsstatus som respons på erlotinibbehandling undersøkt. Etter tre døgn medikamentbehandling ble det observert en reduksjon i kjernefysisk område og en økning i cellulært område av H3255-cellene ( figur 3A ). Den gjennomsnittlige forskjellen i nukleare området mellomBehandlingspopulasjonene &quot;nei medikament&quot; og &quot;medikament&quot; ble funnet å være statistisk signifikante via en tosidig type 2 (lik varians) t- test ( p = 7,92 x 10-16 ). Vi antar at denne observasjonen er en cellulær respons på stresset som påføres ved behandling av legemidler. Det er også interessant å undersøke om et legemiddel har en cytotoksisk ( dvs. økning i antall døde celler over tid) eller cytostatisk ( dvs. reduksjon i antall cellefødsler over tid) på celler, da dette har dyp klinisk effekt. For eksempel fremkaller en cytostatisk medikamentvirkning vekstarrest, men eliminerer ikke cellene fra svulsten, og det er således potensial for kreftceller til å reinitere celleproliferasjon når stoffet er fjernet. Narkotikaeffekter kan ofte være kontekst, konsentrasjon og celletype avhengig. Vi har tidligere observert erlotinib fremkallende en cytotoksisk respons i en celletype, mens du viser acYtostatisk respons i en annen 13 . Tradisjonelle levedyktighetsanalyser utleverer relativ celle nummer og diskriminerer derfor ikke mellom vekststans og celledød. Her ble døde celler identifisert basert på propidiumjodidflekk ( figur 3B ). Både cytotoksiske og cytostatiske effekter av erlotinib på H3255-celler ble observert, med en økning i antall dødsfall og en nedgang i antall fødsler etter behandling av medisin ( figur 3C ). Det er verdt å merke seg at antall døde celler faller etter dag 1 sannsynligvis på grunn av celleklarering. CCD-19Lu-celler ble ikke påvirket av medikamentet. En ekstra fordel med denne plattformen er genereringen av kvantitative data. For eksempel ble det funnet å være 2,817 (87,9%) eller 396 (57,2%) etter 3 dager uten eller med erlotin i en samkultureksperiment, en initial subpopulasjon av 1,118 (75,8%) H3255-celler.Ib behandling, henholdsvis ( figur 4 ). Fordi vi kan generere faktiske celleverdier i stedet for relativ prosentandel (som med flytcytometri-metoder), konkluderer vi at endringen i sammensetningen under behandling av medisiner skyldes en reduksjon i H3255-celler og ikke en økning i CCD-19Lu. Det er ingenting verdt at dødsrater kan undervurderes på grunn av celleklarering, noe som er vanskelig å vurdere eksperimentelt og sannsynligvis er forskjellig på tvers av celletyper. <img alt="Figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> Figur 1: Oversikt over bildeanalyseprotokollen. To potensielle nedstrøms bildeanalysepipelinjer for å klassifisere heterocellulære populasjoner ved bruk av enten morfologi-basert klassifisering eller fluorescensbasert klassifisering. Skalestenger = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk henne</a>E for å se en større versjon av denne figuren. <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> Figur 2: Konkordans mellom morfologi og fluorescensbasert klassifisering. ( A ) Concordance plot som viser overlappingen av de to klassifikasjonsprotokollene. De samme celler ble klassifisert som H3255 ved bruk av både morfologi- og fluorescensbasert klassifisering. De to protokollene var enige, med klassifisering for 97,4% (n = 1403) av ubehandlede celler og 92,5% (n = 916) av celler behandlet med erlotinib (Merk: det hvite området er for lite til å visualisere). ( B ) 10X bilder som viser eksempler på god og dårlig sammenheng mellom fluorescensbasert og morfologisk-basert klassifisering. De hvite pilene peker ut celler som ble inkonsekvent klassifisert mellom plattformer. Input image: blue-nuclei (Hoechst); Grønn - CCD19Lu (GFP). klassifisertFication bilder: Rød - H3255; Grønn - CCD-19Lu. Skalbjelke = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> Figur 3: Multiplexerte fenotypiske målinger fra en enkelt eksperimentell oppsett. ( A ) Morfologiske egenskaper, som for eksempel kjerne og celleareal, ble beregnet på enkeltcellens nivå i nærvær og fravær av medikament. Merk: Cellarealer som måler mindre enn 100 μm 2 ble vurdert som avfall og utelukket fra analyser. Boksplott avbilder median med første og tredje kvartilområder og 95% konfidensintervallfeilstenger. ( B ) H3255 (blå) og CCD-19Lu (grønne) celler ble ko-dyrket og døde celler ble identifisert basert på intensiteten av propidIumjodidfarge (rød) og avbildet ved hjelp av et 10X-objektiv. Skalbjelke = 1 mm (topppanel); 100 μm (bunnbilder). ( C ) Totalt antall levende og døde celler ble beregnet over tre dager med eller uten medisinsk behandling, med en åpenbar reduksjon i antall levende celler og økning i døde celler med tilsetning av erlotinib. Feilstenger representerer standard feil av gjennomsnittet basert på tre replikater. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> Figur 4: Subpopulasjonsdynamikk over tid. Representative 10X bilder av brønner som inneholder H3255 (blå) og CCD-19Lu (grønn) på dag 0 eller dag 3 med og uten medikament. Celler som tilhører hver subpopulasjon ble talt og proporsjonale kakediagrammer viser aEndring i befolkningssammensetningen på tvers av prøver. Skalestenger = 1 mm (midtpaneler, shpwn i; ytterste panel), 1 mm (toppbilde), 100 μm (bunnbilder). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques at JoVE.com

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Vi har utviklet en romanprotokoll for å studere heterocellulær populasjonsdynamikk som respons på forstyrrelser. Dette manuskriptet beskriver en bildebasert plattform som produserer kvantitative datasett for samtidig karakterisering av flere cellulære fenotyper av heterocellulære populasjoner på en robust måte.

Diskriminering og karakterisering av heterocellulære populasjoner ved bruk av kvantitative bildebehandlingsteknikker

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Identifisering og karakterisering av protein glykosylering med bestemte endo-og exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analyse av Autophagy med Avansert 3D fluorescens mikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Måling Intracellulær Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Endring i Menneskelig Sperm bruker Fire Teknikker: Konvensjonell fluorometri, Stoppet Flow fluorometri, flowcytometrisystemer og Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse av mRNA molekyler med fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker for analyse av Ekstracellulær Blemmer ved hjelp av flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Utvikling og karakterisering av<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvessel Nettverk og kvantitative målinger av endotel [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Og nitrogenoksid produksjon

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Teknikker for Imaging prometafase og meta av Meiose jeg i Fast<em&gt; Drosophila</em&gt; oocytter

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...