Name: three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration
Uploaded: 2018-01-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration at JoVE.com

Finansielle støtte blev leveret fra National Institutes of Health [U01-NS094340 (Cullen) & F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Foundation [terapeutiske Pipeline Program #9998 (Cullen)], Penn medicin neurovidenskab Center Pilot Award (Cullen), National Science Foundation [Graduate Research stipendier DGE-1321851 (Struzyna)], Department of Veterans anliggender [RR & D Merit anmeld #B1097-jeg (Cullen)], og den amerikanske hær medicinsk forskning og Materiel kommando [#W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Alle procedurer blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg på University of Pennsylvania og Michael J. Crescenz veteraner anliggender Medical Center og overholdt retningslinjerne i NIH Public Health Service politik på human Pleje og brugen af forsøgsdyr (2015).
1. udvikling af Agarosen Hydrogel mikro-kolonner
<ol><li>Gøre en Agarosen 3% vægt/volumen (w/v) opløsning af vejer 3 g af Agarosen og overføre den til et sterilt bæger indeholdende 100 mL Dulbeccos fosfatbuffe...

Sammenlignet med de mere støttende miljø af PNS, forringes CNS især ved håndtering af de skadelige konsekvenser af neurotrauma og neurodegeneration. Efter en alvorlig fornærmelse til pattedyr CNS dannes en glial ar, bestående af en kerne af fibrotisk og inflammatoriske celler omgivet af en tæt meshwork af uorganiseret reaktive astrocytter, der udskiller axon udvækst-hæmmende proteoglycaner14. Dette ar fungerer som en fysiske og biokemiske obstruktion mod regenerering af axon endelser<sup ...

Det centrale nervesystem (CNS) har en begrænset kapacitet til at modvirke tab og/eller dysfunktion af neuroner og cytoskeletale veje, der ledsager betingelser såsom traumatisk hjerneskade (TBI), slagtilfælde, rygmarv skade (SCI), og neurodegenerative sygdomme1 ,2,3,4,5. Neurogenese i CNS er begrænset til et begrænset antal områder i hjernen, hæmmer genoprettelse af tabte neuroner6,7. Derudover er regenerering af tabt cytoskeletale veje i CNS utilstrækkelig på grund af manglen på styret vejledning, tilstedeværelsen af udvækst hæmmere og reaktive astrogliosis efter skader til neurale væv2,8, 9,10. Astrocytter har typisk forskellige funktioner i bistå neuroner med ion homøostase, neurotransmitter clearance, synapse dannelse og neurovaskulært kobling11. Ikke desto mindre kan astrocytter efter endda milde skader på neurale væv underkastes Molekylær, strukturelle og funktionelle ændringer som de overgang til en hypertrofisk stat11. Reaktion på svær neurotrauma resultere disse ændringer i dannelsen af et ar med en penumbra indeholdende overflytter reaktive astrocytter og en læsion kerne, der omfatter leukocytter lækket fra bristet blod - hjerne barrieren (BBB), mikroglia, oligodendrocytes, og fibroblaster11,12,13. Disse reaktive astrocytter nå en morfologi af fintrådede, uorganiseret processer og udviser øget udtryk for mellemliggende glødetrådens proteiner og chondroitin sulfat proteoglycaner (CSPGs), hvilket hindrer neurale regenerering12. Selvom glial arret oprindeligt hjælper genindføre BBB integritet og undgå overførsel af den inflammatoriske reaktion på omkringliggende raske væv, tjener det som en fysisk og biokemisk barriere mod axon regenerering12,14 ,15,16. For eksempel, axoner, der støder glial arret vise løgformet dystrofe vækst kegler og hæmmet vækst12. Derudover hindrer uorganiseret astrocytic processer efter skade udvidelsen af regenererende axoner17. Resultatet af disse hæmmende egenskaber er manifesteret i de ofte-permanent fysiske og neurologiske handicap, at patienter lider efter alvorlige neurotrauma, herunder TBI og SCI.
Uanset de ydre udfordringer funktionelle regenerering i CNS, har axoner vist sig at besidde en iboende evne til at regenerere. For eksempel, tyder den dynamiske karakter af dystrofe vækst kegler i kontakt med glial arret på, at disse endelser bevarer deres evne til at udvide12. Derfor, det menes, at en vigtigste hindring for cytoskeletale re-vækst er den hæmmende miljø efter skade CNS og det giver en mere eftergivende miljø via nedsætte glial ardannelse og/eller leverer regenerativ broer på tværs af arret vil være fordelagtig. Faktisk, tidligere undersøgelser har vist at CNS neuroner var i stand til at udvide axoner via en læsion ved hjælp af perifere nerve grafts som broer, som udgør et gunstigere miljø for axon regenerering12,18, 19. Flere andre strategier har været forfulgt for at udnytte denne rudimentære regenerationsevne. For eksempel, har manipulation af celle vækst signaling veje i forskellige skade modeller resulteret i cytoskeletale regenerering og glial ar reduktion10,20,21. Desuden, har undersøgelser vist, at behandling med chondroitinase ABC, som kløver fleste for sukker kæderne i CSPGs, mindsker den hæmmende effekt af CSPGs udskilles af reaktive astrocytter22. Trods opmuntrende resultater, disse tilgange giver ikke instrueret vejledning af vækst kegler, som kan potentielt resultere i afvigende regenerering12, og også ikke højde for tab af neuroner. Celle-baserede tilgange har været udnyttet i forsøg på at overvinde virkningerne af glial arret og genopbygge tabt celler, især neuroner. Nogle grupper har dedifferentiated reaktiv astrocytter til neuroner, mens andre har transplanterede neurale stamceller i CNS læsioner til repopulate området skade og fremme axon regenerering23,24, 25. dog stamcelletransplantation alene er begrænset af lav overlevelsesrate, dårlig integration og beskedne fastholdelse i beskadiget væv5. Derudover undlader disse celle-baserede strategier at gendannelse langdistance cytoskeletale skrifter, især på en kontrolleret måde. Derfor, biomaterialer i kombination med andre tilgange er ved at blive undersøgt som levering køretøjer til forskellige neurale og stamceller og vækst faktorer26. Biomateriale-baserede tilgange har en høj grad af kontrol til at producere konstruktioner, der efterligner den specifikke fysiske, haptotaxic, og chemotaxic stikord til stede i de tre-dimensionelle (3D) mikromiljø target host væv27, 28,29,30,31,32,33,34. Reproduktion af disse miljømæssige signaler er altafgørende for transplanterede celler præsentere native-lignende morfologi, spredning, migration og signalering, blandt andre neurobiologiske karakteristika29. Trods disse fordelagtige egenskaber er avancement ud over traditionelle celle seedede biomateriale stilladser påkrævet samtidig fremme styret langdistance cytoskeletale regenerering og erstatte tabte neuroner.
En lovende alternativ tilgang er baseret på neurale væv manipuleret "levende stilladser", som adskiller sig fra andre celle-baserede tilgange på grund af tilstedeværelsen af levende neurale celler med en præfabrikerede cytoarchitecture, der emulerer indfødte Neuroanatomi og/eller udviklingsmæssige mekanismer til fremme af målrettet udskiftning, genopbygning og genrejsning af neurale kredsløb4,35. Overvejelser ved design af levende stilladser omfatter fænotyper og kilder af neurale celler samt de mekaniske/fysiske egenskaber og de biokemiske signaler dikteret af sammensætningen af eventuelle ledsagende biomaterialer35. Efter fabrikation i vitro, disse levende stilladser kan være implanteret i vivo til stede celle-adhæsionsmolekyler og kemotaktisk og neurotrope signaler til aktivt regulere neurale celle migration og axon udvækst afhængigt af staten og progression af regenerative processer35. Gliaceller kan tjene som grundlag for de manipuleret cytoarchitecture af levende stilladser, da disse celler mægle forskellige udviklingsmæssige mekanismer i vivo. I løbet af hjernens udvikling stole nye neuroner på basal processer udvidet af radial glia fra zonen ventrikulær mod udvikle kortikale pladen som levende stilladser for styret migration36,37. Desuden udvide vækst kegler er vist at orientere sig ved sensing tiltrækkende og frastødende signaler fremkaldes ved glial guidepost celler, og såkaldte "banebrydende" axoner er foreslået at nå frem til de korrekte mål ved at udvide langs pre mønstrede glial scaffolds35,38,39. Gliaceller er således nødvendige for vejledning af banebrydende axoner, som senere tjene som axon-baserede "levende stilladser" for direkte projektion af "follower" axoner. Derudover glia-medieret vækst mekanismer har vist at fremture efter fødslen, som neuroblasts følger den rostralt vandrende strøm (RMS) til at navigere fra den subventricular zone (SVZ), en af de få tilbageværende områder af neurogenese i den voksne hjerne, at den olfaktoriske pære (OB)40. Disse neuroblasts i RMS migrere i glial røret (figur 1A-1), som består af langs justeret astrocytic processer, via direkte celle-celle sammenvoksninger og lokaliseret opløselige faktorer37, 41. Endelig, mens CNS skader i pattedyr årsager afbrudt astrocytic proces arrangement danner et glial ar, der fysisk hindrer cytoskeletale regenerering17, mange ikke-pattedyr systemer mangler dannelsen af en skadelig glial ar. Tværtimod opretholde glial celler af ikke-pattedyr arter mere organiseret, justeret mønstre, der anvendes som guider gennem sårede region17,42,43. For eksempel, i ikke-pattedyr SCI modeller, er axoner vist at vokse i tæt tilknytning til glial broer krydser læsion, tyder på en vigtig rolle for organiseret glial stilladser som substrater lette cytoskeletale regenerering og funktionel genopretning ( Figur 1A -2) 42 , 44 , 45. Sammenfatning af de neuroanatomical funktioner og udviklingsmæssige/regenerativ mekanismer beskrevet ovenfor kan give en ny klasse af manipuleret glial-baserede levende stilladser, der samtidigt kan drive umodne neuronal migration og cytoskeletale pathfinding gennem ellers ikke-eftergivende miljøer, dermed potentielt afdæmpe virkningerne af neuronal og axon tarmkanalen degeneration tilknyttet CNS skade og sygdom.
Vores forskergruppe har tidligere udviklet flere typer af levende stilladser til genopbygning og genopretning af cytoskeletale skrifter i CNS og det perifere nervesystem (PNS) via mikro-væv manipuleret neurale netværk (micro-mine) og væv manipuleret nerve grafts (TENGs), henholdsvis27,46,47,48. Begge strategier er baseret i sagens natur på Biomimetik. Mikro-mine er anatomisk inspireret strukturer designet til strukturelt og funktionelt erstatte cytoskeletale skrifter forbinder adskilte neuronal populationer af hjernen. TENGs udnytter den udviklingsmæssige mekanisme af axon-faciliteret cytoskeletale regenerering, eksemplificeret ved "follower" axon vækst langs "pioneer" axoner, at opnå målrettede vært cytoskeletale regenerering35,46,48. Vi for nylig med store bogstaver på alsidigheden af levende stillads teknik ved hjælp af en lignende encasement ordningen som mikro-mine og søger inspiration fra de glia-baserede mekanismer til stede i hele udvikling. Her, udviklet vi konstruktioner bestående af justeret astrocytic bundter spanning kollagen lumen af en hydrogel mikro-kolonne49. Disse astrocytic levende stilladser er udviklet af første udfylde en kapillær tube-akupunktur nål forsamling med flydende Agarosen for at oprette en hul cylindrisk hydrogel med en ydre diameter (OD) og indre diameter (ID) svarende til diameteren af den rør og nål, hhv. Efter Agarosen gellation, og udvindingen af hydrogel mikro-kolonnen fra den kapillarrør kraterets hule er belagt med type kollagen til at levere en eftergivende for astrocyte vedhæftning miljø og justeret bundt dannelse (figur 1B -1). Bagefter, lumen er seedet med cerebral kortikale astrocytter isoleret fra postnatal rotte unger (figur 1B-2). I modsætning til todimensionale (2D) justering teknikker, der er baseret på anvendelsen af elektriske felter, micropatterned riller og ekstracellulære matrix (ECM) protein mønster, astrocyte justering i levende stillads bygger teknik på samlesæt i henhold til kontrollerbare variabler som substrat krumning (kolonne-ID), celle tæthed og kollagen koncentration50,51,52. Astrocytter kontrakt og remodel kollagen, og erhverve en bipolar, langs justeret morfologi analog til de naturligt stilladser observeret i vivo (figur 1B-3). Ja, vi aktivt forfølger brugen af disse kabel-lignende strukturer som fysiske substrater for målrettet vejledning af overflytning umodne neuroner samt lette cytoskeletale regenerering gennem den ugunstige miljø af den beskadigede CNS, især pattedyr glial arret (figur 1 c). Denne artikel vil fremlægge detaljerede fabrikation metode for astrocytic mikro-kolonnerne, fase kontrast og immunfluorescens billeder af de forventede cytoarchitecture, og en omfattende diskussion om de nuværende begrænsninger og fremtidige retninger af den teknik.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55848/55848fig1.jpg"> Figur 1: Inspiration, fabrikation protokol og foreslåede programmer for de justerede Astrocytic net. (A) neurobiologiske inspiration: (1) Neuroblasts stammer fra den neurogen subventricular zone (SVZ) udnytte langs justeret glial røret i den rostralt vandrende strøm (RMS) for styret migration hen imod de olfaktoriske pære (OB); (2) ikke-pattedyr padder og fisk kan opretholde regenerering efter neurale væv skade delvis på grund af dannelsen af en glial bro, der forbinder enderne af en læsion (f.eks. transected rygmarven) og tjener som et stillads til vejledning for Regenerating axoner. (B) fabrikation oversigt: (1) opbygningen af en micron mellemstore, hule hydrogel mikro-kolonne med lumen belagt med ECM, (2) såning af primære kortikale astrocytter isoleret fra postnatal rotte unger, (3) samlesæt af langs-orienterede bundter i kultur, og (4) udvinding af pakke fra biomateriale encasement for fremtidige implantation undersøgelser. (C) In vivo ansøgninger: (1) disse levende stilladser kan tjene som manipuleret glial rør til styret neuron migration fra neurogen centre til repopulate neuron-mangelfuld regioner; (2) sammenfatning af de udviklingsmæssige mekanisme af banebrydende axon vejledning og glial broer i ikke-pattedyr regenerativ mekanisme kan give disse astrocytic stilladser med kapacitet til direkte axon regeneration på tværs af de ikke-eftergivende miljø af pattedyr glial arret. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55848/55848fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acupuncture needle (300 &#181;m diameter)</td>
			<td>Lhasa Medical</td>
			<td>HS.30x40</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene disposable serological pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter glass capillary tube (701 &#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcap bulb dispenser</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>Bulb comes with the microcap tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP88857200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1451352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm gauge needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-826-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378550-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S50821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litmus paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-876-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170112</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham&#39;s F-12 Nutrient Mixture</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal embryonic neuron basal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Store at 4&#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum free supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 astrocytic supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley embryonic day 18 rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-042816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>EMESCO</td>
			<td>1194-352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-413-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 998 076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 40%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F77P-4</td>
			<td>Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont mounting medium</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-collagen I primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vimentin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB3400</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5326</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Store at 4&#186;C. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1359</td>
			<td>4 mM in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>E1169</td>
			<td>2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxane (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti-S Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration

Neurotrauma og neurodegenerative sygdomme ofte resulterer i varige neurologiske underskud på grund af den begrænsede kapacitet på det centrale nervesystem (CNS) til at erstatte tabte neuroner og regenerere cytoskeletale veje. Dog under udvikling af nervesystem, neuronal migration og cytoskeletale udvidelse ofte opstå langs veje udgøres af andre celler, betegnes som "levende stilladser". Søger at efterligne disse mekanismer og for at udforme en strategi, der omgår de hæmmende miljø af CNS, dette manuskript præsenterer en protokol til at fremstille væv manipuleret astrocyte-baserede "levende stilladser". Hvis du vil oprette disse konstruktioner, ansat vi en roman biomateriale encasement ordningen til at fremkalde astrocytter selv samle i tætte tredimensionale bundter af bipolar langs justeret somata og processer. Første, hule hydrogel mikro-kolonner var samlet, og den indre lumen var belagt med ekstracellulære kollagen matrix. Dissocierede cerebral kortikale astrocytter blev derefter leveret i lumen af cylindrisk mikro-kolonnen, og på en kritisk indre diameter på < 350 µm, spontant selvstændig justeret og ansat til at producere lange fiber-lignende kabler består af tætte bundter astrocyte processer og kollagen fibriller måling < 150 µm i diameter endnu udvide flere cm i længden. Disse manipuleret levende stilladser udstillet > 97% cellernes levedygtighed og var næsten udelukkende består af astrocytter udtrykker en kombination af de mellemliggende glødetrådens proteiner glial-fibrillære sure protein (GFAP), vimentin, og nestin. Disse justeret astrocyte netværk fandtes for at give en eftergivende substrat for neuronal vedhæftet fil og justeret neurite forlængelse. Desuden, disse konstruktioner bevare integritet og justering når udvundet fra hydrogel encasement, hvilket gør dem egnede til CNS implantation. Disse præfabrikerede konstruktioner strukturelt emulere centrale cytoarchitectural elementer af naturligt forekommende glial-baserede "living stilladser" in vivo. Som sådan, kan disse manipuleret levende stilladser tjene som prøvestande til at studere udviklingsforstyrrelser mekanismer i in vitro eller lette neuroregeneration ved at dirigere neuronal migration og/eller cytoskeletale pathfinding efter CNS degeneration in vivo .

I første omgang fasekontrast mikroskopi blev brugt til at overvåge udviklingen af astrocyte vedhæftning og bundt dannelse og den overordnede stabilitet af cytoarchitecture som funktion af tiden. På 1 time efter plating, blev astrocytter fundet i hele lumen af mikro-kolonner med en sfærisk morfologi (figur 2A). På 5 h, astrocytter begyndte at udvide processer og kontraherende, mens af 8 h celler udstillet en komplet proces-bærende morfologi og dannet ka...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration at JoVE.com

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Vi fremvise udviklingen af selvsamlede, tre-dimensionelle bundter langs justeret astrocytic somata og processer inden for en roman biomateriale encasement. Disse manipuleret "levende stilladser", udstiller micron-skala diameter, endnu udvide centimeter i længden, kan tjene som prøvestande til at studere udviklingsforstyrrelser mekanismer eller lette neuroregeneration ved at lede neuronal migration og/eller cytoskeletale pathfinding.

Tre-dimensionelle Tissue Engineering justeret Astrocyte netværk for at sammenfatte udviklingsmæssige mekanismer og lette nervesystem regenerering

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Human Biology

Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar-og tredimensionelle Udskrivning af ledende blæk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generering af Aligned Functional myocardievæv via microcontact printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelige bruskvæv Fabrication Brug Tre-dimensionel Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generation af en tre-dimensionel fuld tykkelse Skin Equivalent og Automated Anskydning

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engineering 3D Cellularized kollagengeler for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion af Defineret Humane Engineered hjertevæv at studere Mekanismer for Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensionale epitelvæv indlejret i ekstracellulær matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelte Electrospinning skrivning af tre-dimensionelle Poly(ε-caprolactone) stilladser med kontrollerbare morfologier for Tissue Engineering applikationer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Dyrkning pattedyrsceller i tre-dimensionelle peptid stilladser

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...