Name: three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration
Uploaded: 2018-01-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration at JoVE.com

Soutien financier a été fourni par le National Institutes of Health [U01-NS094340 (Cullen) & F31-NS090746 (kone)], Michael J. Fox Foundation [thérapeutiques Pipeline programme #9998 (Cullen)], Penn médecine neurosciences centre pilote Award (Cullen), National Science Foundation [bourses d’études supérieures DGE-1321851 (Struzyna)], ministère des anciens combattants [RR & D mérite examen #B1097-je (Cullen)] et l’US Army Medical Research and Materiel Command [#W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Toutes les méthodes qui ont été approuvés par l’animalier institutionnel et l’utilisation des comités à l’Université de Pennsylvanie et le Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center et ont adhéré aux lignes directrices énoncées dans la politique de Service de santé publique de NIH sur sans cruauté Care and Use of Laboratory Animals (2015).
1. développement de l’Agarose Hydrogel Micro-colonnes
<ol><li>Faire une solution de poids/volume (p/v) de 3 % d’agarose e...

Par rapport à l’environnement plus favorable de la PNS, le système nerveux central est particulièrement limité pour traiter les conséquences néfastes de neurotraumatologie et neurodégénérescence. Après une grave insulte dans le SNC chez les mammifères, une cicatrice gliale est formée, composé d’un noyau de cellules fibreuses et inflammatoires, entouré d’un réseau dense de désorganisé astrocytes réactifs qui sécrètent axon inhibant l’excroissance des protéoglycanes14. C...

Le système nerveux central (CNS) a une capacité limitée pour contrebalancer la perte et/ou un dysfonctionnement des neurones et des voies axonales qui accompagnent les États tels que traumatisme crânien (TCC), accident vasculaire cérébral, la moelle épinière lésions Médullaires aigues et neurodégénératives maladie1 ,2,3,4,5. La neurogenèse dans le SNC est limitée à un nombre limité de zones dans le cerveau, qui entravent la restauration de neurones perdus6,7. En outre, la régénération du pertes axonales voies dans le système nerveux central est insuffisante en raison de l’absence d’orientation dirigée, la présence d’inhibiteurs de l’excroissance et réactive astrogliosis suite à une avarie de tissu neural2,8, 9,10. Astrocytes ont généralement des fonctions diverses en aidant les neurones avec l’homéostasie ionique, dégagement de neurotransmetteur, la formation des synapses et neurovascular couplage11. Néanmoins, suite de dommages même doux de tissu neural, astrocytes pourraient subir des changements moléculaires, structurales et fonctionnelles, comme la transition vers un État hypertrophique11. En réponse à des traumatismes neurologiques sévères, ces changements entraînent la formation d’une cicatrice avec une pénombre contenant des astrocytes réactifs migration et un noyau de lésion qui inclut les leucocytes sont échappés de la rupture – barrière hémato encéphalique (BHE), la microglie, oligodendrocytes et fibroblastes11,12,13. Ces astrocytes réactifs atteignent une morphologie des processus filamenteux, désorganisés et présentent une expression accrue de protéines des filaments intermédiaires et des protéoglycanes de sulfate de chondroïtine (CSPG), qui entravent la régénération neuronale12. Même si au départ, la cicatrice gliale contribue à rétablir l’intégrité BBB et éviter la transmission de la réponse inflammatoire aux tissus sains avoisinants, il sert de barrière physique et biochimique contre axon régénération12,14 ,15,16. Par exemple, les axones qui rencontrent la cicatrice gliale affichent les cônes de croissance dystrophiques bulbeux et chétive croissance12. En outre, la désorganisation des processus astrocytaires après une blessure empêche l’extension de la régénération des axones17. Le résultat de ces caractéristiques inhibitrices se manifeste dans la handicaps physique et neurologique souvent permanents que les patients souffrent après neurotrauma sévère, y compris les TBI et Sci.
Quelles que soient les défis extrinsèques régénération fonctionnelle dans le SNC, les axones ont démontré posséder une capacité intrinsèque à se régénérer. Par exemple, la nature dynamique des cônes au contact de la cicatrice gliale dystrophiques croissance suggère que ces terminaisons conservent leur capacité de s’étendre à12. Par conséquent, on croit qu’un obstacle principal à la repousse axonale est l’environnement inhibitrice de la CNS après l’accident et celui fournissant un environnement plus permissif via la réduction des cicatrices gliales et/ou la fourniture des ponts régénératrices dans la cicatrice serait avantageuse. En effet, les études antérieures ont démontré que les neurones de CNS étaient capables d’étendre des axones par une lésion à l’aide de greffes de nerfs périphériques comme des ponts, qui présente un environnement plus favorable pour axon régénération12,18, 19. Plusieurs autres stratégies ont été poursuivies pour exploiter cette capacité régénératrice vestigiale. Par exemple, manipulation des voies de signalisation de la croissance cellulaire dans divers modèles de lésion entraîne la régénération axonale et cicatrice gliale réduction10,20,21. En outre, des études ont montré que le traitement avec chondroïtinase ABC, qui s’attache à la plupart des chaînes de sucre dans le CSPG, diminue l’effet inhibiteur du CSPG sécrétée par les astrocytes réactifs22. Des résultats encourageant malgré, ces approches ne fournissent pas réalisé l’orientation des cônes de croissance, ce qui peut se traduire potentiellement par régénération aberrante12et ne tiennent pas compte de la perte de neurones. Approches axées sur les cellules ont été utilisés dans les tentatives pour surmonter les effets de la cicatrice gliale et à reconstituer les cellules perdues, en particulier des neurones. Certains groupes ont dédifférenciées astrocytes réactifs en neurones, tandis que d’autres ont transplanté des cellules progénitrices neurales en lésions CNS à repeupler la zone de la blessure et de promouvoir l’axone régénération23,24, 25. Cependant, greffe de cellules souches seule est limitée par les taux de survie faibles, mauvaise intégration et maintien modeste dans le tissu endommagé5. En outre, ces stratégies axées sur la cellule ne parviennent pas à restaurer sur de longues distances axonales étendues, en particulier d’une manière contrôlée. Par conséquent, les biomatériaux en combinaison avec d’autres approches est envisagées comme des véhicules de livraison pour les différents neurones et facteurs de croissance ou cellules progénitrices26. Approches axées sur les biomatériaux disposent d’un haut degré de contrôle de la conception pour produire des constructions qui imitent le haptotaxic physique, spécifique et chemotaxic repères présent dans le micro-environnement d’en trois dimensions (3D) de l’hôte cible tissus27, 28,29,30,31,32,33,34. Reproduction de ces signaux environnementaux est primordiale pour les cellules transplantées à présenter la morphologie natif, prolifération, la migration et signalisation, entre autres caractéristiques neurobiologiques29. Malgré ces propriétés avantageuses, avancement au-delà des traditionnelles cellules ensemencées biomatériau échafaudages est nécessaire pour favoriser la régénération axonale longue distance dirigée et remplacer les neurones perdus simultanément.
Une approche alternative est basée sur le tissu neural promettant d’ingénierie « échafaudages de vie », qui soient distinguent des autres approches basées sur les cellules en raison de la présence de cellules neuronales vivantes avec une cytoarchitecture préformé qui émule la neuroanatomie natif et/ou mécanismes de développement pour faciliter le remplacement ciblé, la reconstruction et la régénération des circuits neuronaux4,35. Considérations relatives à la conception des échafaudages de vie incluent les phénotypes et les sources de cellules nerveuses, ainsi que les propriétés mécaniques et physiques et les signaux biochimiques dicté par la composition de tout accompagnement de biomatériaux35. Après fabrication in vitro, ces échafaudages de vie peuvent être implanté en vivo de molécules d’adhésion cellulaire présentes et chimiotactiques et neurotrophiques signale à réguler activement la migration cellulaire neuronale et une excroissance axon selon l’État et progression du processus de régénération,35. Les cellules gliales peuvent servir de base pour la cytoarchitecture machiné des échafaudages de la vie puisque ces cellules médient divers mécanismes de développement in vivo. Pendant le développement du cerveau, nouveaux neurones dépendent de processus basales prolongées de cellules gliales radiales de la zone ventriculaire vers la plaque corticale en voie de développement comme vie échafaudages pour migration réalisé36,37. En outre, qui s’étend de la croissance, les cônes sont indiquées pour s’orienter en détectant les signaux attractifs et répulsifs, induites par les cellules gliales de point de repère et soi-disant « révolutionnaire » des axones sont proposées pour atteindre les objectifs corrects en étendant le long des motifs glial échafaudages35,38,,39. Ainsi, les cellules gliales sont nécessaires pour l’orientation des pionniers des axones, qui servent par la suite comme axée sur l’axone « échafaudages vivant » pour diriger la projection des axones « suiveur ». En outre, les mécanismes de croissance médiée par les cellules gliales ont démontré que persistent après la naissance, tout comme les neuroblastes suivent le flux migratoire rostral (RMS) pour naviguer de la zone sous-ventriculaire (SVZ), une des rares régions restantes de la neurogenèse dans le cerveau adulte, à la bulbe olfactif (OB)40. Ces neuroblastes dans le RMS migrent à l’intérieur du tube glial (Figure 1 a-1), qui comprend des processus astrocytaires alignés longitudinalement, via les adhérences cellule-cellule directe et par des facteurs solubles37, 41. Enfin, alors que les dégâts de la CNS à causes des mammifères perturbé arrangement processus astrocytaires formant une cicatrice gliale qui empêche physiquement la régénération axonale17, beaucoup de systèmes non mammifères n’ont pas la formation d’une cicatrice gliale préjudiciable. Plutôt, les cellules gliales non-mammifère d¿espèces maintiennent plus organisé, alignés sur les modèles qui sont utilisés comme guides à travers la région lésée17,42,43. Par exemple, modèles de non-mammifère SCI, axones sont divulgués à se développer en étroite association avec gliales ponts traversant la lésion, ce qui suggère un rôle important pour échafaudages gliales organisées comme substrats facilitant la régénération axonale et la récupération fonctionnelle ( Figure 1 a -2) 42 , 44 , 45. récapitulation des caractéristiques neuroanatomiques et les mécanismes du développement/régénératrice décrits ci-dessus peut-être donner une nouvelle classe d’échafaudages machiné vie gliales qui permet de piloter simultanément la migration neuronale immature et axonale découvrir à travers des environnements non permissif dans le cas contraire, ce qui peut atténuer les effets des neurones et axon tract dégénérescence associée aux maladies et des blessures de la CNS.
Notre groupe de recherche a déjà conçu plusieurs types d’échafaudages de vie pour la reconstruction et la régénération axonale parcelles dans le SNC et le système nerveux périphérique (PNS) via micro-tissu fabriqué réseaux neuronaux (micro-ados) et tissu ingénierie des greffes nerveuses (TENGs), respectivement27,46,47,48. Les deux stratégies reposent fondamentalement sur "biomimétisme". Micro-ados sont des structures d’inspiration anatomiquement conçus structurellement et fonctionnellement remplacer tracts axones reliant les différentes populations de neurones du cerveau. TENGs exploiter le mécanisme du développement de la régénération axonale facilitées par axon, illustrée par croissance axonale « suiveur » le long des axones de « pionnier », pour atteindre l’hôte ciblé la régénération axonale35,46,48. Nous avons récemment capitalisés sur la polyvalence de l’échafaudage de vie technique utilisant un modèle similaire de la housse comme micro-ados et cherchant l’inspiration dans les mécanismes de cellules gliales présentes tout au long du développement. Ici, nous avons développé des constructions constituée d’astrocytes alignés s’étendant sur la lumière du collagène d’un hydrogel micro-colonne49. Ces échafaudages de vie astrocytaires sont mis au point par premier remplissage un pointeau de tube capillaire-acupuncture avec liquide d’agarose pour créer un hydrogel cylindrique creux avec un diamètre extérieur (OD) et le diamètre intérieur (ID) correspondant aux diamètres de la tube et l’aiguille, respectivement. Après gélification d’agarose et extraction de l’hydrogel micro-colonne du tube capillaire, l’intérieur creux est recouvert de type j’ai collagène pour fournir un environnement permissif pour adhérence astrocyte et aligné bundle formation (Figure 1 b -1). Par la suite, la lumière est ensemencée avec des astrocytes corticaux cérébraux isolées de ratons postnatal (Figure 1 b-2). Contrairement aux techniques bidimensionnelles (2D) alignement qui s’appuient sur l’application de champs électriques, micromotifs rainures et matrice extracellulaire protéines (ECM) le patterning, alignement des astrocytes dans l’échafaudage de vie technique se fonde sur l’auto-assemblage selon les variables contrôlables comme la courbure de substrat (ID de la colonne), la densité cellulaire et collagène concentration50,51,52. Les astrocytes du contrat et remodèlent le collagène et d’acquièrent une morphologie bipolaire, alignés longitudinalement analogue aux échafaudages naturelles observées in vivo (Figure 1 b-3). En effet, nous poursuivons activement l’utilisation de ces structures ressemblant à des câbles comme substrats physiques d’orientation ciblée de la migration des neurones immatures ainsi que faciliter la régénération axonale dans l’environnement défavorable du SNC endommagé, particulièrement la cicatrice gliale chez les mammifères (Figure 1). Cet article va présenter la méthode de fabrication détaillées pour les astrocytes micro-colonnes, phase contraste et immunofluorescence des images de la cytoarchitecture attendue et un débat approfondi sur les limitations actuelles et les orientations futures de la technique.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55848/55848fig1.jpg"> Figure 1 : Inspiration, protocole de Fabrication et Applications proposées pour les réseaux astrocytaires alignées. Inspiration neurobiologiques (A) : (1) neuroblastes émanant de la zone sous-ventriculaire neurogène (SVZ) utilisent le tube glial aligné longitudinalement dans le flux migratoire rostral (RMS) pour une migration dirigée vers le bulbe olfactif (OB) ; (2) Non-mammifères tels que les amphibiens et les poissons peuvent soutenir la régénération après que tissu neural endommager en partie due à la formation d’un pont glial qui relie les extrémités d’une lésion (par exemple le percement la moelle épinière) et sert comme un échafaudage pour l’orientation des régénération des axones. (B) vue d’ensemble de la Fabrication : (1) construction d’une micro-colonne taille micron, creux hydrogel avec la lumière recouverte d’ECM, (2) semis des astrocytes corticales primaires, isolées de ratons postnatal, (3) l’auto-assemblage de l’orienté longitudinalement faisceaux dans la culture et l’extraction (4) du faisceau de la housse de biomatériau pour études d’implantation future. (C) In vivo applications : (1) ces échafaudages de vie peuvent servir des tubes gliales machinés pour la migration de neurone dirigé des centres neurogènes de repeupler des régions de neurone déficitaires ; (2) récapitulation du mécanisme du développement du pionnier de guidage axonal et le mécanisme régénératrice des ponts gliales non mammifères peut doter ces échafaudages astrocytaires avec la capacité de diriger la régénération axonale dans la non permissif environnement de la cicatrice gliale chez les mammifères. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55848/55848fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acupuncture needle (300 &#181;m diameter)</td>
			<td>Lhasa Medical</td>
			<td>HS.30x40</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene disposable serological pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter glass capillary tube (701 &#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcap bulb dispenser</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>Bulb comes with the microcap tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP88857200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1451352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm gauge needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-826-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378550-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S50821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litmus paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-876-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170112</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham&#39;s F-12 Nutrient Mixture</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal embryonic neuron basal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Store at 4&#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum free supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 astrocytic supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley embryonic day 18 rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-042816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>EMESCO</td>
			<td>1194-352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-413-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 998 076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 40%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F77P-4</td>
			<td>Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont mounting medium</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-collagen I primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vimentin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB3400</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5326</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Store at 4&#186;C. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1359</td>
			<td>4 mM in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>E1169</td>
			<td>2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxane (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti-S Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration

Neurotraumatologie et neurodégénératives maladie se traduisent souvent par une durée des déficits neurologiques en raison de la capacité limitée du système nerveux central (CNS) pour remplacer les neurones perdus et régénérer les voies axonales. Cependant, au cours du développement du système nerveux, la migration neuronale et extension axonale surviennent souvent le long des voies, formés par les autres cellules, dénommé « échafaudages de vie ». Cherchant à imiter ces mécanismes et à concevoir une stratégie qui contourne l’environnement inhibiteur du SNC, ce manuscrit présente un protocole visant à fabriquer des tissus d’ingénierie axée sur les astrocytes « échafaudages de vie ». Pour créer ces constructions, nous avons utilisé un système de housse nouveau biomatériau pour induire des astrocytes de s’auto-assembler en denses faisceaux tridimensionnelle des bipolaires alignés longitudinalement corps cellulaires et des processus. Tout d’abord, creux hydrogel micro-colonnes ont été assemblés, et la lumière interne a été recouvert de collagène-matrice extracellulaire. Dissociées des astrocytes corticales cérébrales ont été livrés ensuite dans la lumière de la micro-colonne cylindrique et, à un diamètre intérieur critique du < 350 µm, spontanément auto aligné et contracté pour produire des câbles fibre longue comme consistant en des faisceaux denses des processus de l’astrocyte et des fibrilles de collagène mesurant < 150 µm de diamètre, mais s’étendant à plusieurs cm de longueur. Ces engineered échafaudages de vie exposées > 97 % viabilité cellulaire et étaient presque exclusivement composée d’astrocytes exprimant une combinaison de la filament intermédiaire protéines glial-protéine fibrillaire acide (GFAP), vimentine et nestin. Ces alignement astrocyte réseaux trouvées pour fournir un substrat permissif pour fixation neuronale et alignement les neurites extension. En outre, ces constructions de maintiennent l’intégrité et l’alignement lorsque extraites de la housse d’hydrogel, ce qui les rend appropriés pour l’implantation de la CNS. Ces constructions préformées émulent structurellement cytoarchitecturaux principaux éléments d’origine naturelle gliale basée sur « vivre échafaudages » in vivo. À ce titre, ces échafaudages machiné vivants peuvent servir de bancs d’essai pour étudier les mécanismes neurologiques du développement in vitro ou faciliter neurorégénération en orientant la migration neuronale et/ou novateur Axonal suite in vivo de la dégénérescence CNS .

Au départ, contraste de phase microscopie a été utilisée pour surveiller la progression de la formation groupée et adhérence astrocyte et la stabilité globale de la cytoarchitecture en fonction du temps. À 1 h après l’ensemencement, les astrocytes ont été trouvés tout au long de la lumière des micro-colonnes avec une morphologie sphérique (Figure 2 a). À 5 h, astrocytes a commencé à étendre les processus et passation de marchés, même si ...

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Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Nous vous présentons le développement des faisceaux auto-assemblés, en trois dimensions du corps alignés longitudinalement astrocytaires cellulaires et des processus dans un enrobage de nouveaux biomatériaux. Ces engineered « vie échafaudages », présentant le diamètre micron-échelle mais qui s’étend de centimètres de longueur, peut servir de bancs d’essai pour étudier les mécanismes du développement neurologique ou faciliter la neurorégénération en direction de la migration neuronale et/ou axonale pathfinding.

Dimensions des tissus conçus alignement Astrocyte réseaux pour récapituler les mécanismes du développement et de faciliter la régénération du système nerveux

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

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Bio-ingénierie

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Impression Planar et en trois dimensions des encres conductrices

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Génération de tissu myocardique alignés fonctionnelle grâce à l&#39;impression par microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Fabrication de tissus de cartilage humain en utilisant trois dimensions jet d&#39;encre Technologie d&#39;impression

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Génération d&#39;une épaisseur en trois dimensions équivalent de peau et automatisé Blessant

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Faire fondre électrofilage écrit d’échafaudages Poly(ε-caprolactone) en trois dimensions avec des Morphologies contrôlables pour les Applications de génie tissulaire

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Culture de cellules mammifères dans les échafaudages de Peptide en trois dimensions

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...