Name: three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration
Uploaded: 2018-01-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration at JoVE.com

Finanziell wurde unterstützt durch die National Institutes of Health [U01-NS094340 (Cullen) & F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Foundation [therapeutische Pipeline Programm #9998 (Cullen)], Penn Medizin Neuroscience Center Pilot Award (Cullen) National Science Foundation [Graduate Research Fellowships DGE-1321851 (Struzyna)], Department of Veterans Affairs [RR & D Verdienst Bewertung #B1097-ich (Cullen)], und die US Army Medical Research und Materiel Command [#W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Alle Verfahren wurden durch die institutionelle Animal Care and Verwendung Ausschüsse an der University of Pennsylvania und Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center genehmigt und den Vorgaben in der NIH Public Health Servicepolitik auf Humane eingehalten Pflege und Verwendung von Labortieren (2015).
1. Entwicklung der Agarose Hydrogel Micro-Spalten
<ol><li>Machen Sie eine Agarose 3 % Gewicht/Volumen (w/V) Lösung durch Wiegen 3 g Agarose und Übertragung auf eine sterile Becher m...

Im Vergleich zu mehr unterstützendes Umfeld der PNS beschränkt die CNS besonders im Umgang mit den nachteiligen Folgen der Neurotrauma und Neurodegeneration. Nach eine schwere Beleidigung der Säugetier-CNS wird eine glial Narbe gebildet, bestehend aus einem Kern von fibrotischen und entzündlichen Zellen umgeben von einem dichten Geflecht unorganisiert reaktive Astrocyten, die Axon Auswuchs hemmende Proteoglycans14absondern. Diese Narbe wirkt wie ein physischer und biochemischer Hindernis gegen...

Das zentrale Nervensystem (ZNS) hat eine begrenzte Kapazität gegen Verlust und/oder Funktionsstörungen der Nervenzellen und axonalen Signalwege, die Bedingungen wie Schädel-Hirn-Verletzungen (SHT), begleiten Schlaganfall, Rückenmark Verletzungen (SCI) und Neurodegenerative Krankheit1 ,2,3,4,5. Neurogenese im ZNS beschränkt sich auf eine begrenzte Anzahl von Bereichen im Gehirn behindern die Wiederherstellung der verlorenen Neuronen6,7. Darüber hinaus ist Regeneration der verlorenen axonalen Wege im ZNS nicht ausreichend durch das Fehlen einer gezielten Führung, das Vorhandensein von Auswuchs Inhibitoren und reaktive Astrogliosis nach Schäden an Nervengewebe2,8, 9,10. Astrozyten haben in der Regel diverse Funktionen bei der Unterstützung der Neuronen mit Ionen-Homöostase, Neurotransmitter-Clearance, Synapse Bildung und neurovaskuläre Kopplung11. Dennoch können Astrozyten nach auch leichte Schäden an Nervengewebe, molekulare, strukturelle und funktionelle Veränderungen unterziehen, um eine hypertrophe staatliche11Übergang. Als Reaktion auf schwere Neurotrauma führen diese Veränderungen bei der Bildung einer Narbe mit einer Penumbra, Migration von reaktiven Astrozyten und eine Läsion Kern, der Leukozyten von der geplatzten Blut - Hirn-Schranke (BBB), Mikroglia durchgesickert enthält enthält, Oligodendrozyten und Fibroblasten11,12,13. Diese reaktive Astrocyten erreichen eine Morphologie des faserigen, ungeordnete Prozesse und zeigen erhöhte Expression von intermediate Filament Proteine und Chondroitinsulfat Proteoglycans (CSPGs), die neurale Regeneration12behindern. Obwohl die glial Narbe anfangs hilft BBB Integrität wiederherzustellen und Übertragung der Entzündungsreaktion umliegenden gesunden Gewebes zu vermeiden, dient es als biochemische und physikalische Barriere gegen Axon Regeneration12,14 ,15,16. Zum Beispiel Axone, die Begegnung die glial Narbe bauchige dystrophischen Wachstum Kegel anzeigen und verkümmert Wachstum12. Darüber hinaus behindert die Desorganisation der astrocytic Prozesse nach einer Verletzung die Verlängerung der regenerierende Axone17. Das Ergebnis dieser hemmenden Eigenschaften manifestiert sich in der oft dauerhafte körperlichen und neurologischen Beeinträchtigungen, die Patienten nach schweren Neurotrauma leiden, einschließlich TBI und Sci.
Unabhängig von der äußeren Herausforderungen funktionelle Regeneration im ZNS nachweislich die Axone besitzen eine intrinsische Fähigkeit zu regenerieren. Zum Beispiel zufolge die dynamische Natur der dystrophischen Wachstum Kegel in Kontakt mit der glial Narbe diese Endungen behalten ihre Fähigkeit,12zu erweitern. Infolgedessen wird es vermutet, dass als wichtigste Hindernis für axonalen Nachwachsen der hemmenden Umwelt der posttraumatischen CNS und Bereitstellung einer großzügigeren Umgebung über Reduktion glialen Narbenbildung und/oder sofern regenerative Brücken über die Narbe wäre vorteilhaft. In der Tat haben Studien gezeigt, dass ZNS-Neuronen waren in der Lage, die Ausweitung der Axone durch eine Läsion mit peripheren Nerv Transplantationen als Brücken, die ein günstigeres Umfeld für Axon Regeneration12,18zu präsentieren, 19. Mehrere andere Strategien haben verfolgt, um diese verkümmerte Regenerationsfähigkeit zu nutzen. Manipulation der Zelle Wachstum Signalwege in verschiedenen Verletzungen resultieren beispielsweise axonalen Regeneration und glial Narbe Reduktion10,20,21. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass die Behandlung mit Chrondroitinase ABC, die den Großteil der Zuckerketten in CSPGs zerspaltet, die hemmende Wirkung von CSPGs abgesondert durch reaktive Astrocyten22verringert. Trotz ermutigender Ergebnisse, diese Ansätze bieten keine Führung des Wachstums Zapfen, gerichtet, die potenziell aberrierende Regeneration12führen kann, und auch nicht für den Verlust von Neuronen zu berücksichtigen. Zell-basierte Ansätze wurden genutzt, bei versuchen, die Auswirkungen der glial Narbe zu überwinden und um verlorene Zellen, vor allem Neuronen wieder aufzufüllen. Einige Gruppen haben entdifferenzierten reaktive Astrocyten in Neuronen, während andere neurale Vorläuferzellen in CNS Läsionen zum repopulate Bereich Verletzungen und zur Förderung Axon Regeneration23,24, , verpflanzt haben 25. Stammzelltransplantation allein ist jedoch durch die niedrigen Überlebensraten, mangelhafte Integration und bescheidenen Retention in das geschädigte Gewebe5begrenzt. Darüber hinaus nicht diese Zell-basierte Strategien Fernverkehr axonalen Landstriche, vor allem in einer kontrollierten Weise wiederherzustellen. Daher als Lieferfahrzeuge für verschiedene neuronale Biomaterialien in Kombination mit anderen Ansätzen erforscht und Vorläuferzellen und Wachstum Faktoren26. Biomaterial-basierte Ansätze verfügen über ein hohes Maß an Design-Steuerung, Konstrukte zu produzieren, die die spezifischen körperlichen, Haptotaxic zu imitieren, und chemotaxic Hinweise in der dreidimensionalen (3D) Mikroumgebung der Ziel-Host Gewebe27, 28,29,30,31,32,33,34. Reproduktion von diesen Umweltsignale ist von größter Bedeutung für die transplantierten Zellen, Native-ähnliche Morphologie, Proliferation, Migration und Signaltechnik, unter anderen neurobiologischen Eigenschaften29zu präsentieren. Trotz dieser vorteilhaften Eigenschaften ist Fortschritt jenseits traditioneller Zelle ausgesät Biomaterial Gerüste erforderlich, um gleichzeitig Regie Fernverkehr axonalen Regeneration fördern und ersetzen verlorene Neuronen.
Eine vielversprechende alternative Ansatz basiert auf Nervengewebe entwickelt "lebenden Gerüste", unterscheidet sich von anderen Zell-basierte Ansätze aufgrund des Vorhandenseins von lebenden Nervenzellen mit einem vorgeformten Cytoarchitecture, die native Neuroanatomie emuliert und/oder Entwicklungsmechanismen gezielte Ersatz, Wiederaufbau und Regenerierung der neuralen Schaltkreis4,35zu erleichtern. Überlegungen für die Gestaltung von lebendigen Gerüste gehören die Phänotypen und Quellen von neuronalen Zellen sowie die mechanische/physikalische Eigenschaften und die biochemische Signale durch die Zusammensetzung der begleitenden Biomaterialien35diktiert. Nach Fertigung in Vitro, diese lebenden Gerüste können implantiert in Vivo vorhanden Zelle Adhäsionsmoleküle und chemotaktische und neurotrophe Signale zum neuronalen Zellwanderung und Axon Auswuchs je nach Zustand aktiv regulieren und Fortschreiten der regenerativen Prozesse35. Gliazellen dienen als Grundlage für die veränderter Cytoarchitecture lebenden Gerüste, da diese Zellen verschiedene Entwicklungsmechanismen in Vivozu vermitteln. Während der Entwicklung des Gehirns setzen neue Neuronen auf basalen Prozesse durch radiale Gliazellen aus der ventrikulären Zone in Richtung der Entwicklung kortikale Platte als lebende Gerüste für gerichtete Migration36,37erweitert. Darüber hinaus erweitern Wachstum sind Zapfen gezeigt, sich zu orientieren, durch Sensierung attraktiv und abweisend Signale ausgelöst durch Wegweiser Glia-Zellen, und sogenannte "Pionierarbeit" Axone werden vorgeschlagen, um die richtigen Ziele zu erreichen, durch die Ausdehnung entlang Pre-gemusterten Glia 35,38,39Gerüste. Gliazellen sind also notwendig, um die Führung des bahnbrechenden Axone, die später als Axon-basierte dienen "lebenden Gerüste" um die Projektion der "Mitläufer" Axone leiten. Darüber hinaus Glia-vermittelten Wachstum Mechanismen haben gezeigt, dass postnatal, fortbestehen folgendermaßen Neuroblasten rostral wandernden Stream (RMS), aus der subventricular Zone (SVZ), einer der wenigen verbliebenen Bereiche der Neurogenese im erwachsenen Gehirn zu navigieren die Riechkolben (OB)40. Diese Neuroblasten in der RMS migrieren innerhalb der Glia Röhre (Abbildung 1A-1), die besteht aus längs ausgerichteten astrocytic Prozesse, über direkten Zell-Zell-Verwachsungen und lokalisiert lösliche Faktoren37, 41. schließlich während CNS Schäden in Säugetieren Ursachen astrocytic Prozess Anordnung bilden eine glial Narbe, die körperlich axonale Regeneration17 gestört behindert, viele nicht-Säugetier-Systemen fehlt die Bildung einer nachteiligen glial Narbe. Vielmehr pflegen Gliazellen des nicht-Säugetier-Arten mehr organisiert, ausgerichtet von Mustern, die als Führer durch die verletzte Region17,42,43verwendet werden. Zum Beispiel nicht-Säugetier-SCI-Modelle, Axone entnehmen Sie bitte weiter in enger Zusammenarbeit mit Glia Brücken über der Läsion, schlägt eine wichtige Rolle für organisierte Glia Gerüste als Erleichterung der axonalen Regeneration und funktionelle Wiederherstellung (Substrate Abbildung 1A -2) 42 , 44 , 45. Reprise der neuroanatomischen Eigenschaften und die Entwicklungs-/regenerative Mechanismen, die oben beschriebenen kann dies zu eine neue Klasse von veränderter Glia-basierte lebenden Gerüste, die unreif neuronalen Migration gleichzeitig fahren können und axonalen Wegfindung durch ansonsten freizügigen Umgebungen, damit potenziell Minderung der Auswirkungen von neuronalen und Axon Trakt Degeneration mit CNS Verletzung und Krankheit verbunden.
Unsere Forschungsgruppe hat bereits mehrere Arten von lebenden Gerüste für den Wiederaufbau entworfen und Regeneration der axonalen Traktate in das ZNS und das periphere Nervensystem (PNS) über Micro-Gewebe entwickelt, neuronale Netze (Mikro-TENNs) und Gewebe Nerv Transplantationen (TENGs) bzw.27,46,47,48entwickelt. Beide Strategien basieren grundsätzlich auf Biomimicry. Mikro-TENNs sind anatomisch inspirierte Strukturen strukturell und funktionell axonalen Traktate verbinden unterschiedliche neuronale Populationen des Gehirns ersetzen soll. TENGs ausnutzen den Entwicklungsbiologie Mechanismus der Axon erleichtert axonalen Regeneration, veranschaulicht durch "Mitläufer" Axon Wachstum entlang "Pionier" Axone, gezielte Host axonalen Regeneration35,46,48zu erreichen. Wir vor kurzem auf die Vielseitigkeit des Gerüstes lebenden aktiviert Technik mit einem ähnlichen Schema Ummantelung als Mikro-TENNs und inspirieren von den Glia-basierte Mechanismen zu präsentieren, während der gesamten Entwicklung. Hier haben wir Konstrukte bestehend aus ausgerichteten astrocytic Bündel überspannt das kollagene Lumen ein Hydrogel Mikro-Spalte49entwickelt. Diese astrocytic lebenden Gerüste werden von ersten füllen eine Kapillare Rohr-Akupunktur Nadel Montage mit flüssige Agarose Erstellen einer hohlen zylindrischen Hydrogel mit einem Außendurchmesser (OD) und Innendurchmesser (ID) entspricht der Durchmesser der entwickelt die Schlauch und Nadel, beziehungsweise. Nach Agarose Gelierung und Extraktion der Hydrogel Mikro-Spalte aus der Kapillare, die innen hohl ist beschichtet mit Typ ich Kollagen, ein Umfeld für Astrozyten Adhäsion permissive liefern und ausgerichtet Bundle Bildung (Abbildung 1 b -1). Danach ist das Lumen mit zerebrale kortikale Astrozyten isoliert vom postnatalen Ratte Welpen (Abbildung 1 b-2) ausgesät. Im Gegensatz zu zweidimensionalen (2D) Ausrichtung Techniken, die auf die Anwendung von elektrischen Feldern, Micropatterned Rillen und extrazelluläre Matrix (ECM) Protein-Strukturierung, Astrozyten Ausrichtung in die lebendige Gerüst stützt sich Technik auf Selbstmontage nach steuerbare Variablen wie Substrat Krümmung (Spalte ID), Zelldichte und Kollagen Konzentration50,51,52. Die Astrozyten Vertrag umzugestalten das Kollagen und erwerben eine bipolare, längs ausgerichtet Morphologie, die analog zu den natürlichen Gerüste in Vivo (Abbildung 1 b-3) beobachtet. In der Tat verfolgen wir aktiv den Einsatz dieser Kabel-ähnliche Strukturen als physische Substrate für gezielte Führung des Migration unreifer Nervenzellen sowie Erleichterung der axonalen Regeneration durch die ungünstigen Umfeld des beschädigten ZNS, insbesondere die Säugetier-glial Narbe (Abbildung 1). Dieser Artikel wird die detaillierte Herstellungsverfahren für die astrocytic Mikro-Spalten präsentieren, phase Kontrast und Immunfluoreszenz Bilder von der erwarteten Cytoarchitecture und eine umfassende Diskussion über die aktuellen Beschränkungen und zukünftige Richtungen von der Technik.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55848/55848fig1.jpg"> Abbildung 1: Inspiration, Herstellung Protokoll und vorgeschlagenen Anwendungen für die ausgerichteten Astrocytic Netzwerke. (A) neurobiologische Inspiration: (1) Neuroblasten aus der neurogenen subventricular Zone (SVZ) nutzen das längs ausgerichtete Glia Rohr in den rostral wandernden Stream (RMS) für gerichtete Migration in den Riechkolben (OB); (2) nicht-Säugetiere wie Amphibien und Fischen verträgt Regeneration nach Nervengewebe Schäden teilweise durch die Bildung einer Glia Brücke, die verbindet die Enden einer Läsion (z.B. durchtrennten Rückenmark) und dient als Gerüst für die Führung des regenerierende Axone. (B) Herstellung Übersicht: (1) Bau einer Mikrometer Größe, hohlen Hydrogel Mikro-Spalte mit dem Lumen mit ECM, beschichtet (2) Aussaat von primären kortikalen Astrozyten isoliert vom postnatalen Ratte Welpen (3) Selbstmontage der längs-orientierte Bündel in Kultur und (4) Extraktion des Bundles aus Biomaterial-Ummantelung für zukünftige Implantation Studien. (C) In Vivo Anwendungen: (1) diese lebenden Gerüste können dienen als veränderter Glia Rohre für gerichtete Neuron Migration von neurogenen Zentren Neuron-defizienten Regionen; neu aufzufüllen (2) Reprise des developmental Mechanismus von zukunftsweisenden Axon Guidance und der regenerativen Mechanismus der Glia Brücken in nicht-Säugetiere kann diese astrocytic Gerüste mit einer Kapazität von Axon Regeneration über die non-permissive direkte verleihen. Umgebung der Säugetier-glial Narbe. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55848/55848fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acupuncture needle (300 &#181;m diameter)</td>
			<td>Lhasa Medical</td>
			<td>HS.30x40</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene disposable serological pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter glass capillary tube (701 &#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcap bulb dispenser</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>Bulb comes with the microcap tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP88857200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1451352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm gauge needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-826-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378550-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S50821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litmus paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-876-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170112</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham&#39;s F-12 Nutrient Mixture</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal embryonic neuron basal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Store at 4&#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum free supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 astrocytic supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley embryonic day 18 rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-042816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>EMESCO</td>
			<td>1194-352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-413-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 998 076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 40%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F77P-4</td>
			<td>Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont mounting medium</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-collagen I primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vimentin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB3400</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5326</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Store at 4&#186;C. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1359</td>
			<td>4 mM in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>E1169</td>
			<td>2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxane (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti-S Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration

Neurotrauma und neurodegenerativen Krankheiten führen oft bleibende neurologische Ausfälle aufgrund der begrenzten Kapazität des zentralen Nervensystems (ZNS) zu ersetzen verlorene Neuronen und axonalen Wege zu regenerieren. Jedoch treten während der Entwicklung des Nervensystems, neuronale Migration und axonalen Erweiterung oft entlang von wegen, die von anderen Zellen gebildet, als "lebende Gerüste" bezeichnet. Bestrebt, diese Mechanismen zu emulieren und eine Strategie zu entwerfen, die die hemmende Umwelt des ZNS umgeht, dieses Manuskript stellt ein Protokoll zu fertigen Gewebezüchtungen Astrozyten-basierte "lebenden Gerüste". Um diese Konstrukte zu erstellen, haben wir ein neuartiges Biomaterial Encasement Schema induzieren Astrozyten, in dichten dreidimensionalen Bündel von bipolaren längs ausgerichtet Somata und Prozessen selbst zusammensetzen beschäftigt. Erste, hohlen Hydrogel Mikro-Spalten wurden zusammengestellt, und im Inneren Lumen mit extrazellulären Kollagen-Matrix beschichtet wurde. Dissoziierte zerebrale kortikale Astrozyten lieferten dann in das Lumen der zylindrischen Mikro-Spalte und mit einem kritischen inneren Durchmesser von < 350 µm, spontan selbst ausgerichtet und beauftragt, lange Faser-wie Kabel bestehend aus dichten Bündel produzieren Astrozyten Prozesse und Kollagen-Fibrillen Messung < 150 µm im Durchmesser noch mehrere cm in der Länge erweitern. Diese entwickelt lebenden Gerüste ausgestellt > 97 % Zelle Lebensfähigkeit und wurden fast ausschließlich bestehend aus Astrozyten eine Kombination des intermediate Filament Proteine glial fibrillary sauren Proteins (GFAP), Vimentin, zum Ausdruck zu bringen und nestin. Diese ausgerichtet Astrozyten Netzwerke für neuronalen Anlage zu einem freizügigen Substrat gefunden wurden und Neurit Erweiterung ausgerichtet. Darüber hinaus erhalten diese Konstrukte Integrität und Ausrichtung, wenn die Hydrogel-Ummantelung, eignen sich für die CNS Implantation entnommen. Diese vorgeformten Konstrukte emulieren strukturell wichtigsten Cytoarchitectural Elemente des natürlich vorkommenden Glia-basierte "living Gerüste" in Vivo. Als solche können diese veränderter lebenden Gerüste dienen als Testumgebungen zu Entwicklungsstörungen Mechanismen in Vitro zu studieren oder zu erleichtern Neuroregeneration durch die Leitung der neuronalen Migration und/oder axonalen Wegfindung nach CNS Degeneration in-vivo .

Zunächst Phasenkontrast-Mikroskopie wurde verwendet, um das Fortschreiten der Astrozyten Adhäsion und Bundle-Bildung und die Gesamtstabilität der Cytoarchitecture als Funktion der Zeit zu überwachen. 1 h nach der Beschichtung fanden sich Astrozyten in das Lumen der Mikro-Spalten mit einer sphärischen Morphologie (Abbildung 2A). Um 5 Uhr Astrozyten begann Prozesse erweitern und zusammenziehen, während von 8 h Zellen stellte eine komplette Prozess-Lager-M...

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Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Wir präsentieren die Entwicklung des selbst-zusammengebauten, dreidimensionale Bündel longitudinal ausgerichteten astrocytic Somata und Prozesse innerhalb ein neuartiges Biomaterial-Ummantelung. Diese "lebende Gerüste", präsentiert Mikron-Skala Durchmesser noch Zentimeter in der Länge, Verlängerung dienen als Testumgebungen zu Entwicklungsstörungen Mechanismen zu studieren oder zu erleichtern Neuroregeneration Regie neuronalen Migration und/oder axonalen entwickelt Pathfinding.

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

This protocol aims to guide the fabrication of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a micron-sized hydrogel micro-column for use as an in vitro neuro-biological model or as a neuro-regenerative therapy. Trauma and neurodegenerative disease are particularly detrimental to patients due to the restricted neurogenic capacity in inhibitory environment that limit regeneration in the central nervous system. Engineered astrocytic bundles address the limitations of current treatment strategies by attempting to replicate key neuroanatomical features and glia-mediated developmental mechanisms to promoted targeted cell migration and axon pathfinding.The architecture of these astrocytic scaffolds is primarily inspired by the aligned astrocytic processes in the glial tubes of the rostral migratory stream. Begin by preparing a 3%weight per volume agarose solution and DPBS in a sterile beaker. Maintain the heating and stirring to prevent the solution from solidifying prematurely.Insert an acupuncture needle into the bottom opening of the bulb dispenser. Place a capillary tube over the exposed needle and secure the two by entering part of it into the rubber section of the bulb dispenser cylinder. Cap the cylinder to complete the assembly.Transfer one milliliter of liquid agarose to the surface of an empty petri dish. While pinching the rubber cap of the bulb dispenser, insert one end of the capillary tube into the agarose, and release the pressure on the cap to draw agarose into the tube. Place the bulb, tube, needle assemblies on a petri dish and let the agarose solidify inside the capillary tubes for 5 minutes.Then, pull the needle out of the capillary tube, leaving the micro-column still surrounding the needle. Use the tips of foreceps to nudge the micro-column to the end of the needle, then hold the needle over an open DPBS-containing petri dish and push the micro-column into the DPBS. To fabricate micro-column boats, which facilitate later handling of these constructs, begin by making a 4%weight per volume agarose solution, and keeping the solution heated and stirred.Use forceps to move a micro-column to an empty petri dish. Then, while working under a stereoscope, use a micro scalpel to trim the micro-columns to the desired length, with the ends cut at a 45 degree angle. After trimming three more micro-columns, line up the four columns in parallel.Load a pipet with 50 microliters of 4%agarose solution, and dispense a line of liquid over the micro-column array to connect and bundle the constructs into a boat. Allow to cool for 1 to 2 minutes to permit gelation of the 4%agarose. Then use fine forceps to pick up the micro-column boat by the connecting agarose bridge.And move it to a petri dish containing DPBS. Transfer the micro-column boat to a biosafety cabinet and sterilize with exposure to ultraviolet light for thirty minutes. Inside a biosafety cabinet, prepare a 1 milligram per milliliter solution of rat tail type 1 collagen in co-culture medium.And then place it on ice. Adjust the pH of the ECM solution with acid or base as necessary until the pH is stable in the 7.2 to 7.4 range. Transfer the micro-column boat to a 35 or 60 mL petri dish with forceps.Using the stereoscope for guidance, situate the 10 mL tip of a micro-pipette at one end of each micro-column and suction to empty the lumen of DPBS and air bubbles. Charge a P10 micropipette with the collagen solution. Place the 10 mL tip against one end of each micro-column, and deliver enough solution to fill the lumen.Then pipette a reservoir of ECM on either end of the micro-column. Once all columns have been filled, pipette coculture medium in a ring around the petri dish to prevent the columns from drying out. Incubate the dish containing the micro-columns at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for at least one hour to promote polymerization of collagen before adding cells.Afterwards, place the tip of a P10 micropipette at one end of a micro-column and transfer approximately 5 mL of cell solution into the lumen to fill it. After seating all of the micro-columns in a boat, incubate it at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for 1 hour to promote the attachment of astrocytes to the ECM. After the incubation period, carefully fill the dishes containing the seated micro-columns with 3 or 6 mLs of coculture media, for 35 or 60 mL petri dishes respectively.Maintain the plated micro-columns and culture at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide to promote the self assembly of the aligned of the astrocytic bundles, which should form a bundled, cable-like structure after six to ten hours. One hour after plating, astrocytes are spherical in shape and disperse throughout the construct. By five hours after plating, astrocytes initiate process extension and contraction.At eight hours after plating, astrocytes have aligned and contracted. By 24 hours after plating, a dense bundle of astrocytic processes has formed in this example. This fully-formed astrocytic bundle, 24 hours after plating, shows the zippering effect, where the ends of the cable attach to distinct ends of the wall of the lumen.This video shows bundling in action, 3 to 10 hours after plating. Immuno-labeling of the astrocytic scaffolds demonstrates the longitudinal alignment of astrocytic processes. In this confocal image of an astrocytic bundle, the astrocytic marker GFAP is read.And the nuclei are seen in blue. This higher magnification of the bundle permits visualization of the cyto-architecture of the astrocytes within the micro-columns. After watching this video, you should be able to fabricate living scaffolds consisting of longitudinally aligned astrocytic bundles with a biologically inspired cytoarchitecture within a biomaterial encasement.Following this procedure, a transplantation strategy can be designed to deliver the astrocytic bundles with or without the biomaterial encasement to injured brain tissue to promote directed cell migration from neurogenic regions and acts on guidance to the limiting CNS microenvironment. In addition, this technique can be expanded as biofidelic modeling platform glia-mediated neurobiological phenomenon benefited by the mimicry of the native three dimensional environment and the inherent experimental control of in vitro systems.

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