Name: three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration
Uploaded: 2018-01-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration at JoVE.com

Il sostegno finanziario è stato fornito dal National Institutes of Health [U01-NS094340 (Cullen) & F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Foundation [terapeutico Pipeline programma #9998 (Cullen)], Penn medicina Neuroscience Center Pilot Award (Cullen), National Science Foundation [Graduate Research Fellowships DGE-1321851 (Struzyna)], Department of Veterans Affairs [RR & D merito recensione B1097 #-ho (Cullen)] e l'US Army Medical Research e Materiel Command [n #W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Tutte le procedure sono state approvate dalle commissioni di utilizzo presso la University of Pennsylvania e la Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center e istituzionali Animal Care e rispettate le linee guida stabilite nei criteri del servizio di sanità pubblica di NIH su Humane Cura e uso degli animali da laboratorio (2015).
1. sviluppo di agarosio Hydrogel Micro-colonne
<ol><li>Fare una soluzione di agarosio 3% peso/volume (p/v) di peso 3 g di agarosio e trasferirlo in un recip...

Rispetto per l'ambiente più favorevole del PNS, il CNS è notevolmente ridotto a gestire le conseguenze pregiudizievoli di neurotrauma e neurodegenerazione. Dopo un grave insulto al sistema nervoso centrale dei mammiferi, si forma una cicatrice gliale, costituito un nucleo di cellule infiammatorie e fibrotiche circondata da un denso reticolo di astrociti reattivi disorganizzati che secernono assone escrescenza-inibizione proteoglicani14. Questa cicatrice agisce come un'ostruzione fisica e biochim...

Il sistema nervoso centrale (SNC) ha una capacità limitata per contrastare la perdita e/o disfunzione dei neuroni e vie axonal che accompagnano condizioni come la ferita di cervello traumatica (TBI), ictus, malattia di ferita (SCI) e neurodegenerative del midollo spinale1 ,2,3,4,5. Neurogenesi nel SNC è limitata a un numero limitato di aree del cervello, che ostacolano il restauro di neuroni persi6,7. Inoltre, la rigenerazione delle vie axonal perse nello SNC è insufficiente a causa della mancanza di orientamento diretto, la presenza di inibitori di conseguenza e astrogliosi reattiva dopo danno di tessuto neurale2,8, 9,10. Astrociti in genere hanno diverse funzioni nell'assistere i neuroni con omeostasi ionica, neurotrasmettitore gioco, formazione della sinapsi e neurovascular attacco11. Tuttavia, in seguito anche lievi danni al tessuto neurale, astrocytes possono subire variazioni molecolari, strutturali e funzionali come la transizione a un stato ipertrofico11. In risposta a grave neurotrauma, questi cambiamenti provocano la formazione di una cicatrice con una penombra contenente la migrazione astrociti reattivi e un nucleo di lesione che include leucociti trapelati dalla rottura emato - encefalica (BBB), microglia, oligodendrociti e fibroblasti11,12,13. Questi astrociti reattivi raggiungono una morfologia dei processi filamentosi, disorganizzati ed esibiscono l'espressione aumentata di proteine dei filamenti intermedi e proteoglicani Condroitin solfato (CSPG), che ostacolano la rigenerazione neurale12. Anche se inizialmente la cicatrice gliale aiuta a ripristinare l'integrità BBB ed evitare la trasmissione della risposta infiammatoria al tessuto sano circostante, serve come una barriera fisica e biochimica contro assone rigenerazione12,14 ,15,16. Per esempio, gli assoni che incontrano la cicatrice gliale visualizzare dei coni di crescita distrofica bulboso e stentata crescita12. Inoltre, la disorganizzazione dei processi astrocitari dopo lesione impedisce l'estensione della rigenerazione di assoni17. Il risultato di queste caratteristiche inibitorie si manifesta spesso permanenti menomazioni fisiche e neurologiche che pazienti soffrono dopo neurotrauma grave, tra cui TBI e SCI.
Indipendentemente dalle sfide estrinseche funzionale rigenerazione nel SNC, assoni hanno dimostrati di possedere un'intrinseca capacità di rigenerarsi. Per esempio, la natura dinamica dei coni di crescita distrofico a contatto con la cicatrice gliale suggerisce che queste terminazioni mantengono la loro capacità di estendere12. Di conseguenza, si ritiene che un ostacolo principale alla ricrescita assonale è l'ambiente inibitorio del SNC di alberino-ferito e che fornendo un ambiente più permissivo via la riduzione di cicatrici e/o fornendo rigenerative ponti attraverso la cicatrice sarebbe glial vantaggioso. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato che i neuroni CNS erano capaci di estendere gli assoni attraverso una lesione usando gli innesti di nervi periferici come ponti, che presentano un ambiente più favorevole per assone rigenerazione12,18, 19. Parecchie altre strategie sono state perseguite per sfruttare questa capacità rigenerativa vestigiale. Ad esempio, manipolazione delle vie di segnalazione cellulare crescita in vari modelli di lesione ha provocato la rigenerazione assonale e cicatrice gliale riduzione10,20,21. Inoltre, gli studi hanno indicato che il trattamento con chondroitinase ABC, che scinde la maggior parte delle catene dello zucchero in CSPG, diminuisce l'effetto inibitorio di CSPG secernuto da astrociti reattivi22. Nonostante incoraggianti i risultati, questi approcci non forniscono diretto orientamento dei coni di crescita, che può potenzialmente causare rigenerazione aberrante12e inoltre non tengono conto della perdita di neuroni. Approcci basati su cellule sono stati utilizzati nei tentativi per superare gli effetti della cicatrice gliale e per ricostituire le cellule perse, in particolare i neuroni. Alcuni gruppi hanno dedifferenziate di astrociti reattivi nei neuroni, mentre gli altri sono trapiantate cellule progenitrici neurali in lesioni dello SNC di ripopolare la zona ferita e promuovere assone rigenerazione23,24, 25. Tuttavia, trapianto di cellule staminali è limitato dalla bassa sopravvivenza, scarsa integrazione e conservazione modesta nel tessuto danneggiato5. Inoltre, queste strategie basate sulle cellule non riescono a ripristinare a distanza axonal tratti, soprattutto in un modo controllato. Di conseguenza, biomateriali in combinazione con altri approcci stanno esplorande come veicoli di consegna per vari neurale e fattori di crescita e cellule progenitrici26. Approcci basati su biomateriali presentano un elevato grado di controllo di progettazione per la produzione di costrutti che imitano le specifiche fisiche, haptotaxic, e chemotaxic spunti presentano nel microambiente tridimensionale (3D) di destinazione host tessuto27, 28,29,30,31,32,33,34. Riproduzione di questi segnali ambientali è preminente per cellule trapiantate a presentare nativo-come la morfologia, la proliferazione, migrazione e segnalazione, tra le altre caratteristiche neurobiologiche29. Nonostante queste proprietà vantaggiose, avanzamento oltre tradizionale delle cellule seminate biomateriale ponteggi è necessaria per promuovere la rigenerazione assonale interurbano diretta e sostituire i neuroni persi contemporaneamente.
Un promettente approccio alternativo si basa su tessuto neurale ingegnerizzato "ponteggi vivente", che sono distinti da altri approcci basati su cellule a causa della presenza di cellule neurali viventi con un cytoarchitecture preformato che emula neuroanatomia nativo e/o meccanismi per facilitare la sostituzione mirata, la ricostruzione e la rinascita di circuiti neurali4,35. Considerazioni per la progettazione di ponteggi viventi includono i fenotipi e le fonti di cellule neurali, come pure le proprietà fisiche e meccaniche e i segnali biochimici dettata dalla composizione di qualsiasi accompagnamento di biomateriali35. Dopo il montaggio in vitro, queste impalcature vivente possono essere impiantato in vivo di molecole di adesione cellulare presente e chemiotattica e neurotrophic segnali per regolare attivamente la migrazione delle cellule neurali e crescita assonale a seconda dello stato e progressione dei processi rigenerativi35. Le cellule gliali possono servire come base per i derivati dal cytoarchitecture di vita ponteggi poiché queste cellule mediano vari meccanismi in vivo. Durante lo sviluppo cerebrale, nuovi neuroni si basano su processi basali esteso da glia radiale dalla zona ventricolare verso la piastra corticale in via di sviluppo come vivente impalcature per migrazione diretto36,37. Inoltre, estendendo la crescita coni sono mostrato a orientarsi rilevando segnali attraenti e repellenti suscitati dalle cellule gliali guidepost e cosiddetto "pionieristico" assoni sono consigliati per raggiungere gli obiettivi corretti estendendo lungo pre-modellato glial ponteggi di35,38,39. Così, le cellule gliali sono necessari per la Guida di avanguardia di assoni, che più tardi servono come assone-based "ponteggi vivente" per dirigere la proiezione degli assoni "seguace". Inoltre, meccanismi di crescita mediata da cellule gliali sono stati indicati a persistere dopo la nascita, come neuroblasti seguono migratori rostrale (RMS) per spostarsi dalla zona subventricolare (SVZ), una delle poche regioni di neurogenesi nel cervello adulto, per il bulbo olfattivo (OB)40. Questi neuroblasti nel RMS migrano all'interno del tubo glial (Figura 1A-1), che è costituito da processi astrocitari allineati longitudinalmente, tramite le adesioni cellula-cellula diretto e localizzato fattori solubili37, 41. Infine, mentre danno dello SNC in cause di mammiferi perturbato disposizione astrocytic processo formando una cicatrice gliale che fisicamente impedisce la rigenerazione assonale17, molti sistemi di mammiferi mancano la formazione di una cicatrice gliale dannosa. Piuttosto, le cellule gliali di specie di mammiferi mantengono più organizzato, allineato modelli che vengono utilizzati come guide attraverso la regione feriti17,42,43. Per esempio, nei modelli SCI non derivanti da mammiferi, assoni sono mostrati a crescere in stretta associazione con glial ponti che attraversano la lesione, suggerendo un ruolo importante per ponteggi glial organizzati come substrati facilitando la rigenerazione assonale e recupero funzionale ( Figura 1A -2) 42 , 44 , 45. ricapitolazione delle caratteristiche neuroanatomiche e i meccanismi dello sviluppo/rigenerativo descritti sopra può produrre una nuova classe di derivati dal vivere glial basato su impalcature che contemporaneamente possono guidare immatura migrazione neuronale ed assonale path-finding attraverso ambienti altrimenti non permissivi, quindi potenzialmente mitigare gli effetti di un neurone e la degenerazione del tratto dell'assone associato con lesione dello SNC e malattia.
Il nostro gruppo di ricerca ha già progettato più tipi di ponteggi vivente per la ricostruzione e rigenerazione di axonal tratti nel sistema nervoso centrale e sistema nervoso periferico (PNS) tramite micro-tessuto ingegnerizzato reti neurali (micro-teen) e tessuto innesti ingegnerizzati del nervo (TENGs), rispettivamente27,46,47,48. Entrambe le strategie dipendono intrinsecamente biomimetica. Micro-teen sono strutture anatomicamente ispirato alla strutturalmente e funzionalmente sostituire axonal tratti collegamento distinte popolazioni neuronali del cervello. TENGs sfruttare il meccanismo inerente allo sviluppo di assone-facilitato la rigenerazione assonale, esemplificato dalla crescita assonale "seguace" lungo gli assoni "pioniere", per raggiungere la destinazione host la rigenerazione assonale35,46,48. Abbiamo recentemente sfruttato la versatilità dello scaffold vivente tecnica mediante uno schema simile di encasement come micro-teen e in cerca di ispirazione dai meccanismi basati su cellule gliali presenti nel corso dello sviluppo. Qui, abbiamo sviluppato costrutti costituito da fasci astrocytic allineati che abbracciano il lume collageno di un idrogel micro-colonna49. Queste impalcature astrocytic viventi sono state sviluppate da primo riempimento un gruppo di ago di agopuntura-tubo capillare con agarosio liquido per creare un idrogel cavo cilindrico con un diametro esterno (OD) e il diametro interno (ID) corrispondenti ai diametri della tubo ed ago, rispettivamente. A seguito dell'agarosi gelificazione ed estrazione di idrogel micro-colonna dal tubo capillare, interno cavo è rivestito con tipo I collagene per fornire un ambiente permissivo per adesione di astrociti e allineato bundle formazione (Figura 1B -1). In seguito, il lumen è seminato con i astrocytes corticali cerebrali isolati da cuccioli del ratto postnatale (Figura 1B-2). Contrariamente alle tecniche bidimensionali (2D) allineamento che si basano sull'applicazione di campi elettrici, bioerodibili scanalature e matrice extracellulare della proteina (ECM) patterning, allineamento di astrociti nell'impalcatura di vita tecnica si basa sulla auto-assemblaggio secondo variabili controllabili come substrato curvatura (ID di colonna), la densità delle cellule e collagene concentrazione50,51,52. Gli astrociti contraggono e rimodellano il collagene e di acquisiscono una morfologia bipolare, allineati longitudinalmente analoga per i ponteggi naturali osservati in vivo (Figura 1B-3). Infatti, stiamo attivamente perseguendo l'uso di questi cavo-come le strutture come substrati fisici per un orientamento mirato di migrazione neuroni immaturi, nonché facilitare la rigenerazione assonale attraverso l'ambiente sfavorevole del danneggiato snc, in particolare la cicatrice gliale mammiferi (Figura 1). Questo articolo verrà presentare il metodo di fabbricazione dettagliato per le micro-colonne astrocytic, contrasto e immunofluorescenza immagini della citoarchitettura previsto e per una discussione esaustiva sulle limitazioni attuali e future direzioni di fase i tecnica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55848/55848fig1.jpg"> Figura 1: ispirazione, protocollo di fabbricazione e applicazioni proposte per le reti di Astrocytic allineate. Ispirazione neurobiologica (A): (1) neuroblasti provenienti dalla zona subventricular neurogena (SVZ) utilizzano il tubo glial allineato longitudinalmente in rostrale migratori (RMS) per la migrazione diretto verso il bulbo olfattivo (OB); (2) Non-mammiferi come anfibi e pesci possono sostenere la rigenerazione dopo tessuto neurale in parte i danni dovuti alla formazione di un ponte glial che collega le estremità di una lesione (ad es. transected del midollo spinale) e serve come impalcatura per la Guida di assoni di rigenerazione. (B) Panoramica di fabbricazione: (1) costruzione di un'idrogel micron di dimensioni medie, cavo micro-colonna con il lume rivestito con ECM, (2) semina di astrociti corticali primari isolati da cuccioli del ratto postnatale, (3) auto-assemblaggio di longitudinalmente orientati verso il fasci di cultura ed estrazione (4) del fascio dal encasement del biomateriale per gli studi futuri dell'impianto. (C) applicazioni In vivo : (1) Queste impalcature vivente possono servire come tubi gliali ingegnerizzati per migrazione neuronale diretto da neurogene centri per ripopolare le regioni del neurone-carenti; (2) ricapitolazione del meccanismo dello sviluppo di avanguardia di orientamento dell'assone e il meccanismo rigenerativo di glial ponti in non-mammiferi può dotare queste impalcature astrocitari con la capacità di dirigere la rigenerazione assonale attraverso il non permissivi ambiente della cicatrice gliale dei mammiferi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55848/55848fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acupuncture needle (300 &#181;m diameter)</td>
			<td>Lhasa Medical</td>
			<td>HS.30x40</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene disposable serological pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter glass capillary tube (701 &#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcap bulb dispenser</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>Bulb comes with the microcap tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP88857200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1451352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm gauge needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-826-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378550-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S50821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litmus paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-876-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170112</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham&#39;s F-12 Nutrient Mixture</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal embryonic neuron basal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Store at 4&#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum free supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 astrocytic supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley embryonic day 18 rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-042816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>EMESCO</td>
			<td>1194-352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-413-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 998 076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 40%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F77P-4</td>
			<td>Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont mounting medium</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-collagen I primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vimentin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB3400</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5326</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Store at 4&#186;C. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1359</td>
			<td>4 mM in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>E1169</td>
			<td>2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxane (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti-S Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration

Malattia di neurodegenerative e neurotrauma provocare spesso durevole deficit neurologici a causa della limitata capacità del sistema nervoso centrale (CNS) per sostituire i neuroni persi e rigenerare le vie axonal. Tuttavia, durante lo sviluppo del sistema nervoso, della migrazione neuronale ed assonale estensione spesso si verificano lungo le vie formate da altre cellule, indicato come "vita ponteggi". Cercando di emulare questi meccanismi e per progettare una strategia che elude l'ambiente inibitorio del SNC, questo manoscritto presenta un protocollo per fabbricare tessuti ingegnerizzati basati su astrociti "vivente ponteggi". Per creare questi costrutti, abbiamo impiegato uno schema di encasement del romanzo biomateriale per indurre gli astrociti di auto-assemblarsi in tridimensionale densi fasci di bipolare somata allineati longitudinalmente e processi. Idrogel in primo luogo, cavo micro-colonne erano riunite, e il lume interno è stato rivestito con collagene-matrice extracellulare. Astrocytes corticali cerebrali dissociato quindi sono state consegnate nel lumen della micro-colonna cilindrica e, a un diametro interno critico di < 350 µm, spontaneamente auto-allineati e contratta per produrre fibra come lunghi cavi composto densi fasci dei processi di astrociti e fibrille di collagene misura < 150 µm in diametro ancora estendere diversi centimetri di lunghezza. Questi ingegnerizzato ponteggi vivente ha esibiti > 97% vitalità cellulare e sono stati quasi esclusivamente composta da astrociti esprimendo una combinazione del filamento intermedio proteine glial-proteina silicea fibrillare (GFAP), vimentina e nestina. Questi stati allineati Astrocita reti sono state trovate per fornire un substrato permissivo per il fissaggio di un neurone e allineato del neurite estensione. Inoltre, questi costrutti mantengono l'integrità e l'allineamento quando estratti dal encasement di idrogel, che li rende adatti per l'impianto di CNS. Questi costrutti preformati strutturalmente emulano gli elementi chiave cytoarchitectural di biofiltri glial-based "vivere impalcature" in vivo. Come tale, queste impalcature derivati dal vivente possono servire come banchi di prova per studiare neurodevelopmental meccanismi in vitro o facilitare la neurorigenerazione dirigendo la migrazione neuronale e/o pathfinding axonal seguendo la degenerazione di CNS in vivo .

Inizialmente, a contrasto di fase microscopia è stata usata per monitorare la progressione della formazione di adesione e bundle di astrociti e la stabilità generale della citoarchitettura come funzione del tempo. A 1 h dopo il placcaggio, gli astrociti sono stati trovati in tutto il lume delle micro-colonne con una morfologia sferica (Figura 2A). A 5 h, astrociti iniziato estendendo i processi e contraenti, mentre da 8 h cellule hanno esibito una morfologi...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration at JoVE.com

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Presenteremo lo sviluppo di auto-assemblati, tridimensionale fasci di somata astrocytic allineati longitudinalmente e processi all'interno di un encasement romanzo biomateriale. Questi ingegnerizzato "ponteggi vivente", che esibiscono micron-scala diametro ancora estendere centimetri di lunghezza, può servire come banchi di prova per lo studio dei meccanismi dello sviluppo neurologico o facilitare la neurorigenerazione di regia della migrazione neuronale e/o assonale path-finding.

Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Human Biology

Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Ricerca

Bioingegneria

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Stampa planare e tridimensionale di inchiostri conduttivi

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generazione di Allineati tessuto funzionale del miocardio attraverso la stampa microcontatto

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Umana Cartilagine Tessuto Fabrication Uso tridimensionale Tecnologia Inkjet Printing

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Sciogliere elettrofilatura scrittura di scaffold tridimensionale Poly(ε-caprolactone) con morfologie controllabile per applicazioni di ingegneria del tessuto

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...