Name: three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration
Uploaded: 2018-01-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration at JoVE.com

Økonomisk støtte ble levert av National Institutes of Health [U01-NS094340 (Cullen) og F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Foundation [terapeutiske rørledning programmet #9998 (Cullen)], Penn medisin nevrovitenskap Center Pilot Award (Cullen), National Science Foundation [Graduate forskning stipend DGE-1321851 (Struzyna)], Institutt for Veteraner saker [RR & D fortjeneste gjennomgang #B1097-jeg (Cullen)], og US Army Medical Research og Matériel kommando [#W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Alle prosedyrer ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer på University of Pennsylvania og Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center og overholder retningslinjene i policyen NIH Public Health Service på Human Omsorg og bruk av forsøksdyr (2015).
1. utviklingen av Agarose Hydrogel mikro-kolonnene
<ol><li>Gjøre en agarose 3% vekt/volum (w/v) løsning ved veiing 3 g av agarose og overføre den til et sterilt beaker som inneholder 100 mL Dulbeccos fosfat bufret s...

Sammenlignet med den mer støttende miljøet av PNS, er CNS spesielt begrenset i håndtering ødeleggende konsekvensene av Biografiske filmer og neurodegeneration. Etter en alvorlig fornærmelse til pattedyr CNS dannes en glial arr som består av en kjerne av fibrotiske og inflammatoriske celler som omgitt av et tett meshwork av uorganisert reaktive astrocyttene som skiller axon utvekst begrenser proteoglycans14. Denne arr fungerer som en fysisk og biokjemiske hindringer mot fornyelse av axon avsl...

Sentralnervesystemet (CNS) har begrenset kapasitet å motvirke tap og/eller dysfunksjon av nevroner og axonal trasé som følger forhold som traumatisk hjerneskade (TBI), hjerneslag, ryggmarg skade (SCI) og nevrodegenerative sykdommer1 ,2,3,4,5. Neurogenesis i CNS er begrenset til et begrenset antall områder i hjernen, hindrer restaurering av tapt neurons6,7. I tillegg er regenerering av tapt axonal stier i CNS utilstrekkelig mangel på regissert veiledning, utvekst hemmere, og reaktive astrogliosis etter skaden til nevrale vev2,8, 9,10. Astrocyttene vanligvis har forskjellige funksjoner i å hjelpe neurons med ion homeostase, nevrotransmitter klaring, synapse dannelse og nevrovaskulære kopling11. Likevel etter selv mild skade på neural vev, kan astrocyttene gjennomgå molekylær strukturelle og funksjonelle endringer som de overgang til en hypertrofisk stat11. I respons til alvorlige Biografiske filmer føre disse endringene til dannelsen av et arr med en penumbra som inneholder migrere reaktive astrocyttene og en lesjon kjerne som inneholder leukocytter lekkasje fra den sprukket blod - hjerne barrieren (BBB), microglia, oligodendrocytes og fibroblaster11,12,13. Disse reaktive astrocyttene oppnå en morfologi av trådformede, uorganisert prosesser og utstillingen økt uttrykk for intermediære proteiner og chondroitin sulfate proteoglycans (CSPGs), som hindrer nevronal regenerasjon12. Selv om glial arret hjelper først gjenopprette BBB integriteten og unngå overføring av inflammatorisk reaksjon på omkringliggende sunt vev, fungerer det som en fysisk og biokjemiske barriere mot axon gjenfødelse12,14 ,15,16. For eksempel axons støte glial arret vise oppsvulmede dystrophic veksten kjeglene og forkrøplet vekst12. Videre hindrer disorganization av astrocytic prosesser etter skade utvidelse av regenererende axons17. Utfallet av disse inhibitoriske egenskaper er manifestert i de ofte permanente fysiske og nevrologiske impairments at pasienter lider etter alvorlig Biografiske filmer, inkludert TBI og SCI.
Uansett ytre utfordringer funksjonelle gjenfødelse CNS, vist axons seg å ha en iboende evne til å regenerere. For eksempel antyder dynamikken i dystrophic veksten kjeglene i kontakt med den glial arr at disse avslutninger beholde evnen til å utvide12. Derfor er det antatt at en viktigste hindring axonal re-veksten er hemmende miljøet etter skade CNS og det gir en mer ettergivende miljøet via redusere glial arrdannelse og/eller gir regenerativ broer over arret ville være fordelaktig. Faktisk har tidligere studier vist at CNS neurons var i stand til å utvide axons gjennom en leksjonen bruker eksterne nerve grafts som broer, som viser et gunstigere miljø for axon gjenfødelse12,18, 19. Flere andre strategier har vært forfulgt for å utnytte denne vestigial regenerativ kapasiteten. For eksempel har manipulering av celle vekst signalveier i ulike skader modeller resultert i axonal regenerasjon og glial arr reduksjon10,20,21. I tillegg har studier vist at behandling med chondroitinase ABC, som innstiftet flertallet av sukker kjedene i CSPGs, reduserer den hemmende effekten av CSPGs skilles ut av reaktive astrocyttene22. Til tross for oppmuntrende resultater, disse gir ikke rettet veiledning av veksten kjeglene, som kan føre avvikende gjenfødelse12, og også ikke gjøre rede for tap av neurons. Celle-baserte tilnærminger har vært benyttet i forsøk på å overvinne effekten av glial arret og fylle tapt celler, spesielt neurons. Noen grupper har dedifferentiated reaktive astrocyttene i neurons, mens andre har transplantert nevrale stamceller i CNS lesjoner å gjenbefolke skade området og fremme axon gjenfødelse23,24, 25. imidlertid stamcelletransplantasjon alene er begrenset av lav overlevelse, dårlig integrering og beskjeden oppbevaring i skadet vev5. Videre disse cellebasert strategiene ikke gjenopprette langdistanseløpet axonal traktater, spesielt på en kontrollert måte. Derfor biologisk materiale i kombinasjon med andre tilnærminger blir vurdert som levering biler for ulike nevrale og stamfar celler og vekst faktorer26. Biomateriale tilnærminger har en høy grad av kontroll for skjemautforming å produsere konstruksjoner som etterligner den bestemte fysiske, haptotaxic og chemotaxic signaler til stede i den tredimensjonale (3D) microenvironment målet vert vev27, 28,29,30,31,32,33,34. Reproduksjon av disse Miljøsignaler er avgjørende for transplantert celler presentere native-lignende morfologi, spredning, migrasjon og signalnettverk, blant andre nevrobiologiske egenskaper29. Til tross for disse fordelaktige egenskaper kreves fremme utover tradisjonelle celle seeded biomateriale stillaser samtidig fremme regissert langdistanseløpet axonal foryngelse og erstatte tapt neurons.
En lovende alternativ tilnærming er basert på neural vev utvikling "levende stillaser", som er atskilt fra andre celle-baserte tilnærminger av levende neural celler med en preformed cytoarchitecture som emulerer innfødt nevroanatomi og/eller utviklingsmessige mekanismer for å lette målrettet erstatning, rekonstruksjon og regenerering av nevrale kretser4,35. Betraktninger for design av levende stillaser inkluderer fenotyper og kilder av neural celler, i tillegg til egenskapene mekanisk/fysisk og biokjemiske signalene diktert av sammensetningen av eventuelle medfølgende biologisk materiale35. Etter fabrikasjon i vitro, disse levende stillaser kan være implantert i vivo til stede celle adhesjon molekyler og chemotactic og nevrotropisk signaler å aktivt regulere nevrale celle migrasjon og axon utvekst avhengig tilstand og progresjon av regenererende behandler35. Gliacellene kan tjene som grunnlag for den foretatt cytoarchitecture av levende stillaser siden disse cellene megle ulike utviklingsmessige mekanismer i vivo. Under hjernens utvikling stole nye nerveceller på basale prosesser forlenget med radial glia fra sonen ventrikkel mot utvikle kortikale platen som levende stillaser for rettet migrasjon36,37. Videre utvide veksten kjeglene er vist å orientere seg ved sensing attraktive og frastøtende signaler brakt frem av glial guidepost celler og såkalte "banebrytende" axons foreslås for å nå de riktige målene ved å utvide langs pre mønstret glial stillaser35,38,39. Dermed gliacellene er nødvendig for veiledning av banebrytende axons, som senere tjene som axon-baserte "levende stillaser" til direkte projeksjon av "følger" axons. Videre glia-mediert vekst mekanismer har vist å vedvare fødselen, som neuroblasts følger rostral trekkfugler (RMS) å navigere fra de subventricular sonen (SVZ), en av de få gjenværende områdene av neurogenesis i voksen hjernen, den Luktelappen (SR)40. Disse neuroblasts i RMS overføre innen glial røret (figur 1A-1), som består av langs alliansefrie astrocytic prosesser, via direkte celle-celle adhesjon og lokalisert løselig faktorer37, 41. til slutt, mens CNS skade i pattedyr årsaker forstyrret astrocytic prosess ordning danner et glial arr som fysisk hindrer axonal gjenfødelse17, mange ikke-pattedyr systemer mangler dannelsen av et ødeleggende glial arr. Snarere opprettholde gliacellene av ikke-pattedyr mer organisert, justert mønstre som brukes som støttelinjer gjennom skadet område17,42,43. I ikke-pattedyr SCI modeller vises for eksempel axons å vokse i nært samarbeid med glial broer krysser lesjonen, antyder en viktig rolle for organisert glial stillaser som underlag tilrettelegge axonal regenerasjon og funksjonelle utvinning ( Figur 1A -2) 42 , 44 , 45. recapitulation av funksjonene nevroanatomi og utviklingsmessige/regenerativ mekanismene beskrevet ovenfor kan gi en ny klasse av utviklet glial-baserte levende stillaser som kan samtidig kjøre umodne neuronal migrasjon og axonal pathfinding gjennom ellers uten tillatelse miljøer, og dermed potensielt begrensende effekten av neuronal og axon tarmkanalen degenerasjon knyttet til CNS skader og sykdom.
Vår forskningsgruppe har tidligere utviklet flere typer levende stillaser gjenoppbygging og regenerering av axonal landområder i CNS og det perifere nervesystemet (PNS) via micro-vev konstruert neural nettverk (mikro-TNS) og vev konstruert nerve grafts (TENGs), henholdsvis27,46,47,48. Begge strategier er iboende basert på biomimicry. Mikro-TNS er anatomisk-inspirerte strukturer for strukturelt og funksjonelt erstatte axonal områder kobler forskjellige neuronal bestander av hjernen. TENGs utnytte utviklingsmessige mekanisme axon-tilrettelagt axonal gjenfødelse, eksemplifisert ved "følger" axon vekst langs "pioneer" axons, å oppnå målrettet vert axonal gjenfødelse35,46,48. Vi nylig kapitalisert på allsidigheten av levende stillaset teknikken bruker en lignende encasement ordningen som mikro-TNS og søker inspirasjon fra glia-basert mekanismer tilstede gjennom utvikling. Her utviklet vi konstruksjoner bestående av justert astrocytic pakker som dekker den collagenous lumen av en hydrogel mikro-kolonne49. Disse astrocytic levende stillaser utvikles ved først å fylle en kapillær tube-akupunktur nål montering med flytende agarose for å opprette en hul sylindriske hydrogel med ytre diameter (OD) og indre diameter (ID) tilsvarer diameter på den rør og nål, henholdsvis. Etter agarose gelation og utvinning av hydrogel mikro-kolonnen fra kapillarrør, hul interiøret er belagt med type jeg kollagen å levere et miljø ettergivende for astrocytter vedheft og justert bunt dannelse (figur 1B -1). Etterpå er lumen plantet med cerebral kortikale astrocyttene isolert fra postnatal rotte unger (figur 1B-2). I motsetning til todimensjonal (2D) justering teknikker som stoler på bruk av elektrisk felt, micropatterned spor og ekstracellulær matrix (EFM) protein mønstre, astrocytter justering i levende stillaset bygger teknikken på selvstendig montering Ifølge kontrollerbar variabler som substrat kurvatur (kolonnen ID), cellen tetthet og kollagen konsentrasjon50,51,52. Astrocyttene kontrakt og renovere kollagen, og skaffe en bipolar, langs alliansefrie morfologi analoge til naturlige stillasene observert i vivo (figur 1B-3). Ja, vi aktivt arbeider bruk av disse kabel-lignende strukturer som fysisk substrater for målrettet veiledning av migrere umodne nerveceller som axonal gjenfødelse gjennom ugunstige miljøet av skadde CNS spesielt pattedyr glial arret (figur 1 c). Denne artikkelen vil presentere metoden detaljert fabrikasjon for astrocytic mikro-kolonnene, fase kontrast og immunofluorescence bilder av den forventede cytoarchitecture og en omfattende diskusjon om de nåværende begrensningene og fremtidige retninger av den teknikk.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55848/55848fig1.jpg"> Figur 1: inspirasjon, fabrikasjon protokollen og foreslåtte programmer for justert Astrocytic nettverkene. (A) nevrobiologiske inspirasjon: (1) Neuroblasts fra neurogenic subventricular sonen (SVZ) bruker glial langs linje røret i rostral vandrende stream (RMS) for regisserte migrering mot olfactory pære (SR); (2) ikke-pattedyr som amfibier og fisk kan opprettholde regenerering etter nevrale vev skade delvis på grunn av dannelsen av en glial bro som kobler endene av en leksjonen (f.eks transected ryggmargen), og fungerer som et stillas for veiledning av regenererer axons. (B) fabrikasjon Oversikt: (1) bygging av en mikron-størrelse, hul hydrogel mikro-kolonne med lumen belagt med ECM, (2) såing av primære kortikale astrocyttene isolert fra postnatal rotte unger, (3) selvstendig montering av langs-orientert pakker i kultur, og (4) utvinning av bunt fra biomateriale encasement for fremtidige implantasjon studier. (C) i vivo programmer: (1) disse levende stillaser kan tjene som utviklet glial rør rettet Nevron overføring fra neurogenic sentre å gjenbefolke Nevron dårlig regioner. (2) recapitulation av utviklingsmessige mekanisme banebrytende axon veiledning og regenererende mekanisme glial broer i ikke-pattedyr kan gi gave disse astrocytic stillaser kapasitet til å direkte axon gjenfødelse over den uten tillatelse miljøet i pattedyr glial arret. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55848/55848fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acupuncture needle (300 &#181;m diameter)</td>
			<td>Lhasa Medical</td>
			<td>HS.30x40</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene disposable serological pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter glass capillary tube (701 &#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcap bulb dispenser</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>Bulb comes with the microcap tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP88857200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1451352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm gauge needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-826-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378550-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S50821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litmus paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-876-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170112</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham&#39;s F-12 Nutrient Mixture</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal embryonic neuron basal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Store at 4&#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum free supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 astrocytic supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley embryonic day 18 rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-042816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>EMESCO</td>
			<td>1194-352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-413-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 998 076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 40%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F77P-4</td>
			<td>Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont mounting medium</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-collagen I primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vimentin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB3400</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5326</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Store at 4&#186;C. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1359</td>
			<td>4 mM in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>E1169</td>
			<td>2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxane (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti-S Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration

Biografiske filmer og neurodegenerative sykdom ofte føre til varig nevrologiske underskudd på grunn av den begrensede kapasiteten på sentralnervesystemet (CNS) å erstatte tapt nevroner og regenerere axonal trasé. Men under nervesystemet utvikling, neuronal migrasjon og axonal forlengelsen ofte oppstå langs stier dannet av andre celler, referert til som "levende stillaser". Søker å etterligne disse mekanismene og å utforme en strategi som omgår hemmende miljøet i CNS, dette manuskriptet presenterer en protokoll for å dikte vev utvikling astrocytter-baserte "levende stillaser". For å opprette disse konstruksjoner, ansatt vi en roman biomateriale encasement ordningen å indusere astrocyttene selv sette sammen i tett tredimensjonale bunter av bipolar langs alliansefrie somata og prosesser. Første, hul hydrogel mikro-kolonner ble samlet, og den indre lumen var belagt med kollagen ekstracellulær matrix. Dissosiert cerebral kortikale astrocyttene leverte deretter inn lumen sylindriske mikro-kolonnen og ved kritiske indre diameter < 350 µm, spontant selv justert og å produsere lenge fiber-lignende kabler som består av tett bunter astrocytter prosesser og kollagen fibrils måle < 150 µm i diameter men utvide flere cm i lengde. Dette utviklet levende stillaser utstilt > 97% celle levedyktighet og var nesten utelukkende består av astrocyttene uttrykke en kombinasjon av intermediære proteiner glial-fibrillary Sure protein (GFAP), vimentin, og nestin. Dette justert astrocytter nettverk ble funnet for å gi en ettergivende substrat for neuronal vedlegg og justert neurite forlengelsen. Videre opprettholde disse konstruerer integritet og justering når utvunnet fra hydrogel encasement, gjør dem egnede til CNS implantasjon. Disse preformed konstruerer strukturelt etterligne nøkkel cytoarchitectural elementer av naturlig forekommende glial-baserte "levende stillaser" i vivo. Som sådan, kan disse utviklet levende stillaser tjene som test senger å studere neurodevelopmental mekanismer i vitro eller rette neuroregeneration leder neuronal overføring og/eller axonal pathfinding etter CNS degenerasjon i vivo .

I utgangspunktet kontrast mikroskopi ble brukt til å overvåke utviklingen av astrocytter vedheft og bundle dannelse og den totale stabiliteten av cytoarchitecture som en funksjon av tid. På 1 time etter plating fant astrocyttene gjennom lumen mikro-kolonnene med en sfærisk morfologi (figur 2A). 5 h, astrocyttene begynte utvide prosesser og entreprenørselskap, mens av 8t celler utstilt en komplett prosess-bærende morfologi og dannet kabel-lignende strukt...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration at JoVE.com

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Vi presentere utviklingen av selv montert, tredimensjonal bunter av langs justert astrocytic somata og prosesser i en roman biomateriale encasement. Disse konstruert "levende stillaser", viser mikron skala diameter men utvide centimetere i lengde, kan tjene som test senger å studere neurodevelopmental mekanismer eller lette neuroregeneration av dirigere neuronal overføringen og/eller axonal pathfinding.

Tredimensjonale vev utvikling justert astrocytter nettverk å Recapitulate utviklingsmessige mekanismer og tilrettelegge nervesystemet gjenfødelse

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Human Biology

Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar og tredimensjonale Trykking av Conductive blekk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generasjon av alliansefrie Funksjonell Myocardial Tissue Gjennom Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelig bruskvev Fabrication Bruke Tredimensjonal Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av en Tredimensjonal Full Tykkelse hudekvivalent og Automated såret

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingeniør 3D Cellularized Kollagen Geleer til Vaskulær Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensjonal epitelvev innebygd i ekstracellulær matriks

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelt Electrospinning skriving av tredimensjonale Poly(ε-caprolactone) stillaser med kontrollerbar Morphologies for Tissue Engineering programmer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Dyrking pattedyrceller i tredimensjonale peptid stillaser

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...