Name: three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration
Uploaded: 2018-01-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration at JoVE.com

Apoio financeiro foi fornecido pelo National Institutes of Health [U01-NS094340 (Cullen) & F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Foundation [terapêutico Pipeline programa #9998 (Cullen)], Penn medicina neurociência centro piloto Award (Cullen), Fundação Nacional de ciência [bolsas de pós-graduação pesquisa DGE-1321851 (Struzyna)], departamento de veteranos dos assuntos [RR & D mérito revisão #B1097-eu (Cullen)] e a pesquisa médica do exército dos EUA e Materiel comando [#W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Todos os procedimentos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso de comissões na Universidade da Pensilvânia e o Michael J. Crescenz veteranos assuntos Medical Center e aderiu às diretrizes estabelecidas na política de serviço de saúde pública de NIH em humanos Cuidado e uso de animais de laboratório (2015).
1. desenvolvimento de Agarose Hydrogel Microcolunas
<ol><li>Fazer uma solução de peso/volume (p/v) de 3% de agarose pesando 3 g de agarose e transferindo-o par...

Quando comparado com o ambiente mais favorável do PNS, o CNS é particularmente limitado em lidar com as consequências prejudiciais de neurotrauma e neurodegeneração. Após um grave insulto ao SNC mamífero, é formada uma cicatriz glial, consistindo de um núcleo de células inflamatórias e fibróticos rodeado por uma densa malha de astrócitos reativos desorganizadas que secretam proteoglicanos inibindo a consequência natural do axônio14. Esta cicatriz atua como uma obstrução física e ...

Sistema nervoso central (SNC) tem uma capacidade limitada para compensar a perda e/ou disfunção dos neurônios e vias axonal que acompanham as condições tais como traumatismo crânio-encefálico (TCE), derrame, medular lesão (SCI) e neurodegenerativas doença1 ,2,3,4,5. Neurogênese no SNC é restrito a um número limitado de áreas no cérebro, impedindo a restauração de neurônios perdidos6,7. Além disso, a regeneração das vias axonal perdidas no SNC é insuficiente devido a falta de orientação dirigida, a presença de inibidores de consequência natural e astrogliosis reativa após danos ao tecido neural2,8, 9,10. Astrócitos normalmente têm diversas funções na assistência neurônios com homeostase iónica, liberação de neurotransmissores, formação de sinapse e neurovasculares acoplamento11. No entanto, seguindo até leve dano ao tecido neural, astrócitos podem sofrer mudanças moleculares, estruturais e funcionais como eles transição para um estado hipertrófica11. Em resposta à severa neurotrauma, estas mudanças resultam na formação de uma cicatriz com uma penumbra contendo migrando astrócitos reativos e um núcleo de lesão que inclui leucócitos vazados da ruptura barreira hemato - encefálica (BBB), microglia, oligodendrócitos e fibroblastos11,12,13. Estes astrócitos reativos atingir uma morfologia de processos filamentosos, desorganizados e exibem expressão aumentada de proteínas de filamento intermediário e proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPGs), que impedem a regeneração neural12. Mesmo que a cicatriz glial inicialmente ajuda a restaurar a integridade BBB e evitar a transmissão da resposta inflamatória ao tecido saudável circundante, serve como uma barreira física e bioquímica contra axônio regeneração12,14 ,15,16. Por exemplo, axônios que encontrar a cicatriz glial exibir cones de crescimento distrófica bulbosa e atrofiado crescimento12. Além disso, a desorganização dos processos hamartomas após lesão impede a extensão de regeneração de axônios17. O resultado destas características inibitório manifesta-se nas deficiências permanentes muitas vezes físicas e neurológicas que os pacientes sofrem após grave neurotrauma, incluindo TBI e Sci.
Independentemente dos extrínsecos desafios funcional regeneração no SNC, axônios demonstraram possuir uma capacidade intrínseca de se regenerar. Por exemplo, a natureza dinâmica dos cones distrófica crescimento em contato com a cicatriz glial sugere que estes finais mantém sua capacidade de estender12. Por conseguinte, acredita-se que um obstáculo principal para a re-crescimento axonal é o ambiente inibitório do CNS pós-lesão e que fornecendo um ambiente mais permissivo via redução de cicatrizes e/ou fornecendo regenerativas pontes sobre a cicatriz seria gliais vantajoso. De fato, estudos anteriores demonstraram que os neurônios do CNS eram capazes de estender axônios através de uma lesão utilizando enxertos de nervo periférico como pontes, que apresentam um ambiente mais favorável para o axônio regeneração12,18, 19. Seguiram-se diversas outras estratégias para explorar essa capacidade regenerativa vestigial. Por exemplo, manipulação de vias de sinalização celular crescimento em vários modelos de lesão resultou na regeneração axonal e cicatriz glial redução10,20,21. Além disso, estudos têm mostrado que o tratamento com chondroitinase ABC, que fende a maioria das cadeias de açúcar em CSPGs, diminui o efeito inibitório de CSPGs secretada por astrócitos reativos22. Apesar de encorajador resultados, essas abordagens não fornecem dirigido a orientação dos cones de crescimento, que pode potencialmente resultar em regeneração aberrante12e também não conta para a perda de neurônios. Abordagens baseadas em célula têm sido utilizadas em tentativas de ultrapassar os efeitos da cicatriz glial e para repor as células perdidas, particularmente os neurônios. Alguns grupos têm os astrócitos reativos em neurônios, enquanto outros transplantamos células progenitoras neurais em lesões de CNS para repovoar a área de lesão e promover o axônio regeneração23,24, 25. no entanto, transplante de células-tronco sozinho é limitado por taxas de sobrevivência baixa integração pobre e modesta de retenção no tecido danificado5. Além disso, estas estratégias baseadas em células não restaurar a longa distância axonal panfletos, especialmente em uma maneira controlada. Portanto, biomateriais em combinação com outras abordagens estão sendo exploradas como veículos de entrega para vários neural e fatores de crescimento e células progenitoras26. Abordagens baseadas em biomaterial apresentam um alto grau de controle de projeto para produzir construções que imitam o haptotaxic físico, específico, e sinais quimiotáxicas presente no microambiente (3D) tridimensional do destino anfitrião tecido27, 28,29,30,31,32,33,34. Reprodução desses sinais ambientais é de suma importância para células transplantadas apresentar morfologia como de um nativo, proliferação, migração e sinalização, entre outras características neurobiológicas29. Apesar dessas propriedades vantajosas, avanço além da tradicional célula semeada biomaterial andaimes é necessário para substituir neurônios perdidos e promover a regeneração axonal longa distância dirigida simultaneamente.
Uma promissora abordagem alternativa baseia-se no tecido neural engenharia "andaimes vivos", que são distintos de outras abordagens baseadas em célula devido à presença de células neurais vivas com um cytoarchitecture pré-formadas que emula neuroanatomia nativa e/ou mecanismos do desenvolvimento para facilitar a substituição do alvo, reconstrução e regeneração dos circuitos neurais4,35. Considerações para o projeto de vida andaimes incluem os fenótipos e fontes de células neurais, bem como as propriedades mecânicas e/ou físicas e os sinais bioquímicos ditaram pela composição de qualquer acompanhamento de biomateriais35. Após a fabricação em vitro, estes andaimes vivos podem ser implantado no vivo de moléculas de adesão celular presente e Quimiotáticos e neurotrophic sinaliza para regular ativamente a migração de células nervosas e consequência natural do axônio dependendo do estado e progressão dos processos regenerativos35. Células gliais podem servir como base para a cytoarchitecture engenharia de andaimes de vida, desde que estas células mediam diversos mecanismos do desenvolvimento na vivo. Durante o desenvolvimento do cérebro, os neurônios novos dependem de processos basais prorrogados pela glia radial da zona ventricular para a placa de desenvolvimento cortical como andaimes vivos para migração dirigida36,37. Além disso, estendendo o crescimento cones são mostrada para orientar-se por sensoriamento de sinais atraentes e repelentes eliciados células gliais guidepost, and so-called "pioneiro" axônios são sugeridos para alcançar as metas corretas, estendendo-se ao longo de pre-modelado gliais moldes de38,35,39. Assim, as células gliais são necessárias para a orientação do pioneirismo de axônios, que mais tarde servem como baseado no axônio "andaimes de vida" para direcionar a projeção de axônios "seguidor". Além disso, mecanismos de crescimento mediada por glia foram mostrados para persistir pós-natal, como neuroblastos seguem o fluxo migratório rostral (RMS) para navegar na zona subventricular (SVZ), uma das poucas áreas remanescentes da neurogênese no cérebro adulto, para o bulbo olfatório (OB)40. Estes neuroblastos em RMS migram dentro do tubo glia (figura 1A-1), que é composto por processos hamartomas alinhados longitudinalmente, através de aderências direta célula-célula e localizadas fatores solúveis37, 41. por fim, enquanto danos CNS em causas de mamíferos interrompeu arranjo hamartomas processo formando uma cicatriz glial que impede fisicamente a regeneração axonal17, muitos sistemas não-mamíferos faltam a formação de uma cicatriz glial prejudicial. Em vez disso, as células gliais de espécies não-mamíferos mantenham mais organizado, alinhados a padrões que são usados como guias através da região lesada17,42,43. Por exemplo, em modelos de não-mamíferos SCI, axônios são mostrados para crescer em estreita associação com gliais pontes cruzando a lesão, sugerindo um papel importante para andaimes gliais organizados como substratos, facilitando a regeneração axonal e recuperação funcional ( Figura 1A -2) 42 , 44 , 45. recapitulação das características neuroanatômica e os mecanismos do desenvolvimento/regenerativa descritos acima pode produzir uma nova classe de engenharia baseada em gliais vivos andaimes que simultaneamente pode conduzir a migração neuronal imatura e axonal Pathfinding através de ambientes caso contrário não-permissivo, assim, potencialmente, mitigação dos efeitos da neuronal e degeneração do trato de axônio associado com lesão do CNS e doença.
Nosso grupo de pesquisa anteriormente desenvolveu vários tipos de andaimes de vida para a reconstrução e regeneração dos tracts axonal no SNC e o sistema nervoso periférico (SNP) através de microtecido projetado redes neurais (micro-TNS) e tecido enxertos de nervo engenharia (TENGs), respectivamente,27,46,,47,48. Ambas as estratégias são inerentemente baseia biomimetismo. Micro-TNS são estruturas anatomicamente inspirada projetadas estruturalmente e funcionalmente substituir axonal folhetos conectando distintas populações neuronais do cérebro. TENGs explorar o mecanismo de desenvolvimento da regeneração axonal axônio-facilitada, exemplificado pelo crescimento do axônio "seguidor" ao longo de axônios "pioneiro", para alcançar o hospedeiro alvo regeneração axonal35,46,48. Nós recentemente capitalizou a versatilidade do andaime a vida técnica usando um esquema similar do encastoamento como micro-TNS e buscando inspiração os mecanismos baseados em glia de presentes durante todo o desenvolvimento. Aqui, nós desenvolvemos construções consistindo de feixes hamartomas alinhados, abrangendo o lúmen colágenas de um hidrogel microcoluna49. Estes andaimes hamartomas vivos são desenvolvidos pelo primeiro preencher um conjunto de agulha de acupuntura-tubo capilar com líquido agarose para criar um hidrogel cilíndrico oco com um diâmetro externo (OD) e o diâmetro interno (ID) correspondente para os diâmetros do tubo e agulha, respectivamente. Na sequência de gelificação de agarose e extração de hidrogel microcoluna do tubo capilar, o interior oco é revestido com tipo eu colágeno para fornecer um ambiente permissivo para a adesão de astrocyte e alinhado à formação de feixe (figura 1B -1). Depois, o lúmen é semeado com astrócitos corticais cerebrais, isolados de filhotes pós-natal (figura 1B-2). Contrariamente ao bidimensional (2D) alinhamento as técnicas que dependem da aplicação de campos elétricos, micropatterned grooves e matriz extracelular da proteína (ECM), padronização, alinhamento astrocyte no cadafalso vivos técnica depende de auto-montagem de acordo com variáveis controláveis como colágeno concentração50,,51,52, densidade celular e curvatura do substrato (coluna ID). Os astrócitos contraem e remodelam o colágeno e adquirem uma morfologia bipolar, alinhado longitudinalmente análoga para os andaimes naturais observados na vivo (figura 1B-3). Com efeito, estamos ativamente perseguindo o uso destas estruturas de cabo, como como substratos físicos para orientação alvo da migração de neurônios imaturos, bem como facilitar a regeneração axonal através do ambiente desfavorável do SNC danificado, particularmente a cicatriz glial mamíferos (Figura 1). Este artigo irá apresentar o método de fabricação detalhada para as microcolunas hamartomas, contraste e imunofluorescência imagens de cytoarchitecture o esperado e uma discussão abrangente sobre as limitações atuais e futuras direções da fase a técnica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55848/55848fig1.jpg"> Figura 1: inspiração, protocolo de fabricação e aplicações propostas para as redes de hamartomas alinhadas. (A) neurobiológicos inspiração: neuroblastos (1), originários da zona subventricular neurogênica (SVZ) utilizam o tubo glia alinhado longitudinalmente do fluxo migratório rostral (RMS) para migração dirigida para o bulbo olfatório (OB); (2) não-mamíferos, como os anfíbios e peixes podem sustentar a regeneração após dano no tecido neural em parte devido à formação de uma ponte glia que conecta as extremidades de uma lesão (por exemplo, medula espinhal necrosante) e serve como um andaime para a orientação de regeneração de axônios. (B) visão geral de fabricação: (1) a construção de uma hidrogel de micro-empresas, oco microcoluna com o lúmen revestido com ECM, (2) semeadura do primários astrócitos corticais isolados de filhotes pós-natal, (3) auto-montagem do longitudinalmente orientada pacotes em cultura e (4) extraído do pacote o invólucro de biomaterial para estudos futuros de implantação. (C) na vivo aplicações: (1) estes andaimes de vida podem servir como tubos gliais projetados para a migração de neurônio dirigido de centros neurogênicos repovoar regiões do neurônio-deficiente; (2) recapitulação o mecanismo do desenvolvimento de pioneirismo orientação do axônio e o mecanismo regenerativo das pontes gliais de não-mamíferos pode dotar estes andaimes hamartomas com a capacidade de direcionar a regeneração do axônio através do não-permissivo ambiente da cicatriz glial mamífera. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55848/55848fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acupuncture needle (300 &#181;m diameter)</td>
			<td>Lhasa Medical</td>
			<td>HS.30x40</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene disposable serological pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter glass capillary tube (701 &#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcap bulb dispenser</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>Bulb comes with the microcap tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP88857200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1451352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm gauge needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-826-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378550-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S50821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litmus paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-876-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170112</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham&#39;s F-12 Nutrient Mixture</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal embryonic neuron basal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Store at 4&#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum free supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 astrocytic supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley embryonic day 18 rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-042816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>EMESCO</td>
			<td>1194-352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-413-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 998 076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 40%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F77P-4</td>
			<td>Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont mounting medium</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-collagen I primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vimentin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB3400</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5326</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Store at 4&#186;C. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1359</td>
			<td>4 mM in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>E1169</td>
			<td>2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxane (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti-S Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration

NEUROTRAUMA e neurodegenerativas doença muitas vezes resultam em duração déficits neurológicos devido à capacidade limitada do sistema nervoso central (SNC) a substituir neurônios perdidos e regeneração axonal caminhos. No entanto, durante o desenvolvimento do sistema nervoso, migração neuronal e axonal extensão ocorrem frequentemente ao longo dos caminhos formados por outras células, conhecido como "andaimes de viver". Buscando para emular esses mecanismos e para a concepção de uma estratégia que contorna o ambiente inibitório do SNC, este manuscrito apresenta um protocolo para fabricar a engenharia de tecidos astrocyte-baseado "andaimes de viver". Para criar essas construções, utilizamos um esquema de invólucro romance biomaterial para induzir astrócitos de auto-montagem em feixes tridimensionais densas de bipolar somata alinhado longitudinalmente e processos. Primeiro, oco hidrogel microcolunas foram montados, e o lúmen interno foi revestido com colágeno-matriz extracelular. Astrócitos corticais cerebrais dissociados então foram entregues no lúmen da microcoluna cilíndrica e, com um diâmetro interno crítico de < 350 µm, espontaneamente Self-alinhado e contratada para produzir cabos de fibra-like longas que consiste de feixes densos dos processos de astrocyte e fibrilas de colágeno medindo < 150 µm em diâmetro ainda estender a vários centímetros de comprimento. Estas engenharia vivos andaimes exibidas > 97% de viabilidade celular e foram quase exclusivamente composta de astrócitos, expressando uma combinação de filamento intermediário proteínas glial fibrilar ácida proteína (GFAP), vimentina e nestin. Estas alinhadas astrocyte redes foram encontradas para fornecer um substrato permissivo para fixação neuronal e alinhado à extensão do axônio. Além disso, essas construções mantenham integridade e alinhamento quando extraído o invólucro de hidrogel, tornando-os adequados para implantação do CNS. Essas construções pré-formadas estruturalmente emulam chave cytoarchitectural elementos de ocorrência natural gliais com base em "vivendo andaimes" em vivo. Como tal, estes andaimes de vida projetada podem servir como teste-camas para estudar desenvolvimento neurológico mecanismos em vitro ou facilitar Epilepsias direcionando a migração neuronal e/ou axonal pathfinding degeneração CNS in vivo a seguir .

Inicialmente, contraste de fase microscopia foi usada para monitorar a progressão da formação de aderência e pacote de astrocyte e a estabilidade geral da cytoarchitecture como uma função do tempo. A 1 h depois de chapeamento, astrócitos foram encontrados ao longo do lúmen das microcolunas com uma morfologia esférica (Figura 2A). Às 5h, astrócitos começaram a estender processos e contraindo, enquanto h 8 células exibiram uma morfologia de process...

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Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Vamos mostrar o desenvolvimento de feixes Self montados, tridimensionais do somata hamartomas alinhado longitudinalmente e processos dentro de um invólucro de biomaterial romance. Estas engenharia "vida andaimes", exibindo o diâmetro do mícron-escala ainda estendendo centímetros de comprimento, pode servir como teste-camas para estudar os mecanismos do desenvolvimento neurológico ou facilitar Epilepsias pelo diretor de migração neuronal e/ou axonal Pathfinding.

Engenharia de Tecido Tridimensional de Redes de Astrócitos Alinhadas para Recapitular Mecanismos de Desenvolvimento e Facilitar a Regeneração do Sistema Nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

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Bioengineering

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Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bioengenharia

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Impressão de planar e tridimensional de tintas condutoras

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

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Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

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Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Derreter a eletrofiação escrita de andaimes Poly(ε-caprolactone) tridimensional com morfologias controláveis para aplicações de engenharia de tecidos

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...