Name: three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration
Uploaded: 2018-01-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration at JoVE.com

Mali destek sağlanan ulusal sağlık Enstitüleri [U01-NS094340 (Cullen) ve F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Vakfı [tedavi boru hattı Program #9998 (Cullen)], Penn tıp Neuroscience Center Pilot Ödülü (Cullen), tarafından Ulusal Bilim Vakfı [yüksek lisans araştırma bursu DGE-1321851 (Struzyna)], Department of Veterans Affairs [RR & D hak gözden #B1097-ben (Cullen)] ve ABD Ordusu tıbbi araştırma ve gereç komut [#W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Tüm yordamlar kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler Pennsylvania Üniversitesi ve Michael J. Crescenz Gaziler işleri Tıp Merkezi tarafından onaylanmış ve NIH halk sağlığı hizmetleri ilkesine insana ilişkin olarak belirlenmiş kurallara uyulması Care and Use of Laboratory Animals (2015).
1. geliştirme özel hidrojel mikro-sütun
<ol><li>Özel 3 g ağırlığında ve Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 100 mL içeren steril bir ölçek aktarma tarafından bir öze...

PNS daha destekleyici bir ortam için karşılaştırıldığında, MSS özellikle zararlı sonuçları neurotrauma ve ateş işleme sınırlıdır. Memeli CNS ciddi bir hakaret sonra gliyal bir yara izi oluşan bir çekirdek axon akıbet inhibe Proteoglikanlar14salgılar dağınık reaktif astrocytes yoğun bir meshwork tarafından çevrili fibrotik ve inflamatuar hücre oluşan. Bu yara izi akson uçları12rejenerasyon karşı fiziksel ve biyokimyasal tıkanıklığı gib...

Merkezi sinir sistemi (MSS) kaybı ve/veya nöronlar ve travmatik beyin hasarı (TBY), gibi koşullar eşlik aksonal yolları disfonksiyon karşı koymak için sınırlı bir kapasiteye sahip inme, omurilik yaralanma (SCI) ve nörodejeneratif hastalık1 ,2,3,4,5. MSS neurogenesis beyin, kayıp nöronlar6,7restorasyonu engelleyici alanda sınırlı sayıda sınırlıdır. Ayrıca, MSS kayıp aksonal yollar rejenerasyon yönlendirilmiş rehberlik eksikliği, akıbet inhibitörleri ve reaktif astrogliosis sinir dokusu2,8' ehasar takip varlığı nedeniyle yetersiz olduğunu, 9,10. Astrocytes genellikle nöronlar iyon Homeostazı, nörotransmitter gümrükleme, sinaps oluşumu ve11kaplin nörovasküler yardımcı çeşitli işlevlere sahiptir. Yine de, onlar Hipertrofik devlet11' e geçiş olarak sinir dokusu hatta hafif hasar, moleküler, yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri astrocytes meydana gelebilir. Şiddetli neurotrauma yanıt olarak, bu bir yara oluşumuna geçirme reaktif astrocytes ve parçalanmış kan - beyin bariyerini (BBB), microglia sızan lökosit içerir bir lezyon çekirdek içeren bir penumbra ile değiştirilmesinden, oligodendrocytes ve fibroblastlar11,12,13. Bu reaktif astrocytes ipliksi, dağınık süreçlerin bir Morfoloji ulaşmak ve ara filaman proteinler ve nöral rejenerasyon12engel kondroitin sülfat Proteoglikanlar (CSPGs), artan ifadesi sergilemek. Gliyal yara başlangıçta BBB bütünlüğünün ve sağlıklı dokuyu çevreleyen inflamatuar yanıtın iletimini önlemek yardımcı olur olsa bile, bu axon rejenerasyon12,14 karşı fiziksel ve biyokimyasal bariyer olarak hizmet vermektedir ,15,16. Örneğin, gliyal yara karşılaşma aksonlar soğanlı distrofik büyüme koniler görüntülemek ve büyüme12bodur. Ayrıca, astrositik süreçleri dağınıklığı yaralanma sonra aksonlar17Yenileyici uzantısı engellemektedir. Bu inhibitör özellikleri sonucu hastaların Tby ve bilimler de dahil olmak üzere ağır neurotrauma sonra acı kez kalıcı fiziksel ve nörolojik bozukluklar içinde kendini gösteriyor
MSS fonksiyonel rejenerasyon karşı karşıya dışsal sorunları ne olursa olsun, akson yeniden oluşturmak için içsel bir yeteneğine sahip gösterilmiştir. Örneğin, gliyal yara ile temas distrofik büyüme koniler dinamik doğası bu sonlar12genişletmek için kapasitelerini korur düşündürmektedir. Sonuç olarak, bu aksonlar yeniden büyüme için bir ana engel sonrası yaralanma CNS ve gliyal skarlasma ve/veya yara izi arasında rejeneratif köprüler olurdu sağlayan azaltılması yoluyla fazla izin veren bir ortam sağlayan inhibitör bir ortamdır inanılıyor avantajlı. Gerçekten de, önceki çalışmalarda CNS nöronlar aksonlar periferik sinir grefti axon rejenerasyon12,18için daha uygun bir ortam mevcut köprüler olarak kullanarak bir lezyon üzerinden uzanan yetenekli olduğunu göstermiştir, 19. Çeşitli stratejiler tüylerinin bu rejeneratif kapasite yararlanma takip edilmiştir. Örneğin, hücre büyüme sinyal yolları çeşitli yaralanma modellerinde manipülasyon aksonal rejenerasyon ve gliyal yara izi azaltma10,20,21sonuçlandı. Ayrıca, çalışmalar chondroitinase şeker zincirleri çoğunluğu CSPGs içinde cleaves, ABC ile tedavi CSPGs reaktif astrocytes22tarafından salgılanan inhibitör etkisini azaltır göstermiştir. Rağmen cesaret verici sonuçlar, bu yaklaşımların potansiyel anormal rejenerasyon12' neden olabilir ve aynı zamanda nöronların kaybı için hesap yapmak büyüme koniler rehberliğinde yönetmen sağlamaz. Hücre tabanlı yaklaşımlar girişimleri gliyal yara etkilerini aşmak için ve kayıp hücreleri, özellikle sinir hücreleri doldurmak için kullanılmıştır. Diğerleri yaralanma alanı yeniden doldurmanız ve akson rejenerasyon23,24, teşvik CNS lezyonları nöral progenitör hücre nakli sırasında bazı gruplar reaktif astrocytes nöronlar dediferansiye 25. ancak, kök hücre transplantasyonu tek başına düşük sağkalım oranları, zavallı entegrasyon ve hasarlı doku5mütevazı saklama ile sınırlıdır. Ayrıca, hücre tabanlı strateji de uzun mesafe aksonal yolları, özellikle denetimli bir biçimde geri yüklemek başarısız. Bu nedenle, biyomalzemeler diğer yaklaşımlar ile birlikte teslim araçlar için çeşitli sinir incelenmiştir ve progenitor hücreler ve büyüme faktörleri26. Biomaterial tabanlı yaklaşımlar tasarım denetimi belirli fiziksel, haptotaxic taklit yapıları üretmek için yüksek derecede özelliği ve hedef ana bilgisayar doku27üç boyutlu (3D) microenvironment içinde chemotaxic ipuçları sunmak, 28,29,30,31,32,33,34. Bu çevre sinyalleri çoğaltılması yerli benzeri Morfoloji, nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve, sinyal29arasında diğer nörobiyolojik özellikleri sunmak nakledilen hücreler için her şeyden önemlidir. Bu avantajlı özellikleri rağmen geleneksel hücre tohumlari biomaterial iskele ötesinde gelişme aynı anda yönettiği uzun mesafe aksonal rejenerasyon teşvik ve kayıp nöronlar değiştirmek için gereklidir.
Alternatif bir yaklaşım sinir dokusu üzerinde dayanır umut verici bir "yaşam sinir hücreleri ile yerel Nöroanatomi öykünür bir ön şekillendirilmesi cytoarchitecture varlığı nedeniyle diğer hücre tabanlı yaklaşımlar farklıdır yaşam iskele", mühendislik ve/veya hedeflenen değiştirme, yeniden yapılanma ve yeniden nöro çevrim4,35oluşturulmasını kolaylaştırmak için gelişimsel mekanizmaları. Yaşam iskele tasarımı için önemli noktalar fenotipleri ve sinir hücreleri gibi mekanik/fiziksel özellikleri kaynakları ve biyokimyasal sinyalleri herhangi bir eşlik eden Biyomalzeme35kompozisyon tarafından dikte. İmalat vitrosonra bu yaşam iskele implante vivo içinde mevcut hücre adezyon molekülleri ve kemotaktik olabilir ve Nörotrofik sinyalleri aktif sinir hücre göç ve akson akıbet durumuna bağlı olarak düzenleyen ve rejeneratif ilerlemesini35işler. Bu hücreler çeşitli gelişimsel mekanizmaları vivo içindearacılık beri gliyal hücreler yaşam iskele mühendislik cytoarchitecture için bir temel olarak hizmet verebilir. Beyin gelişimi sırasında Bazal süreçleri yaşayan iskele yönlendirilmiş geçiş36,37için olarak gelişmekte olan kortikal plaka doğru ventrikül bölgeden Radyal glia tarafından genişletilmiş yeni nöronlar güveniyor. Ayrıca, kendilerini çekici ve itici sinyalleri gliyal Işaret hücreleri tarafından elde edildi algılama tarafından yönlendirmek için gösterilen ve sözde "aksonlar öncü" koniler büyüme uzanan önerilir boyunca önceden desenli gliyal genişleterek doğru hedeflere ulaşmak için 35,38,39iskele. Böylece, gliyal hücreler daha sonra olarak axon tabanlı hizmet aksonlar öncülük etmek için sağlanan bilgilerde açıklanan gerekli olan "yaşam iskele" projeksiyon "takipçisi" akson ve yönlendirmek için. Ayrıca, büyüme glia aracılıklı mekanizmalar olarak rostral göçmen akışı (RMS) bölgesinden subventricular (SVZ), bir yetişkin beyninin neurogenesis birkaç diğer alanlarında gezinmek için neuroblasts takip postnatally, kalıcı olması için gösterilmiştir olfaktör ampul (OB)40. Bu neuroblasts RMS boyuna hizalanmış astrositik oluşum, doğrudan hücre-hücre yapışıklıklar yolu ile oluşan ve çözünür faktörler37, lokalize gliyal tüp içinde (şekil 1A-1), göç 41. memeliler nedenleri CNS hasar fiziksel olarak aksonal rejenerasyon17engellemektedir gliyal bir yara izi oluşturan astrositik işlem düzenleme kesintiye iken, son olarak, birçok memeli sistemi zararlı gliyal yara oluşumu eksikliği. Daha doğrusu, Sigara memeli türlerinin gliyal hücreler daha organize, yaralı bölge17,42,43kılavuzları olarak kullanılan desenler hizalı korumak. Örneğin, memeli SCI modellerinde, gliyal köprüler yüzeylerde aksonal rejenerasyon ve fonksiyonel iyileşme (kolaylaştırıcı olarak organize gliyal iskele için önemli bir rol düşündüren lezyon, geçiş ile yakın ilişki içinde büyümeye aksonlar gösterilir Şekil 1A -2) 42 , 44 , 45. tekrarlama nöroanatomik özellikleri ve yukarıda açıklanan gelişimsel/rejeneratif mekanizmaları aynı anda olgunlaşmamış nöronal göç sürebilirim mühendislik gliyal tabanlı yaşam iskele yeni bir sınıf verim ve aksonal Bunun aksi halde keyfi ortamlar, böylece potansiyel olarak nöronal etkilerini Azaltıcı aracılığıyla ve akson yolu dejenerasyonu CNS yaralanma ve hastalık ile ilgili.
Bizim araştırma grubu daha önce yaşayan iskele yeniden inşası için birden çok türde Dizayn ve rejenerasyon aksonal yollarini MSS ve mikro-doku ile periferik sinir sistemi (PNS) sinir ağları (mikro-TENNs) ve doku Mühendisliği sinir grefti (TENGs), sırasıyla27,46,47,48mühendislik. Hem stratejileri doğal olarak Biyomimikri üzerinde temel alır. Mikro-TENNs yapısal ve işlevsel olarak beynin farklı nöron popülasyonları bağlanma aksonal yolları değiştirmek için tasarlanmış anatomik olarak ilham yapılardır. TENGs gelişimsel mekanizması "takipçisi" axon büyüme hedeflenen ana bilgisayar aksonal rejenerasyon35,46,48elde etmek için "öncü" akson boyunca örneği axon kolaylaştırdı aksonal rejenerasyon yararlanmak. Biz son zamanlarda yaşayan iskele çok yönlülük büyük harfle tekniği benzer bir encasement şeması mikro-TENNs ve glia tabanlı mekanizmaları ilham arayan mevcut geliştirme. Burada, kolajen Lümen hidrojel mikro-sütun49kapsayan hizalanmış astrositik demetleri oluşan yapıları geliştirdik. Bu astrositik yaşam iskele çapları için karşılık gelen bir içi boş silindirik hidrojel bir dış çap (OD) ve iç çapı (ID) ile oluşturmak için bir kılcal tüp-akupunktur iğne derleme sıvı özel ile doldurarak geliştirilir tüp ve iğne, anılan sıraya göre. Özel jelleşme ve hidrojel mikro-sütun çıkarma kılcal tüp, içi boş iç kısmıdır kaplı türü ile ben astrocyte yapışma için izin veren bir ortam sağlamak için kollajen ve paket oluşumu (şekil 1B uyumlu -1). Daha sonra lumen postnatal fare pups (şekil 1B-2) izole serebral kortikal astrocytes ile seribaşı. Elektrik alanları, micropatterned oluklar ve hücre dışı matriks uygulanması (ECM) protein desenlendirme, itimat iki boyutlu (2D) hizalama teknikleri astrocyte uyum içinde yaşayan iskele aksine tekniği üzerinde kendinden montajlı dayanıyor substrat eğriliği (sütun Kımlığı), hücre yoğunluğu ve kollajen konsantrasyonu50,51,52gibi kontrol değişkenleri göre. Astrocytes sözleşme ve kollajen yeni model ve iki kutuplu, boyuna hizalı Morfoloji vivo içinde (şekil 1B-3) gözlenen doğal iskele benzer elde etmek. Nitekim, biz aktif olarak bu kablo benzeri yapıların kullanımını hedeflenen rehberlik olgunlaşmamış nöronlar geçiş hem de özellikle bozuk MSS olumsuz ortamı üzerinden aksonal rejenerasyon kolaylaştırmak için fiziksel yüzeyler olarak devam ediyor memeli gliyal yara (şekil 1 c). Bu makalede, astrositik mikro-sütunlar için detaylı imalat yöntemi mevcut beklenen cytoarchitecture ve mevcut kısıtlamaları üzerinde kapsamlı bir tartışma kontrast ve ayirt görüntülerini ve gelecekteki yönleri faz tekniği.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55848/55848fig1.jpg"> Şekil 1: ilham, imalat Protokolü ve hizalanmış astrositik ağlar için Önerilen uygulamalar. (A)nörobiyolojik ilham: (1) Neuroblasts Nörojenik subventricular bölgesinden (SVZ) kaynaklı boyuna hizalanmış gliyal tüp rostral göçmen akışı (RMS) olfaktör ampul (OB); doğru yönlendirilmiş geçiş için kullanmak (2) sonra sinir dokusuna zarar kısmen-bir lezyon (örneğin kopuk spinal kord) ucuna bağlanan ve rehberlik için bir iskele olarak hizmet veren bir gliyal köprü oluşumu nedeniyle kurbağa ve balık gibi sigara-memeliler rejenerasyon ayakta olabilir akson yeniden oluşturuluyor. (B) imalat genel bakış: mikron büyüklüğünde, içi boş hidrojel mikro-sütun ECM ile kaplı Lümen ile inşaat (1) (2) postnatal fare pups (3) kendinden montajlı, boyuna yönelik izole birincil kortikal astrocytes, tohum Kültür ve paket (4) çekme--dan biomaterial mantolama gelecekteki implantasyon Etütler demetleri. (C) In vivo uygulamaları: (1) bu yaşam iskele mühendislik gliyal tüpler için yönlendirilmiş nöron göç--dan nöron eksikliği bölgeleri; yeniden oluşturulacaktır için Nörojenik merkezleri olarak hizmet verebilir (2) tekrarlama axon rehberlik öncülük etmek gelişimsel mekanizması ve sigara-memelilerde gliyal köprüler rejeneratif mekanizması ile axon rejenerasyon sigara-keyfi arasında yönlendirmek için kapasite astrositik bu iskele bağışlamak memeli gliyal yara ortamı. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55848/55848fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acupuncture needle (300 &#181;m diameter)</td>
			<td>Lhasa Medical</td>
			<td>HS.30x40</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08772B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene disposable serological pipet</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter glass capillary tube (701 &#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcap bulb dispenser</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-170J</td>
			<td>Bulb comes with the microcap tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SP88857200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1451352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm gauge needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-826-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378550-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-spatula</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S50821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Maintain at 4 &#186;C and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA48-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Litmus paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-876-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170112</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham&#39;s F-12 Nutrient Mixture</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>Store at 4 &#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal embryonic neuron basal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Store at 4&#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum free supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Store at -20 &#186;C and warm at 37 &#186;C before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 astrocytic supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley embryonic day 18 rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-042816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>EMESCO</td>
			<td>1194-352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-413-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 998 076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 40%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F77P-4</td>
			<td>Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromont mounting medium</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8578</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-collagen I primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34710</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vimentin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB3400</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5326</td>
			<td>Store at -20&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10037</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>Store at 4&#186;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Store at 4&#186;C. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1359</td>
			<td>4 mM in anhydrous DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer-1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>E1169</td>
			<td>2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxane (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti-S Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>--------------</td>
			<td>Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration

Neurotrauma ve nörodejeneratif hastalık genellikle neden kayıp nöronlar değiştirmek ve aksonal yolları yeniden oluşturmak için merkezi sinir sistemi (MSS) sınırlı kapasitesi nedeniyle nörolojik açıkları kalıcı. Ancak, sinir sistemi gelişimi, nöronal göç ve aksonal uzantısı sırasında sık sık "yaşam iskele" anılacaktır diğer hücreleri tarafından kurulan yollar boyunca oluşur. Bu mekanizmalar taklit etmek ve MSS inhibitör ortamının circumvents bir strateji tasarlamak için arayan, bu el yazması mühendislik doku imal etmek bir protokol sunar astrocyte tabanlı "yaşam iskele". Bu yapıları oluşturmak için kendi kendine bipolar somata boyuna hizalanmış ve süreçlerin yoğun üç boyutlu demetleri monte astrocytes ikna etmek için bir roman biomaterial mantolama düzeni çalıştırmaya başladık. İlk, içi boş hidrojel mikro-sütunları toplandı ve iç Lümen kollajen hücre dışı-matriks ile kaplanmış. Disosiye serebral kortikal astrocytes sonra silindirik mikro-sütun ve kritik iç çapı, Lümen içine teslim < kendiliğinden kendini hizalanmış ve yoğun demetleri oluşan uzun elyaf benzeri kabloları üretmek için sözleşmeli 350 µm astrocyte süreçleri ve kollajen liflerinde ölçme < çapı henüz birkaç cm uzunluğunda uzanan 150 µm. Bunlar yaşam iskele sergilenen Mühendislik > % 97'si hücre canlılığı ve neredeyse sadece edildi bir arada ara filaman proteinler fibrillary gliyal asidik protein (GFAP'nin), vimentin, ifade ve testin astrocytes oluşur. Bunlar ağlar için nöronal ek izin veren bir substrat sağlamak bulundu ve neurite uzantısı uyumlu astrocyte uyumlu. Ayrıca, bu yapıları korumak bütünlüğü ve CNS implantasyon için uygundur hidrojel mantolama üzerinden ayıklandığında hizalama. Bu ön şekillendirilmesi yapıları, yapısal olarak doğal olarak meydana gelen anahtar cytoarchitectural öğeleri taklit "iskele yaşayan" içinde vivogliyal tabanlı. Bu nedenle, bu mühendislik yaşam iskele nörogelişimsel mekanizmaları vitro çalışma veya neuroregeneration nöronal göç ve/veya CNS dejenerasyon içinde vivo takiben aksonal kılavuz yönlendirerek kolaylaştırmak için test-yatak olarak hizmet verebilir .

Başlangıçta, faz kontrast mikroskobu cytoarchitecture genel kararlılığını zamanın bir fonksiyonu olarak ve astrocyte adezyon ve paket oluşumu ilerlemesini izlemek için kullanılan. Kaplama sonra 1 h astrocytes küresel Morfoloji (şekil 2A) mikro sütunlarla Lümen çapında bulundu. 5 h, süreçleri uzanan astrocytes başladı ve 8 h iken tarafından taahhüt hücreleri tam bir işlem taşıyan Morfoloji sergilendi ve mikro-sütun (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration at JoVE.com

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Biz kendi kendine montajı, üç boyutlu demetleri boyuna hizalanmış astrositik somata ve süreçlerin bir roman biomaterial encasement içindeki gelişimi vitrin. Bunlar "yaşam iskele santimetre uzunluğunda, genişletme hizmet edebilir henüz test-yatak nörogelişimsel mekanizmaları incelemek veya yönetmenlik nöronal göç ve/veya aksonal neuroregeneration kolaylaştırmak için mikron çaplı çapı sergileyen", mühendislik kılavuz.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

This protocol aims to guide the fabrication of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a micron-sized hydrogel micro-column for use as an in vitro neuro-biological model or as a neuro-regenerative therapy. Trauma and neurodegenerative disease are particularly detrimental to patients due to the restricted neurogenic capacity in inhibitory environment that limit regeneration in the central nervous system. Engineered astrocytic bundles address the limitations of current treatment strategies by attempting to replicate key neuroanatomical features and glia-mediated developmental mechanisms to promoted targeted cell migration and axon pathfinding.The architecture of these astrocytic scaffolds is primarily inspired by the aligned astrocytic processes in the glial tubes of the rostral migratory stream. Begin by preparing a 3%weight per volume agarose solution and DPBS in a sterile beaker. Maintain the heating and stirring to prevent the solution from solidifying prematurely.Insert an acupuncture needle into the bottom opening of the bulb dispenser. Place a capillary tube over the exposed needle and secure the two by entering part of it into the rubber section of the bulb dispenser cylinder. Cap the cylinder to complete the assembly.Transfer one milliliter of liquid agarose to the surface of an empty petri dish. While pinching the rubber cap of the bulb dispenser, insert one end of the capillary tube into the agarose, and release the pressure on the cap to draw agarose into the tube. Place the bulb, tube, needle assemblies on a petri dish and let the agarose solidify inside the capillary tubes for 5 minutes.Then, pull the needle out of the capillary tube, leaving the micro-column still surrounding the needle. Use the tips of foreceps to nudge the micro-column to the end of the needle, then hold the needle over an open DPBS-containing petri dish and push the micro-column into the DPBS. To fabricate micro-column boats, which facilitate later handling of these constructs, begin by making a 4%weight per volume agarose solution, and keeping the solution heated and stirred.Use forceps to move a micro-column to an empty petri dish. Then, while working under a stereoscope, use a micro scalpel to trim the micro-columns to the desired length, with the ends cut at a 45 degree angle. After trimming three more micro-columns, line up the four columns in parallel.Load a pipet with 50 microliters of 4%agarose solution, and dispense a line of liquid over the micro-column array to connect and bundle the constructs into a boat. Allow to cool for 1 to 2 minutes to permit gelation of the 4%agarose. Then use fine forceps to pick up the micro-column boat by the connecting agarose bridge.And move it to a petri dish containing DPBS. Transfer the micro-column boat to a biosafety cabinet and sterilize with exposure to ultraviolet light for thirty minutes. Inside a biosafety cabinet, prepare a 1 milligram per milliliter solution of rat tail type 1 collagen in co-culture medium.And then place it on ice. Adjust the pH of the ECM solution with acid or base as necessary until the pH is stable in the 7.2 to 7.4 range. Transfer the micro-column boat to a 35 or 60 mL petri dish with forceps.Using the stereoscope for guidance, situate the 10 mL tip of a micro-pipette at one end of each micro-column and suction to empty the lumen of DPBS and air bubbles. Charge a P10 micropipette with the collagen solution. Place the 10 mL tip against one end of each micro-column, and deliver enough solution to fill the lumen.Then pipette a reservoir of ECM on either end of the micro-column. Once all columns have been filled, pipette coculture medium in a ring around the petri dish to prevent the columns from drying out. Incubate the dish containing the micro-columns at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for at least one hour to promote polymerization of collagen before adding cells.Afterwards, place the tip of a P10 micropipette at one end of a micro-column and transfer approximately 5 mL of cell solution into the lumen to fill it. After seating all of the micro-columns in a boat, incubate it at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for 1 hour to promote the attachment of astrocytes to the ECM. After the incubation period, carefully fill the dishes containing the seated micro-columns with 3 or 6 mLs of coculture media, for 35 or 60 mL petri dishes respectively.Maintain the plated micro-columns and culture at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide to promote the self assembly of the aligned of the astrocytic bundles, which should form a bundled, cable-like structure after six to ten hours. One hour after plating, astrocytes are spherical in shape and disperse throughout the construct. By five hours after plating, astrocytes initiate process extension and contraction.At eight hours after plating, astrocytes have aligned and contracted. By 24 hours after plating, a dense bundle of astrocytic processes has formed in this example. This fully-formed astrocytic bundle, 24 hours after plating, shows the zippering effect, where the ends of the cable attach to distinct ends of the wall of the lumen.This video shows bundling in action, 3 to 10 hours after plating. Immuno-labeling of the astrocytic scaffolds demonstrates the longitudinal alignment of astrocytic processes. In this confocal image of an astrocytic bundle, the astrocytic marker GFAP is read.And the nuclei are seen in blue. This higher magnification of the bundle permits visualization of the cyto-architecture of the astrocytes within the micro-columns. After watching this video, you should be able to fabricate living scaffolds consisting of longitudinally aligned astrocytic bundles with a biologically inspired cytoarchitecture within a biomaterial encasement.Following this procedure, a transplantation strategy can be designed to deliver the astrocytic bundles with or without the biomaterial encasement to injured brain tissue to promote directed cell migration from neurogenic regions and acts on guidance to the limiting CNS microenvironment. In addition, this technique can be expanded as biofidelic modeling platform glia-mediated neurobiological phenomenon benefited by the mimicry of the native three dimensional environment and the inherent experimental control of in vitro systems.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Human Biology

Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Biyomühendislik

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

İletken Mürekkepler düzlemsel ve Üç Boyutlu Baskı

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Üç boyutlu Mürekkep Püskürtmeli Baskı Teknolojisi Kullanımı İnsan Kıkırdak Doku Fabrikasyon

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Net kalıp tabanlı yöntemi iskele ücretsiz üç boyutlu kalp doku oluşturma

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...