Name: rescue and characterization of recombinant virus from a new world zika virus infectious clone
Uploaded: 2017-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לקריסטן בולרד-פייבלמן, למילנה וסלינוביץ וקלאודיה רוקר על עזרתם באפיון הווירוס הנגזר משבטים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, NIH תחת מענקים AI114675 (BJG) ו AI067380 (GDE).

1. המרה ושחזור של פלסמידים משוכפלים זיהומיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את שני פלסמידים (בנפרד) באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה מסחרית ( למשל , פרוטוקול שינוי 5 דקות NEB) עם כמה שינויים. שני פלסמידים מכילים קידוד גנים עבור עמידות ampicillin,...

<ol>
	<li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika:+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus.">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report,+French+Polynesia,+December+2013.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveill. 19 (9), (2014).</li><li>Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cryptic+prokaryotic+promoter+within+the+cDNA+encoding+the+5'+end+of+dengue+virus+RNA+genome.">Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome.</a> PLoS One. 6 (3), e18197 (2011).</li><li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+propagate+flavivirus+infectious+cDNA+clones+in+bacteria+by+introducing+tandem+repeat+sequences+upstream+of+virus+genome.">A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome.</a> J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).</li><li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+propagation+of+flavivirus+infectious+cDNAs+by+a+novel+method+to+reduce+the+cryptic+bacterial+promoter+activity+of+virus+genomes.">Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes.</a> J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).</li><li>Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+infectious+yellow+fever+RNA+from+full-length+cDNA+templates+produced+by+in+vitro+ligation.">Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation.</a> New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).</li><li>Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+reverse+genetics+system+for+Japanese+encephalitis+virus.">Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.</a> J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).</li><li>Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+major+determinant+of+mouse+neurovirulence+of+dengue+virus+type+2+using+stably+cloned+genomic-length+cDNA.">Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA.</a> J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).</li><li>Johansen, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+insertion+facilitates+amplification+of+cloned+virus+cDNA+in+Escherichia+coli+while+biological+activity+is+reestablished+after+transcription+in+vivo.">Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).</li><li>Shan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+to+Study+Viral+Virulence,+Mosquito+Transmission,+and+Antiviral+Inhibitors.">An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).</li><li>Schwarz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+1947+Zika+Virus+Prototype+Strain+with+a+Cytomegalovirus+Promoter-Driven+cDNA+Clone.">Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone.</a> mSphere. 1 (5), (2016).</li><li>Tsetsarkin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Full-Length+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+from+the+2015+Epidemic+in+Brazil+as+a+Genetic+Platform+for+Studies+of+Virus-Host+Interactions+and+Vaccine+Development.">A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li><li>Gadea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+method+for+the+rapid+generation+of+recombinant+Zika+virus+expressing+the+GFP+reporter+gene.">A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene.</a> Virology. 497, 157-162 (2016).</li><li>Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+an+infectious+dengue+virus+type-2+RNA+genome+(New+Guinea+C+strain).">Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain).</a> Gene. 162 (2), 175-180 (1995).</li><li>Messer, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+reverse+genetic+system+for+studying+dengue+virus+serotype+3+strain+variation+and+neutralization.">Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486 (2012).</li><li>Kinney, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+virulence+and+thermostable+replication+of+the+North+American+strain+of+West+Nile+virus.">Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).</li><li>Chang, A. C., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+amplifiable+multicopy+DNA+cloning+vehicles+derived+from+the+P15A+cryptic+miniplasmid.">Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.</a> J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone.">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. 91 (1), (2017).</li><li>Roberts, P. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+inactivation+by+protein+denaturants+used+in+affinity+chromatography.">Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography.</a> Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> J Vis Exp. (93), e52065 (2014).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone.">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. , (2016).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Drift+during+Systemic+Arbovirus+Infection+of+Mosquito+Vectors+Leads+to+Decreased+Relative+Fitness+during+Host+Switching.">Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).</li></ol>

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode...

נגיף זיקה (ZIKV: משפחה Flaviviridae : Genus Flavivirus ) הוא flavivirus שנולדו יתוש שהגיע בברזיל ב 2013-14 ו היה קשור לאחר מכן עם התפרצות מסיבית של מחלה חום כי התפשטה ברחבי אמריקה 1 . בנוסף, ZIKV נקשר לתוצאות חמורות של המחלה, כגון תסמונת Guillain-Barré במבוגרים ו מיקרוסקפליה בעוברים ובילודים. מעט ידוע על ZIKV לפני התפשטותה המהירה בחצי הכדור המערבי. זה כלל היעדר כלים מולקולריים, ובכך מעכב מחקר מכניסטי. כלים מולקולריים לווירוסים, כגון שיבוטים cDNA זיהומיות, להקל על החיסון ועל התפתחות טיפולית אנטי ויראלית, ולאפשר הערכה של גורמים גנטיים ויראליים הקשורים פתוגנזה ויראלי דיפרנציאלי, התגובה החיסונית ואת האבולוציה ויראלי. Flavivirus שיבוטים זיהומיות ידועים להיות מאוד לא יציבים חיידקים עקב CRיזמים prokaryotic yptic הנוכחי בגנום שלהם 3 . מספר גישות שימשו לשיפור הבעיה; כולל החדרת טנדם חוזרת במעלה הזרם של רצפים ויראליים 4 , מוטציה של רצפים prokaryotic משוער prokaryotic 5 , פיצול הגנום למספר פלסמידים 6 , וקטורים מספר להעתיק נמוך (כולל כרומוזומים מלאכותיים חיידקים) 7 , 8 והכנסת אינטרונים בגנום ויראלי 9 . מערכת אחת באורך מלא ללא שינויים תוארה עבור ZIKV; עם זאת, שיבוט זה נראה להיות מוחלש בתרבית תאים בעכברים 10 . קבוצות אחרות יש מהונדסים אינטרונים לתוך הגנום ZIKV, המאפשר הפרעה רצפים יציבים חיידקים שיכולים להיות spliced ​​החוצה בתאי יונקים במבחנה לייצור וירוס זיהומיות 11, 12 . בנוסף, מערכת מבוססת PCR בשם זיהום Subgenomic-Amplicons שימש בהצלחה להציל את אב טיפוס MR766 אב טיפוס של ZIKV 13 . הגישה המתוארת כאן אינה דורשת רצפים זרים, אלא משבשת את הגנום באזור של חוסר יציבות גבוהה באמצעות פלסמידים מרובים, אשר בעבר נעשה שימוש בהצלחה עם קדחת צהובה 6 , דנגה 14 , 15 ו נילוס המערבי וירוסים 16 . יתר על כן, תוספת של רצף הפטיטיס D ribozyme על טרמיני הגנומי ויראלי מקל על יצירת של 3 אות &#39;אותנטי ללא צורך הוספת של האתר linearization. בנוסף, הן פלסמידים בנויים וקטור מספר עותק נמוך (pACYC177, ~ 15 עותקים לכל תא) כדי למתן כל רעילות שיורית 17 . הנגיף התאושש מציג פרופיל צמיחה דומהנגיף הוריתי ב עקומות הצמיחה במבחנה 8 שורות תאים המרכיבים מגוון של סוגי תאים נגזר הן יונקים וחרקים, וכן הציג פרופילים פתוגניים זהים בעכברים זיהום, הפצה ושיעורי תעבורה יתושים 18 . להלן, אנו מפרטים בפרוטוקול המתאר כיצד לגדל את פלסמידים משוכפלים זיהומיות, ליצור אורך מלא RNA ויראלי (הגנום ויראלי) במבחנה, ולשחזר וירוס זיהומיות בתרבית תאים. ראשית, אנו מתארים את התפשטות של פלסמידים חיידקים או חיידקים ללא הגברה באמצעות הגברה מעגל הגברה (RCA). לאחר מכן, אנו מראים כיצד שני פלסמידים מתעכלים ולאחר מכן ligated לאחר מכן יחד כדי ליצור וירוס באורך מלא. לבסוף, אנו מתארים את הייצור של רנ&quot;א transcript ו electroporation הבאים שלה לתוך תאים Vero, ואחריו טיטרציה של וירוס התאושש ( איור 1 ). הגישה המתוארת היא מהירה, המאפשרתR ההתאוששות של מניות זיהומיות וירוס בשבועות 1-2.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>NEB Stable CompetentE. coli</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C3040H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin, Disodium Salt</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3138S</td>
			<td>20,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td>20,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApaLI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0507S</td>
			<td>10,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td>20,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>20,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3104S</td>
			<td>20,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra TempliPhi 100 Amplification Kit</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>25640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td>1,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>400,000units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2065S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 630 High Throughput Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0423</td>
			<td>Other machines are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3147</td>
			<td>Can be homemade as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0918</td>
			<td>Can be homemade as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>60818-576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T182 flasks</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlas Biologicals</td>
			<td>FP-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth Powder</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>MP 104792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0528-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Denatured</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1156-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td>see table 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Qubit 3.0</td>
			<td>other methods are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>other methods are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32852</td>
			<td>other methods are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biosafety Cabinet</td>
			<td>Varies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is necessary for live-virus work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue and characterization of recombinant virus from a new world zika virus infectious clone

שיבוטים cDNA זיהומיות לאפשר מניפולציה גנטית של הנגיף, ובכך להקל על עבודה על חיסונים, פתוגנזה, שכפול, שידור האבולוציה ויראלי. כאן אנו מתארים את הבנייה של שיבוט זיהומיות עבור Zika וירוס (ZIKV), אשר כרגע גורם להתפרצות נפץ באמריקה. כדי למנוע רעילות לחיידקים, כי הוא נצפה בדרך כלל עם פלסמידים הנגזרים flavivirus, יצרנו מערכת שני פלסמיד המפריד בין הגנום בגן NS1 והוא יציב יותר מאשר באורך מלא בונה שלא ניתן לשחזר בהצלחה ללא מוטציות. לאחר עיכול קשירת להצטרף שני קטעים, RNA ויראלי באורך מלא יכול להיווצר על ידי שעתוק במבחנה עם פולימרז T7 RNA. בעקבות electroporation של RNA transcribed לתאים, וירוס היה התאושש כי הציג דומה קינטיקה הצמיחה במבחנה ב vivo ארסיות פנוטיפים זיהום בעכברים ויתושים, בהתאמה.

פרוטוקול המתואר כאן מאפשר התאוששות של זיהום נגוע נגוע זיקה וירוס. מניפולציה של שני מערכת פלסמיד שיבוט זיהומיות היא פשוטה כאשר מבוצעת בזהירות, לעומת גירסאות באורך מלא, שהם מאוד לא יציבים (נתונים לא מוצגים). לאחר עיכול קשירת של שתי חתיכות נפרדות, כתרים...

Watch this Scientific Journal Video about Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone at JoVE.com

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

פרוטוקול זה מתאר את ההתאוששות של וירוס זיהום זיהומיות משני שיבוט cDNA שני פלסמיד זיהומיות.

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

הפצת ועל גילוי Clone מולקולרית זיהומיות של וירוס Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

גילוי ספציפי וירוס Zika Epitope אבחון

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...