Name: protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

K.A.V. og P.A.A. arbejde blev støttet af European Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), teknik og naturvidenskab forskning Rådet IB katalysator award EP/N013514/1, og bioteknologi og biologiske videnskaber forskning Rådet (BB/L009722/1 og BB/N006321/1). R.H. var støttet af Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, og Lincoln College, Oxford. Forfatterne anerkender Mr. Charlie Jones, Mr. Charlie Evans og personale på det mekaniske værksted (Institut for kemi) om bistand til design og fremstilling af spectroelectrochemical celler, der anvendes i dette arbejde.

1. genskabe indre prøve rum i en FTIR spektrometer inde en anaerob, tør handskerum og generelle eksperimentelle krav
<ol><li>Brug en kommerciel FTIR spektrometer udstyret med en ekstern kviksølv cadmium telluride (MCT) detektor og ATR tilbehør. Rense kroppen af spektrometer med tør luft eller dinitrogenoxider, eller alternativt bruge et spektrometer med en evakueret optisk bænk.</li>
	<li>Placer spektrometer på en stabil, vibrationsfri tabel på samme højde som en anaerob (< 1 ppm O2), tør (dugpunkt <-75 ° C) handskerum. Aflede IR fjernlys i spektrometeret i handskerum, gennem en IR gennemsigtigt vindue, der er stor nok til at rumme den område stråle. Bemærk: Det er vigtigt, at afstanden mellem handskerum og spektrometer også er renset eller evakueret, især hvis en hygroskopisk vindue materiale, såsom NaCl eller KBr f.eks bruges.</li>
	<li>
Replikere den interne prøve rum af spektrometer inde i handskerum.
	<ol>
<li>Direkte stråle inde handskerum på en off-axis elliptisk spejl, ideelt med samme brændvidde som intern fokusering spejlet i spektrometeret. Bemærk: Det er nyttigt at have to ekstra fly spejle placeret før denne fokusering spejl, for at give både højde og retning af IR strålen justeres inde i handskerum; Dette vil opveje enhver unøjagtighed i oprindelig placering i spektrometeret.</li>
		<li>Placere en ekstern MCT detektor, komplet med en passende fokus optik (f.eks. en kort brændvidde ZnSe linse, eller off-axis parabolske spejl, med en kort brændvidde) inde i handskerum, placeret som for at kopiere dimensionerne af den interne prøve rum i spektrometeret.</li>
		<li>Justere fokus for IR fjernlys at være omtrent samme afstand mellem fokus-spejl og MCT detektor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cool dewar af eksterne MCT-detektor med flydende kvælstof.</li>
	<li>Montere ATR tilbehør i handskerum prøve rum. Juster input og output fokuserer optik og ATR tilbehør til at opnå maksimal overførselshastighed til MCT detektor. Brug om nødvendigt en blænde eller andre egnede dæmpning (såsom en wire gitter) at forhindre oversaturation detektor signal. Bemærk: For de data præsenteres her, en fem-refleksion ATR tilbehør med alle reflekterende optik og en aftagelig trapezformet Si indre refleksion element (IRE) bruges (Crystal GmbH, dimensioner ca 5 × 8 × 1 mm3, ansigt vinkel 39,5 °). VREDE er monteret i en flytbar sokkel bearbejdet fra polyestersegmenter ether keton (PEEK).</li>
	<li>Bruge et handskerum til at huse genskabt prøve rum med egnet feedthroughs til at tillade forbindelse til et eksternt husede potentiostat (gas tight BNC forbindelser er nyttige til dette formål), gas adgang, og kablet til at overføre signalet fra MCT detektor. Det er vigtigt at bevare nogen afskærmning på detektor kablet for at undgå at indføre støj eller forstyrrelser i målingerne.</li>
	<li>Placer en peristaltisk pumpe, i stand til at strømningshastigheder større end 60 mL/min. inde i handskerum. En skematisk oversigt over spektrometeret, ATR tilbehør, peristaltisk pumpe og potentiostat setup er vist i figur 1.</li>
	<li>Konstruere en spectroelectrochemical celle, som vist skematisk i figur 2, at sæler på ATR tilbehør. Cellen skal indeholde et højt areal tæller elektrode (Pt wire eller gaze), en forbindelse til arbejdet elektrode (carbon stang) og en miniature referenceelektrode. Cellen skal indeholde mindst to yderligere havne som indsugnings- og udstødningsporte for hurtig strøm af løsninger gennem cellen. Bemærk: En miniature mættede calomel-referenceelektrode er ideelle til dette formål. 36
</li>
</ol>2. fremstilling af Carbon Black partikler modificeret med E. coli Hydrogenase 1
<ol><li>I en 'wet' anaerob handskerum, bland 20 mg af høje overfladeareal kønrøg partikler (> 1.000 m3/g) med 1 mL ultrahigh renhed vand (resistivitet > 18 MΩ cm) i et microcentrifuge rør. Sprede partikler af energibesparende ultralydbehandling (< 100 W) i mindst 15 min, eller indtil spredningen er ensartet og gør ikke sediment inden for 1 time, for at give en kønrøg dispersion med en ladning af ca 20 mg/mL.</li>
	<li>
Tage en alikvot af E. coli hydrogenase 1 (Hyd1, ca 50 µL, tilberedt efter en offentliggjort procedure55) ved en koncentration på ~ 7 mg protein/mL og bytte den til en lav ionisk styrke buffer på en pH tæt på det isoelektriske punkt (for eksempel kalium fosfat, 15 mM, pH 5,8, ingen ekstra salt). For at opnå de bedste resultater, skal du bruge et enzympræparat, der er så aktiv som muligt. Udføre buffer udveksling af koncentration og fortynding, i en centrifugal filter enhed med en passende molekylevægt cutoff (50 kDa virker godt for for Hyd1).
	<ol>
<li>Tilføje en Hyd1 til filter enhed.</li>
		<li>Fortyndes med ca 450 µL af exchange buffer.</li>
		<li>Reconcentrate til et volumen på 50 µL ved hjælp af mild centrifugering (< ~ 2700 × g) at forhindre uoprettelige nedbør.</li>
		<li>Gentag trin 2.2.2 og 2.2.3 indtil buffer exchange er komplet (typisk indenfor ~ 5 cyklusser).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bland en 5 µL diskenhed på 20 mg/mL kønrøg dispersion (udarbejdet i 2.1) med 50 µL alikvot af buffer-udvekslet Hyd1. Store enzym-partikel blandingen i køleskab (ved 0 ° C) natten over for at tillade enzym til adsorberes. Det kan være nødvendigt at ryste blanding lejlighedsvis at sikre partikler forbliver spredte.</li>
	<li>Vask Hyd1-ændret partikler med lav ionisk styrke buffer (kalium fosfat, 15 mM, pH 5,8, ingen ekstra salt) af successive bundfældning og re dispersion cykler i et microcentrifuge (~ 2.700 × g). Gentag denne proces 3 - 5 gange til at fjerne ikke-adsorberet enzym. Bemærk: Før den første vask skal supernatanten være næsten farveløs, der viser god adsorption af enzymet.</li>
	<li>Koncentrere partikler til en endelige mængden af ~ 5 µL, for at give en endelig belastning af ~ 20 mg/mL af enzym-modificerede partikler. Bemærk: Hyd1-ændret partikler kan opbevares ved 4 ° C i op til to uger hvis de forbliver hydreret; Dette opnås bedst ved at gemme partikler fortyndet med ~ 50 µL ultrahigh renhed vand.</li>
</ol>3. forberedelse af PFIRE målinger på E. coli Hydrogenase 1
<ol><li>Ren Si IRE af lav-drevne ultralydbehandling (< 100 W), først i H2så4 (< 90% w/w) for ~ 15 min og derefter HNO3 (70% w/w) for op til 1 time. Denne rengøring procedure bør føre til en hydrofil IRE overflade. Hvis yderligere rengøring er nødvendig IRE kan placeres i piranha løsning (1:3 ratio af H2O2: H2SO4) til at oxidere resterende organisk materiale. Bemærk: Barske sure rensemetoder kan ikke være egnet til brug med alle IRE materialer. Piranha løsning er stærkt ætsende og en stærk oxidant, overflader skal være rimeligt rene før brug af piranha løsning og pleje skal tages under forberedelse og brug af piranha løsning på grund af eksoterme karakteren af processen - altid tilføje H2O 2 langsomt til H2SO4 og henvise til de relevante sikkerhedsprocedurer for fremstilling, anvendelse og bortskaffelse.</li>
	<li>Skylles ren IRE i ultrahigh renhed vand, og tør under en strøm af tør nitrogen gas. Udføre alle prisme håndtering ved hjælp af ren pincet til at undgå forurening.</li>
	<li>Forsegle IRE i ATR tilbehør bundpladen ved hjælp af en tynd strimmel af elektrisk-grade silicone fugemasse. Sørge for at begrænse fugemasse til kanterne af VREDE. Tillad fugemasse til at tørre helt.</li>
	<li>Overføre ATR tilbehør sokkel til spektrometer handskerum og montere det på ATR tilbehør. Foranstaltning referencespektrum (baggrunden) mellem 4000-1.000 cm-1 på 4 cm-1 opløsning, ved hjælp af de standard hurtig scan mode af spektrometret og 1024 gennemsnit interferograms (måling tid ~ 3-5 min). Bruge dette spektrum som input til beregning af absorbans spectra senere i eksperimentet. Bemærk: På grund af den lille absorbans forventes for Hyd1 aktive site er det nødvendigt at indsamle spektre med højt signal til støj forhold.</li>
	<li>Overføre ATR tilbehør sokkel til det 'våde' handskerum, som indeholder den tilberedte Hyd1-ændret partikel dispersion (afsnit 2). Drop-cast 1 µL alikvot af partikel spredning på det store ansigt af VREDE, og sprede dem jævnt hen over overfladen. Bemærk: Ikke Tillad partikler at blive helt tør på IRE.</li>
	<li>Skær et stykke karbonpapir, som den, der anvendes som gas diffusion layer materiale i brændselsceller til en størrelse ~0.1 mm mindre end overfladen af IRE (dvs. ca. 8,2 × 4,9 mm2). Arealet af karbonpapir bør være stor nok til at dække drop-cast Hyd1 modificerede partikler, men ikke så store, overlapper silikone fugemasse bruges til at sikre IRE. Sættetid karbonpapir i vand, og Anbring det forsigtigt over toppen af filmens partikel. Karbonpapir vil give en god elektrisk forbindelse på tværs af hele partikel filmen. Bemærk: Det er gavnligt at forberede flere stykker af karbonpapir på forhånd og gemme dem pre dyppet i ultrahigh renhed vand inde i den «våde» anaerob handskerum.</li>
	<li>Montere spectroelectrochemical celle (beskrevet i 1.7 og vist skematisk i figur 2) over IRE, sikkert det i bundpladen med skruer. Tilføje ~ 200 µL af den eksperimentelle buffer til at holde enzymet hydreret. En blandet buffersystem, i stand til at buffer over et bredt pH-område og er nyttige for studier på NiFe hydrogenases:56 natriumacetat, 2-[N'-morpholino] Ethan-sulfonsyre syre (MES), N'-[2-hydroxyethylmethacrylat] piperazin -N' -[2-Ethan-sulfonsyre syre] (HEPES), N'-tris [hydroxymethyl] methyl-3-amino-propan-sulfonsyre syre (VANDHANER), og 2-[N'-cyclohexylamino] Ethan-sulfonsyre syre (ska), med hver komponent i en endelig koncentration på 15 mM og indeholder 0,1 M koncentreret NaCl som støtte elektrolyt, med pH-værdi justeres til pH 6 ved hjælp af NaOH og HCl. Bemærk: Elektrode arbejdsforbindelse bør rager lidt under plan af spectroelectrochemical celle top (~0.1 mm) at sikre god elektronisk forbindelse til karbonpapir (figur 2).</li>
	<li>Tilslut løsning indsugnings- og udstødningsporte af cellen spectroelectrochemical til en flow-system, der indeholder peristaltisk pumpe slangen og et hætteglas med den eksperimentelle buffer. Overføre den forsamlede celle til den 'tør' handskerum indeholdende spektrometeret.</li>
	<li>Mount spectroelectrochemical celle forsamling på ATR tilbehør. Tilslut arbejde, counter og referenceelektroder til potentiostat. Tilslut peristaltisk pumpe slangen til pumpen.</li>
	<li>Optage en absorbans spektrum med 1024 i gennemsnit interferograms på 4 cm-1 opløsning over en spektral vifte af 4.000-1.000 cm-1, ved hjælp af spektret indsamlet i 3.4 som reference/baggrund. På dette tidspunkt spektret bør indeholde signifikant (> 100 mO.D.) akrylamid II bands på ~ 1,540 cm-1 og aktive site bands af Hyd1 bør være klart i den spektrale region 1.850-2.150 cm-1, stort set i oxideret, inaktive stater (figur 3 ).</li>
</ol>4. aktivering af E. coli Hydrogenase 1 og test Spectroelectrochemical celle
<ol><li>Anvende en reducerende potentiale (−0.8 V vs SCE) til Hyd1-ændret partikel film. Mætte den eksperimentelle buffer med H2 og flow buffer langsomt gennem cellen spectroelectrochemical. Lad prøven overnight fuldt aktivere Hyd1. Bemærk: Det er vigtigt at bruge anaerob H2, N2 osv., og så alle anaerob gasser skal videregives gennem et O2 filter.</li>
	<li>Optage en absorbans spektrum af prøven efter aktivering. ΝCO og vKN bands af det aktive site viser nu en fordeling af reduceret, 'aktive' stater. Dette ses nemmest ved hjælp af en forskel spektrum, i forhold til spektret indspillet i 3.10 (figur 4).</li>
	<li>Test den elektriske tilslutning af cellen spectroelectrochemical. For at gøre dette, mætte den eksperimentelle buffer med N2 gas. Anvende en sekvens af oxiderende (0 V vs SCE) og reducere (−0.8 V vs SCE) potentialer (i ca 30 min. varighed) til Hyd1-ændret partikel film, og optage en absorbans spektrum på hver. Hyd1 skal blive hurtigt oxideret og reduceret, og hvis filmens partikel er godt forbundet 100% af prøven bør reagere på de anvendte potentiale.</li>
	<li>Sæt en passende strømningshastigheden af den eksperimentelle buffer. For at gøre dette, anvende en reducerende potentiale (−0.8 V vs SCE) til prøven og mætte den eksperimentelle buffer med H2. Optage en serie af cyklisk voltammograms mellem-0.707 - 0,039 V vs SCE på en scanning på 10 mV/s. gradvist øge flowet af H2-mættede buffer mellem voltammograms indtil katalytisk bølgeform ved brug af minder på en planar roterende Disc elektrode55 og den maksimale strøm er uafhængig af strømningshastighed (figur 5). Bemærk: Opløselighed af H2 i vand er ~0.8 mM på 293 K og 1 bar.</li>
	<li>Da prøven er nu klar til PFIRE målinger, indsamle spectra på en række potentialer, under en række løsning forhold (pH, temperatur, H2 koncentration osv.). Optage alle elektrokemiske data ved hjælp af potentiostat software, da det er vigtigt at være i stand til at korrelere spektroskopiske og elektrokemiske data, især når man studerer electrocatalytic processer såsom H2 oxidation af Hyd1.</li>
</ol>5. spektroskopiske datahåndtering
<ol><li>Bekræfte, at det aktive site ikke er blevet permanent ændret i løbet af målingerne ved at optage spectra på 0 V og −0.8 V vs SCE i slutningen af forsøget. Disse skal være identisk med spektre registreres i 4.3, og ingen tab af aktive site bør overholdes under målingen (figur 6).</li>
	<li>Eksportere absolutte absorbans spektre fra spektrometer software i et passende format (.csv, ASCII, 'matlab', Jcamp etc.) til behandling ved hjælp af software som oprindelse eller Matlab.</li>
	<li>
Baseline korrigere data, ved hjælp af den proces, der er illustreret i figur 7.
	<ol>
<li>Tage den anden afledede af hvert absorbans spektrum i vifte 1.800-2.150 cm-1, for at identificere små (< 1 mO.D.) aktive site bands baggrund stærkt buet vand.</li>
		<li>Placere baseline markør punkter på den originale absorbans spektrum, og angive punkter skal fastgøres til den eksperimentelle spektrum.</li>
		<li>Passe en baseline gennem punkter ved hjælp af en interpoleret cubic spline-funktion eller et polynomium funktion. Træk dette oprindelige funktion fra eksperimentelle data.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansiel interesse.

PFIRE er et bredt gældende IR spektroskopiske teknik til håndtering af elektrode-immobiliseret redox proteiner. Især kan electrocatalytic reaktioner af redox enzymer blive aftestede på hurtig omsætning betingelser. PFIRE metoden bygger på direkte elektrokemisk kontrol af teknikken med Løbeunderlag, som giver ingen direkte strukturelle oplysninger, og par det til IR-spektroskopi på en kul elektrode. PFIRE tilgangen dermed tilføjer kemiske indsigt til de foreliggende oplysninger fra elektrokemi alene og er yderst velegnet til undersøgelse af redox proteiner og enzymer involveret i lille molekyle bindende og aktivering. Derudover kan PFIRE give oplysninger om potentiale-afhængige strukturelle ændringer i proteiner i mangel af katalytiske omsætning. Sådanne ikke-omsætning elektron overførsel begivenheder er ofte vanskeligt at opdage ved hjælp af 'standard' anvendelser af Løbeunderlag, selvom udvidelse af Løbeunderlag til Fourier-omdannet AC voltammetry har været brugt med stor succes. 45 , 46
Metoden PFIRE er principielt egnet til undersøgelse af eventuelle redox protein, der kan studeres ved hjælp af Løbeunderlag. Derfor, som med Løbeunderlag, protein adsorption er et kritisk skridt til et vellykket PFIRE eksperiment. I denne protokol beskriver vi en anvendelse af den PFIRE teknik ved hjælp af E. coli Hyd1 som et case study. 36 , 43 men vi har også anvendes PFIRE teknik i cytoplasmatisk regulerende hydrogenase fra R. eutropha,44 og flavin mononucleotide adsorberet på kønrøg. 40 i alle disse tilfælde, simple fysiske adsorption til uændret høj areal carbon black (som beskrevet i denne protokol) giver en overflade dækning af protein, der er høj nok til at optage god kvalitet IR spektre med en høj signal-støj-forhold. I tilfælde hvor sådanne høje niveauer af adsorption ikke kan opnås kan det være nødvendigt at ændre overfladen af kulstof partikler, for eksempel at tillade kovalente fastgørelse af protein elektrode overflade. 60 , 61 , 62 brug af et handskerum til PFIRE målinger er kun strengt nødvendigt, når man studerer prøver, der skal håndteres anaerobt. Men i praksis den ekstremt konstant og lav (< 80 ° C dugpunkt) niveauer af vanddamp fra handskerum atmosfære Giv højt signal-støj-niveau, der tillader udvinding af meget små absorptioner. 44 i mange tilfælde en anaerobt miljø, som den, der leveres af handskerum, er også ønskelig for elektrokemisk måling (integreret med teknikken, PFIRE) for at undgå nuværende på grund af O2 reduktion på arbejde elektrode.
IR absorptioner bulk vand, eksperimentelle buffere og carbon partikler som prøve er adsorberet alle bidrage betydeligt til de eksperimentelle spektre og kunne overlapper bands af interesse, især i akrylamid I, II og III regioner af den spektrum. 63 regionen akrylamid indeholder også oplysninger fra økologisk arter som biokemi eller nicotinamid cofaktorer, som substrater og produkter af mange oxidation og reduktion af reaktioner. I forbindelse med NiFe hydrogenases, νCO og νKN bands af det aktive sted falder i et relativt klart område af spektret og så PFIRE teknikken er meget velegnet til studiet af disse enzymer. I andre tilfælde, men kan forskellen spectra kombineret med isotopiske mærkning tilgange være nødvendigt at isolere ændringer som følge af de immobiliserede protein. Lignende metoder har været anvendt til at identificere, for eksempel, protonation ændringer, strukturelle rearrangementer og studere Michaelis-Menten komplekser ved hjælp af IR-spektroskopi. 64 , 65 , 66 PFIRE er således, ikke begrænset til undersøgelse af hydrogenases men kan anvendes til enhver redox protein, der indeholder (eller hvis substrater, produkter eller hæmmere indeholder) grupper med diagnostiske IR-aktive vibrationer; kulilte dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40 og formate dehydrogenases, f.eks.
Den relaterede teknik, SEIRA, er meget velegnet til undersøgelse af membran-associerede proteiner i en biomimetiske miljø. 32 SEIRA er en tilpasning af IR-spektroskopi, der også bruger en ATR-IR konfiguration, og gør brug af en overflade enhancement effekt, der forstærker IR absorbansen af molekyler ligger tæt på (inden for et par nm) overfladen af ATR prisme (IRE). SEIRA er derfor udsøgt følsomme spektrale ændringer, der forekommer inden for den adsorberede protein og membran arkitektur og er relativt fri for konkurrerende signaler fra opløsningsmiddel og substrater-hæmmere er til stede i løsning. Dette er lidt i modsætning til den PFIRE teknik beskrevet her, som bygger på en væsentligt større indtrængningsdybde over overfladen af IRE (~ 1 µm), hvilket betyder, at PFIRE er mere følsomme over for substrater, produkter eller hæmmere præsentere i løsning. Denne øget følsomhed over for 'bulk' opløsningsmiddel kan være en fordel; Hvis underlaget eller produkt kan observeres direkte af IR, rapport PFIRE spektre om begge steady state kinetik af langlivet aktiv arter og associeret produkt dannelse under electrocatalysis. 69 evnen til at iagttage steady state koncentrationer af substrat og produkt vil være særlig værdifuld for enzymer såsom kulilte dehydrogenase (som katalyserer den reversible oxidation af CO til CO2, en stærk IR absorber) eller formate dehydrogenase (som katalyserer den reversible oxidation af formate til CO2).
PFIRE er for øjeblikket begrænset til steady-state kinetiske undersøgelser af enzymet electrocatalysis på grund af de makroskopiske Kulelektroder bruges til at koncentrere sig enzym på overfladen af en VREDE for dataindsamling i og ATR-IR geometri. I denne henseende er PFIRE undersøgelser af NiFe hydrogenases supplerer arbejdet i Dyer og kollegaer,49,50 , der bruger lys-udløst forbigående absorption IR-spektroskopi studere sub omsætning kinetik. Arbejdes til miniaturize spectroelectrochemical celle,40 og med brug af microelectrodes tidsopløsning på rækkefølgen mikrosekunder bør være opnåelige. Dette vil aktivere undersøgelse af sub omsætning kinetik for enzymer med omsætning frekvenser op til ca 100-500 s-1, og vil sætte studiet af både reduktiv og oxidative processer.
Samlet set er PFIRE en spektroskopisk teknik, der giver mulighed for kemiske karakterisering af electrocatalytic reaktioner af redox enzymer under steady state-betingelser. Metoden PFIRE tillader flere kemiske og elektrokemiske titreringer skal udføres på den samme prøve, enzym, da de høje areal elektroder anvendes giver en solid adsorption af protein og ATR-IR geometri tillader letkøbt løsning exchange. Evnen til at indsamle sådanne strukturelle oplysninger i situ under enzym funktion er et uvurderligt værktøj for den bredere bioelectrochemistry samfund.

En central udfordring i studiet af protein funktion indebærer udvikling af i situ metoder, der giver mulighed for direkte observation af proteiner udfører deres fysiologiske roller, enten i vivo eller ved hjælp af isolerede protein prøver. Dette kræver integration af kontrol eller udløse processer i eksperimentelle procedurer og anvendelse af kombinerede teknikker, der tillader både reaktivitet skal vurderes, og enkelte kemiske trin under protein funktion skal måles, samtidigt. I tilfælde af redox proteiner svarer dette ofte til at kombinere elektrokemiske teknikker, som netop kontrollere den anvendte potentiale, men giver ingen direkte kemiske oplysninger, med spektroskopiske teknikker, der er følsomme over for kemisk-specifikke ændringer forbundet med protein funktion. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry er en generel betegnelse for en række koblede elektrokemiske og spektroskopiske metoder, som omfatter en række teknikker, spektroskopiske og elektrokemiske kontrolniveauerne. Mange proteiner kan udveksle elektroner med kunstige, opløseligt electron donorer og acceptorer og dette er blevet udnyttet i undersøgelser, der anvender små molekyler for at mægle elektron overførsel, herunder kobling med UV-synlige,4,5 , 6 , 7 magnetiske cirkulære dichroism8 og infrarød5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. I et begrænset antal tilfælde har det været muligt at udnytte uformidlede, diffusion-kontrollerede elektron udveksling mellem proteiner og elektroder. 15 , 16
For katalytiske reaktioner udført af redox enzymer, løsning elektrokemi tilgange til stede en klar ulempe. Diffusion-kontrollerede elektron overførsel via redox mæglere i løsning er tilbøjelige til at blive hastighedsbegrænsning. Kinetiske og mekanistiske information om enzymet kan gå tabt eller i det mindste blive vanskeligt at deconvolute fra diffusion artefakter som følge af den eksperimentelle metode. Direkte og uformidlede elektrokemiske kontrol er derfor et vigtigt redskab for studiet af redox proteiner og enzymer. Teknikken med protein film elektrokemi (PFE) beskæftiger elektrode-immobiliseret redox proteiner, på en sådan måde, at elektroner er overført direkte til eller fra redox cofaktorer inden for protein som elektroden er polariseret på en række potentialer. 17 , 18 , 19 PFE er af ganske særlig værdi for studiet af oxidation eller reduktion reaktioner katalyseret af redox enzymer, som interfacial elektron overførsel kan opnås med en meget høj hastighed. For eksempel, blev electrocatalytic omsætning sats af nikkel-jern ([NiFe]) hydrogenase fra Allochromatium vinosum målt af Løbeunderlag som ca 1.000-10.000 s1 for H2 oxidation. 20 elektrode potentielle fungerer som en udløser til Drej katalyse 'on' eller 'off' og electrocatalytic aktuelle rapporter på enzymaktiviteten. Løbeunderlag er derfor en værdifuld metode til at analysere reaktiviteten af komplekse enzymer, der er intimt afhængige potentiale, såsom reaktioner di-jern aktive site [Lasse]-hydrogenases med CO og O2,21 eller potentiale-induceret inaktivering reaktioner af hydrogenases,22 kulilte dehydrogenase,23 og andre komplekse redox enzymer. 24
Den vigtigste hindring for kombinerer spektroskopiske teknikker med direkte elektrokemisk kontrol af Løbeunderlag udspringer af den lave overfladedækning af redox enzymer, om 1-2 pmol cm-2 for [NiFe] hydrogenase fra A. vinosum, 20 i forhold til i situ overflade videnskabelige studier af lille molekyle adsorbates på bulk metal elektroder. Dette er en udfordring for følsomheden af de spektroskopiske målinger. Flere spectroelectrochemical metoder er blevet rapporteret til at studere immobiliseret redox proteiner på en række forskellige elektroder: UV-synlige spektroskopi på gennemsigtige metaloxid elektroder; 25 , 26 , 27 fluorescens spektroskopi på guld elektroder; 28 , 29 overflade forbedret infrarød absorption (SEIRA) spektroskopi på guld elektroder; 30 , 31 , 32 , 33 og overflade øget Raman spektroskopiske teknikker, hovedsagelig på sølv elektroder. 34 , 35
Her beskriver vi en metode for kobling PFE med IR-spektroskopi, i en teknik kendt som protein film infrarød elektrokemi (PFIRE). 36 den PFIRE metode undersøgelser redox enzymer immobiliseret på et højt areal carbon arbejder elektrode sammenholdt med en svækket samlede Reflektionsgraden IR (ATR-IR) geometri, at udnytte lethed af adsorptionen af en række proteiner på carbon overflader. IR-spektroskopi er nyttig i undersøgelser af redox enzymer og proteiner, som mange små molekyler, ligander og cofaktorer har diagnostisk absorptioner, der kan bruges til at vurdere reaktivitet, bindende, hæmning og redox stat. Eksempler omfatter binding af nej til jern-svovl centre,37 undersøgelse af flavoproteins,38,39,40 små molekyler binding til hæm Centre etc. 41 the ATR-IR geometri giver mulighed for opførelse af en optimeret tre-elektrode (spectro) elektrokemisk celle42 og derfor giver fremragende elektrokemiske kontrol. Løsning modstand og potentielle drift er minimeret ved at placere en referenceelektrode tæt på arbejde elektrode. Der anvendes høj areal counter elektroder, der er kompatible med høj electrocatalytic strømme produceret af hurtig enzym omsætning på arbejde elektrode. Strømmen af løsning gennem cellen spectroelectrochemical giver mulighed for facile kontrol over koncentrationen af substrater, hæmmere og pH. 36 , 43 , 44 den PFIRE metode tillader derfor IR spektre at være optaget i situ under vedvarende enzym electrocatalysis. 36 , 44 PFIRE er også i stand til at levere kemiske oplysninger i mangel af katalytisk aktuelle,43 i modsætning til PFE hvor kan det være svært at udtrække oplysninger fra ikke-katalytiske processer i redox enzymer. 45 , 46
Vi har vist PFIRE metoden til undersøgelse af electrocatalytic H2 oxidation af [NiFe] hydrogenases, som indeholder iboende CO og KN ligander koordineret til Fe på et bimetal aktive site. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases er derfor særligt velegnet til at studere ved PFIRE. Metoden PFIRE indeholder oplysninger om de arter, der er til stede under steady-state omsætning, og derfor giver afgørende mekanistiske indblik ud over rigdommen af litteratur på IR-spektroskopi af hydrogenases uden eksperimentelle kontrol over omsætning. 47 , 48 Dyer og kollegaer har ansat tidsopløst IR metoder til undersøgelse af NiFe hydrogenases,49,50,51 bruge en lys udløser til enten anvende en lille negativ potentielle skridt (via brugen løsning mæglere og en "bur" elektron kilde) eller photolyse et bundet hydrid. Selv om metoden PFIRE ikke kan på nuværende tidspunkt, giver tidsopløsning at matche disse målinger,40 det giver mulighed for undersøgelse af både reduktiv og oxidativ katalytiske processer, adgang til en række veldefinerede potentialer og gratis fra massetransporten begrænsninger.
Metoden PFIRE er adskilt fra SEIRA undersøgelser af redox proteiner, som også bruger en ATR-IR geometri og ansætte en nanoskala-ru metal elektrode til at forbedre IR absorbansen af molekyler adsorberet på elektrode overflade. 30 SEIRA er en yderst værdifuld teknik til at studere Membranproteiner, især adsorberet på eller inden for mimetiske membran arkitekturer,32 , men behovet for en metal elektrode kan begrænse substrat og inhibitor reaktivitet elektrode støtte til små molekyler som CO, KN--, CO2 osv. Proton reduktion og selvsamlede éncellelag desorption kan være problematisk på metaloverflader på meget negative potentialer, er1,52 selv om enzymet electrocatalysis på ubeskyttede metal elektroder blevet rapporteret. 53 , 54 en ulempe ved PFIRE i forhold til SEIRA er relativ vanskeligheden ved at indarbejde Membranproteiner i native eller mimetiske membran arkitekturer. Men den relative kemisk inaktive af Kulelektroder konkurrerende lille molekyle aktivering reaktioner gør PFIRE en fremragende teknik til at studere enzymet electrocatalysis, især i lav-potentiale domæne relevante for biologiske redox processer som proton reduktion af hydrogenases. 1 , 43
Formålet med denne artikel er at indføre metoden PFIRE som en teknik til at studere elektrode-immobiliseret redox proteiner, med NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) fra Escherichia coli, som eksempel. Overvejelser af prøveforberedelse, kravet om godt substrat flow og data håndtering diskuteres. PFIRE er et bredt gældende teknik, velegnet til at undersøge enhver redox protein (med karakteristiske IR absorptioner), der kan være adsorberet på Kulelektroder, enten direkte eller ved hjælp af overflade ændring, således at det kan udveksle elektroner med den elektrode.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">680-IR</td>
			<td style="width:167px;">with an external MCT detector</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ATR accessory</td>
			<td style="width:71px;">Pike Technologies</td>
			<td style="width:119px;">GladiATR</td>
			<td>Customised for use with a 5-reflection Si IRE</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glovebox</td>
			<td style="width:71px;">Glove Box Technology Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Custom designed &#39;wet&#39; and &#39;dry&#39; box for anaerobic sample handling and measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KBr window</td>
			<td style="width:71px;">Crystran</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Additional optics</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Components from a PM-IRRAS accessory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Silicon IRE</td>
			<td style="width:71px;">Crystal GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potentiostat</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;">Autolab PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nova 10.1</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling the potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:71px;">Williamson Manufacturing Company Ltd</td>
			<td>QL-1000-024-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pt wire</td>
			<td style="width:71px;">Surepure Chemetals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272</td>
			<td>99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon rod</td>
			<td style="width:71px;">WH Smith</td>
			<td align="right">30729209</td>
			<td>0.7 mm HB pencil lead</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbon black</td>
			<td style="width:71px;">Cabot Corporation</td>
			<td style="width:119px;">Black Pearls 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrasonic bath</td>
			<td style="width:71px;">Ultrawave</td>
			<td style="width:119px;">U100</td>
			<td>35 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC5050BK</td>
			<td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5452000018</td>
			<td>MiniSpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/9240/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HNO3</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">N/2300/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">silicone sealant</td>
			<td style="width:71px;">Cow Corning Toray Co., Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">SE 4486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon paper</td>
			<td style="width:71px;">Toray</td>
			<td style="width:119px;">TGP-H-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro 2015</td>
			<td style="width:71px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis/graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resolutions Pro 4.0</td>
			<td style="width:71px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling FTIR spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase

Forståelse af redox proteiner krav metoder, som giver præcis kontrol over redox kemi centre inden for protein. Teknikken med protein film elektrokemi, hvor et protein er immobiliseret på en elektrode overflade, sådan at elektroden erstatter fysiologiske electron donorer eller acceptorer, har givet funktionelle indblik i en vifte af forskellige redox-reaktioner proteiner. Fuld kemiske forståelse kræver elektrokemiske kontrol skal kombineres med andre teknikker, som kan tilføje ekstra struktur- og mekanistiske indblik. Her viser vi en teknik, protein film infrarød elektrokemi, som kombinerer protein film elektrokemi med infrarød spektroskopiske prøvetagning af redox proteiner. Teknikken bruger en multiple-refleksion svækkede samlede Reflektionsgraden geometri for at sonde en redox protein immobiliseret på et højt areal kønrøg elektrode. Indarbejdelse af denne elektrode i en flow-celle tillader løsning pH eller opløste koncentrationer ændres under målingerne. Dette er særligt effektive i håndteringen af redox enzymer, hvor hurtig katalytiske omsætning kan opretholdes og kontrolleret på elektroden tillader spektroskopiske observation af langlivede mellemliggende arter i den katalytiske mekanisme. Vi demonstrere teknik med eksperimenter med E. coli hydrogenase 1 under omsætning (H2 oxidation) og ikke-omsætning betingelser.

Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Her, beskriver vi en teknik, protein film infrarød elektrokemi, som tillader immobiliseret redox proteiner studeres hjælp under direkte elektrokemisk kontrol på en kul elektrode. Infrarød spektre af en enkelt protein prøve kan optages på en række anvendte potentialer og under en række løsning betingelser.

Protein Film infrarød elektrokemi demonstrerede for undersøgelse af H2 Oxidation af en [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens Anisotropi som værktøj til at studere protein-protein interaktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA og CLC: CLF-1-afhængig Nedregulering af CNTFRa som demonstreret ved Western blotting, Inhibering af lysosomale enzymer, og Immunocytokemi

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Måling af proteinbinding til F-actin ved co-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gennemtrængende peptider til at studere intracellulær Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposom målinger for studiet af Proton-pumpe membran enzymer ved hjælp af elektrokemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisering af individuelle protein aggregater ved infrarød Nanospektroskopi og atomkraften mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Oprettelse af meget specifikke kemisk induceret protein Dimerization systemer ved trinvis Phage udvælgelse af en kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek