Name: protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

Het werk van K.A.V. en P.A.A. werd gesteund door de European Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), de Engineering and Physical Sciences Research Raad IB katalysator award EP/N013514/1, en de biotechnologie en de biologische onderzoek van Wetenschappen Raad (BB/L009722/1 en BB/N006321/1). R.H. werd gesteund door Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, en Lincoln College, Oxford. De auteurs erkennen Mr. Charlie Jones, Mr Charlie Evans en personeel van de mechanische Workshop (Department of Chemistry) voor hulp bij het ontwerp en de vervaardiging van spectroelectrochemical cellen die worden gebruikt in dit werk.

1. het herscheppen van het compartiment van de interne monster van een Spectrometer FTIR binnen een anaërobe, droge Glovebox en experimentele Algemeneeisen
<ol><li>Gebruik een commerciële FTIR-spectrometer, uitgerust met een externe kwik cadmium telluride (MCT) detector en ATR accessoire. Zuiveren van het lichaam van de spectrometer met droge lucht of dinitrogen, of alternatief gebruiken een spectrometer met een geëvacueerd optische bank.</li>
	<li>Plaats de spectrometer op een stabiele, trillingsvrij tafel op dezelfde hoogte als een anaërobe (< 1 ppm O2), drogen (dauwpunt <-75 ° C) ' glovebox '. Doorschakelen van de IR-straal van de spectrometer liggen in de ' glovebox ', via een IR transparant venster dat is groot genoeg voor de intreepupil-straal. Opmerking: Het is belangrijk dat de ruimte tussen de ' glovebox ' en een spectrometer ook gezuiverd of geëvacueerd, vooral als een hygroscopisch venster materiaal, zoals NaCl of KBr bijvoorbeeld wordt gebruikt.</li>
	<li>
De interne monster compartiment van de spectrometer liggen binnen de ' glovebox ' repliceren.
	<ol>
<li>Direct de lichtbundel binnen de ' glovebox ' op een off-axis ellipsvormige spiegel, liefst met de dezelfde brandpuntsafstand als de interne focus spiegel van de spectrometer. Opmerking: Het is nuttig te beschikken over twee extra vliegtuig spiegels geplaatst voordat deze focus spiegel, zodat zowel de hoogte en de richting van de IR-straal worden aangepast binnen de ' glovebox '; Dit zal eventuele onjuistheden in de eerste plaatsing van de spectrometer gecompenseerd.</li>
		<li>Plaats een externe MCT-detector, compleet met een geschikt, zoals voor het repliceren van de afmetingen van het interne monster gericht optiek (zoals een korte brandpuntsafstand ZnSe lens, of off-axis parabolische spiegel, met een korte brandpuntsafstand) binnen de ' glovebox ', geplaatst compartiment van de spectrometer.</li>
		<li>Pas de 'focus' van de IR-straal te zijn ongeveer gelijke afstanden tussen de focus spiegel en de MCT-detector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Koel de dewar van de externe MCT-detector met vloeibare stikstof.</li>
	<li>Monteer de ATR-accessoire in de glovebox monster compartiment. De input en output gericht optica en ATR accessoire om maximale doorvoer naar de MCT-detector uitlijnen Gebruik indien nodig een diafragma of andere geschikte demping (zoals een draad rooster) om te voorkomen dat overbelichtingseffecten van het signaal van de detector. Opmerking: voor de hier gepresenteerde gegevens, een vijf-reflectie ATR accessoire met alle reflecterende optica en een verwijderbare trapeziumvormige Si interne reflectie element (IRE) wordt gebruikt (Crystal GmbH, afmetingen ca 5 × 8 × 1 mm3, face hoek 39,5 °). Het IRE is gemonteerd in een verwijderbare basisplaat gefreesd uit polyether ether keton (PEEK).</li>
	<li>Gebruik van een handschoenenkast naar het huis van de nieuwe monster compartiment met geschikte feedthroughs om verbinding met een extern gehuisvest potentiostaat (strakke BNC gasnetverbindingen nuttig zijn voor dit doel), gas access en kabel overbrengen van het signaal van de MCT detector. Het is belangrijk te behouden een afscherming van de kabel van de detector te vermijden introductie ruis- of interferentieniveau naar de maten.</li>
	<li>Plaats een peristaltische pomp, staat debiet meer dan 60 mL/min binnen de ' glovebox '. Een schematische weergave van de spectrometer, ATR accessoire, peristaltische pomp en potentiostaat setup is afgebeeld in Figuur 1.</li>
	<li>Bouw een spectroelectrochemical cel, als schematisch afgebeeld in Figuur 2, dat de zeehonden op de ATR accessoire. De cel moet bevatten een hoge oppervlakte teller elektrode (Pt draad of gaas), een aansluiting voor de werkende elektrode (carbon staaf) en een miniatuur referentie-elektrode. De cel moet ten minste twee verdere poorten als inlaat en uitlaat voor snelle stroom van oplossingen via de cel bevatten. Opmerking: Een miniatuur verzadigde kalomel referentie-elektrode is ideaal voor dit doel. 36
</li>
</ol>2. voorbereiding van de roet deeltjes bewerkt met E. coli Hydrogenase 1
<ol><li>In een 'natte' anaërobe ' glovebox ', meng 20 mg hoge oppervlakte roet deeltjes (> 1000 m3/g) met 1 mL met zuiver water (soortelijke weerstand > 18 MΩ cm) in een microcentrifuge buis. Verspreiden van de deeltjes met het ultrasoonapparaat spaarstand (< 100 W) gedurende ten minste 15 minuten, of totdat de spreiding is uniform en niet sediment binnen 1 uur, niet geven een roet-dispersie met een lading van ongeveer 20 mg/mL.</li>
	<li>
Neem een aliquoot gedeelte van E. coli hydrogenase 1 (Hyd1, ongeveer 50 µL, bereid volgens een gepubliceerde procedure55) met een concentratie van ~ 7 mg eiwit/mL en ruilen in een lage Ionische sterkte buffer met een pH dicht bij het elektrisch punt (voor in het volgende voorbeeld kalium fosfaat, 15 mM, pH 5,8, geen extra zout). Beste resultaten, gebruik een enzympreparaat die zo actief mogelijk is. Het uitvoeren van de uitwisseling van de buffer door concentratie en verdunning, in een centrifugaal filter-apparaat met een passende molecuulgewicht cutoff (50 kDa werkt goed voor Hyd1).
	<ol>
<li>De Hyd1 toevoegen aan de filter-apparaat.</li>
		<li>Verdun met ongeveer 450 µL van exchange buffer.</li>
		<li>Reconcentrate met een volume van 50 µL met milde centrifugeren (< ~ 2700 × g) om te voorkomen dat onherstelbare neerslag.</li>
		<li>Herhaal de stappen 2.2.2 en 2.2.3 om buffer exchange is voltooid (meestal binnen ~ 5 cycli).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Meng een deel van de 5 µL van 20 mg/mL roet dispersie (bereid in 2.1) met de 50 µL hoeveelheid Hyd1 buffer-uitgewisseld. Sla het enzym-deeltje mengsel in een ijskast (bij 0 ° C) 's nachts zodat het enzym te adsorberen. Mogelijk moet schud het mengsel af en toe om ervoor te zorgen dat de deeltjes blijven verspreid.</li>
	<li>De Hyd1 gemodificeerde deeltjes met lage Ionische sterkte buffer (kalium, fosfaat, 15 mM, pH 5,8, geen extra zout) wassen door opeenvolgende cycli van sedimentatie en opnieuw dispersie in een microcentrifuge (~ 2700 × g). Herhaal dit proces 3 - 5 keer voor het verwijderen van niet-geadsorbeerde enzym. Opmerking: Voordat u de eerste was het supernatant moet vrijwel kleurloos, die goede adsorptie van enzym aangeeft.</li>
	<li>Het concentreren van de deeltjes tot een eindvolume van ~ 5 µL, het geven van een definitieve laden van ~ 20 mg/mL van enzym gemodificeerde deeltjes. Opmerking: De Hyd1 gemodificeerde deeltjes kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal twee weken als ze gehydrateerd blijven; Dit is het best bereikt door te slaan deeltjes verdund met ~ 50 µL van met zuiver water.</li>
</ol>3. voorbereiding van de PFIRE metingen op E. coli Hydrogenase 1
<ol><li>Het IRE Si schoon met het lage-aangedreven ultrasoonapparaat (< 100 W), eerst in H2dus4 (< 90% w/w) voor ~ 15 min en vervolgens in HNO3 (70% w/w) voor maximaal 1 uur. Deze schoonmaak procedure moet leiden tot een hydrofiele IRE oppervlak. Als verdere reiniging vereist is het IRE in piranha-oplossing kan worden geplaatst (een verhouding 1:3 H2O2: H2SO4) om te oxideren van eender welk resterende organisch materiaal. Opmerking: Harde zure reinigingsmethoden wellicht niet geschikt voor gebruik met alle materialen van het IRE. Piranha-oplossing is zeer corrosief en een sterke oxidator, oppervlakken moet redelijk schoon voordat gebruik van piranha-oplossing en zorg moet worden genomen tijdens de bereiding en het gebruik van piranha-oplossing het exotherme karakter van het proces - altijd toevoegen H2O 2 langzaam aan H2SO4 en verwijzen naar de juiste veiligheidsprocedures voor voorbereiding, gebruik en verwijdering.</li>
	<li>Spoel de schone IRE in met zuiver water en drogen onder een stroom van droog stikstofgas. Verrichten alle prisma behandeling met behulp van schone pincet om verontreiniging te voorkomen.</li>
	<li>Het IRE zegel in de ATR accessoire basisplaat met behulp van een dunne strook van elektrische-grade silicone sealant. Zorg voor het beperken van het afdichtmiddel aan de randen van het IRE. Laat het afdichtmiddel volledig drogen.</li>
	<li>De ATR accessoire basisplaat overbrengen in de spectrometer ' glovebox ' en dit op de ATR-accessoire koppelen. Maatregel een referentiespectrum (achtergrond) tussen 4000-1000 cm-1 op 4 cm-1 resolutie, met behulp van de standaard snelle scan modus van de spectrometer en 1024 gemiddelde interferograms (meting tijd ~ 3-5 min). Gebruik dit spectrum als input voor berekening van de extinctie spectra verderop in het experiment. Opmerking: Als gevolg van de kleine extinctie verwacht voor de Hyd1 actieve site is het noodzakelijk om te verzamelen van spectra met hoog signaal ruis verhouding.</li>
	<li>De ATR accessoire basisplaat overbrengen in de 'natte' glovebox waarin de vooraf bereid Hyd1 gemodificeerde deeltje dispersie (sectie 2). Drop-cast een hoeveelheid van 1 µL van de spreiding van de deeltjes op het grote gezicht van het IRE, en ze gelijkmatig over het oppervlak. Opmerking: De deeltjes worden volledig droog op het IRE niet toegestaan.</li>
	<li>Knip een stukje van carbonpapier, zoals die gebruikt als gas verspreiding laag materiaal in brandstofcellen, naar een grootte ~0.1 mm kleiner dan de oppervlakte afmetingen van het IRE (d.w.z. ca. 8.2 × 4.9 mm2). De oppervlakte van het carbon papier moet groot genoeg zijn ter dekking van de drop-cast Hyd1 gemodificeerde deeltjes, maar niet zo groot over overlappen de siliconen-sealant gebruikt voor het beveiligen van het IRE. Geniet van het carbon papier in water en zachtjes plaats deze over de bovenkant van de deeltjes film. Het carbon papier levert een goede elektrische verbinding over de hele deeltje film. Opmerking: Het is gunstig voor het bereiden van verschillende soorten carbonpapier op voorhand en sla ze vooraf gedrenkt in met zuiver water binnen de 'natte' anaërobe ' glovebox '.</li>
	<li>Monteren van de cel van de spectroelectrochemical (beschreven in 1.7 en schematisch afgebeeld in Figuur 2) over het IRE, veilig in de basisplaat met schroeven. Voeg ~ 200 µL van de experimentele buffer te houden van het enzym gehydrateerd. Een gemengde buffersysteem, dat kan bufferen over een breed pH-bereik, is handig voor studies over connectoren hydrogenases:56 Natriumacetaat, 2-[N'-morfolino] ethaan-Sulfonzure zuur (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazine -N' -[2-ethaan-Sulfonzure zuur] (HEPES), N'-tris [hydroxymethyl] methyl-3-amino-propaan-Sulfonzure zuur (kranen), en 2-[N'-cyclohexylamino] ethaan-Sulfonzure zuur (CHES), met elk onderdeel op een eindconcentratie van 15 mM en 0,1 M met NaCl als ondersteunend elektrolyt, met pH aangepast aan de pH 6 met behulp van geconcentreerd NaOH en HCl. Opmerking: De elektrode werkende verbinding moet iets uitsteken onder het vlak van de spectroelectrochemical cel top (~0.1 mm) om goede elektronische verbinding met het carbonpapier (Figuur 2).</li>
	<li>De oplossing inlaat en uitlaat van de cel van de spectroelectrochemical verbinden met een stroomsysteem met peristaltische pomp slang en een flesje van de experimentele buffer. De samengestelde cel overbrengen in de 'droge' glovebox met de spectrometer.</li>
	<li>Monteer het spectroelectrochemical cel op de ATR-accessoire. Sluit de werken, de teller en de referentie-elektroden aan de potentiostaat. Sluit de peristaltische pomp slang aan de pomp.</li>
	<li>Een extinctie spectrum met 1024 gemiddeld interferograms bij 4 cm-1 resolutie opnemen over een spectrale serie van 4.000-1000 cm-1, met behulp van het spectrum verzameld in 3.4 als een referentie/achtergrond. Op dit punt het spectrum moet bevatten belangrijke (> 100 mO.D.) amide II banden op ~ 1,540 cm-1 en actieve site bands van Hyd1 moeten blijken in de spectrale regio 1.850-2,150 cm-1, grotendeels in geoxideerde, inactieve staten (Figuur 3 ).</li>
</ol>4. de activering van E. coli Hydrogenase 1 en testen van de Spectroelectrochemical-cel
<ol><li>Een reducerend potentieel (−0.8 V vs SCE) van toepassing op de film Hyd1 gemodificeerde deeltje. Verzadigen de experimentele buffer met H2 en stroom buffer langzaam door de spectroelectrochemical-cel. Laat het monster overnachting volledig activeren de Hyd1. Opmerking: Het is belangrijk te gebruiken anaërobe H2, N2 enz., en dus alle anaërobe gassen moeten worden doorgegeven door een O2 filter.</li>
	<li>Record een spectrum van de extinctie van het monster na activering. Een verdeling van verminderde, 'actief' Staten moeten nu worden weergegeven door de νCO en vCN bands voor de actieve site. Dit wordt meest gemakkelijk waargenomen door het gebruik van het spectrum van een verschil, ten opzichte van het spectrum opgenomen in 3.10 (Figuur 4).</li>
	<li>Test de elektrische verbinding van de cel spectroelectrochemical. Om dit te doen, door de experimentele buffer te verzadigen met N2 gas. Toepassen van een reeks oxiderende (0 V vs SCE) en vermindering van de (−0.8 V vs SCE) mogelijkheden (van ca 30 min duur) voor de film Hyd1 gemodificeerde deeltje en neem een spectrum van de extinctie bij elk programma. De Hyd1 moet worden snel geoxideerd verminderd en als de film deeltje goed verbonden is 100% van het monster moeten reageren op de toegepaste potentieel.</li>
	<li>Het instellen van een juiste debiet van de experimentele buffer. Om dit te doen, een reducerend potentieel (−0.8 V vs SCE) van toepassing op het monster en de experimentele buffer te verzadigen met H2. Opnemen van een serie van cyclische voltammograms tussen-0.707 - 0.039 V vs SCE op een scansnelheid van 10 mV/s. Verhoog geleidelijk het debiet van H2-verzadigde buffer tussen voltammograms tot de katalytische waveshape op die op een vlakke roterende lijkt disc elektrode55 en de maximale stroom is onafhankelijk van debiet (Figuur 5). Opmerking: De oplosbaarheidsgrens van H2 in water is ~0.8 mM bij 293 K en 1 bar.</li>
	<li>Als het monster nu klaar voor PFIRE metingen is, verzamelen spectra op een scala aan mogelijkheden, onder een aantal voorwaarden van de oplossing (pH, temperatuur, H2 concentratie enz.). Alle elektrochemische gegevens met behulp van de software van de potentiostaat, want het is belangrijk om het correleren van spectroscopische en elektrochemische gegevens, met name bij de studie van electrocatalytic processen zoals H2 oxidatie door Hyd1 te kunnen opnemen.</li>
</ol>5. spectroscopische gegevens behandeling
<ol><li>Bevestigen dat de actieve site niet permanent veranderd in de loop van de metingen door het opnemen van spectra op 0 V en −0.8 V vs SCE aan het einde van het experiment. Deze moeten identiek zijn aan de spectra opgenomen in 4.3, en geen verlies van actieve site moet worden waargenomen tijdens de meting (Figuur 6).</li>
	<li>Absolute extinctie spectra van de spectrometer software in een geschikt formaat exporteren (.csv, ASCII, 'matlab", Jcamp etc.) voor verwerking met behulp van software zoals oorsprong of Matlab.</li>
	<li>
Basislijn corrigeren de gegevens, met behulp van het proces geïllustreerd in Figuur 7.
	<ol>
<li>Het bereik 1.800-2,150 cm-1, de tweede afgeleide van elk extinctie spectrum deelnemen teneinde kleine (< 1 mO.D.) actieve site bands tegen de achtergrond van zeer-gebogen water.</li>
		<li>Basislijn marker punten plaats op het oorspronkelijke extinctie spectrum en stel de punten ' snap ' tot de experimentele spectrum.</li>
		<li>Past een basislijn door de punten met behulp van een geïnterpoleerde kubieke spline functie of een polynomiale functie. Deze functie van de basislijn van de experimentele gegevens aftrekken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.

PFIRE is een breed toepasbare IR spectroscopische techniek voor de aanpak van redox-elektrode-geïmmobiliseerd eiwitten. In het bijzonder, kunnen electrocatalytic reacties van Redoxenzymen worden gesondeerd omstandigheden snel omzet. De PFIRE methode bouwt voort op de directe elektrochemische besturing geboden door de techniek van PFE, die geeft geen directe structurele informatie, en het koppelt aan IR spectroscopie op een koolstof-elektrode. De PFIRE benadering dus voegt chemische inzicht om de beschikbare informatie uit elektrochemie alleen en is zeer geschikt voor het bestuderen van redox eiwitten en enzymen betrokken bij klein molecuul bindende en activering. Bovendien bieden PFIRE informatie over potentieel-afhankelijke structurele veranderingen in de eiwitten in de afwezigheid van katalytische omzet. Dergelijke niet-omzet elektron overdracht gebeurtenissen zijn vaak moeilijk op te sporen met behulp van de 'standaard' toepassingen van PFE, hoewel de uitbreiding van PFE tot Fourier-getransformeerd AC voltammetrie is gebruikt met succes. 45 , 46
De PFIRE-methode is in principe geschikt voor de studie van elke redox-eiwit dat kan worden bestudeerd met behulp van PFE. Daarom, zoals bij PFE, eiwit adsorptie is een cruciale stap voor een succesvolle PFIRE experiment. In dit protocol beschrijven we een toepassing van de techniek van de PFIRE met behulp van E. coli Hyd1 als een case-studie. 36 , 43 echter we hebben ook toegepast de PFIRE-techniek op de cytoplasmatische regelgevende hydrogenase van R. eutropha,44 en flavine mononucleotide geadsorbeerde op carbon zwart. 40 in al deze gevallen biedt eenvoudige fysische adsorptie aan ongewijzigde hoge oppervlakte roet (zoals beschreven in dit Protocol) een oppervlak dekking van eiwit dat hoog genoeg is om goede kwaliteit IR spectra met een hoge signaal-/ ruisverhouding. In gevallen waarin dergelijke hoge mate van adsorptie kunnen niet worden bereikt kunnen moet het oppervlak van de koolstof deeltjes, bijvoorbeeld voor het toestaan van covalente gehechtheid van eiwitten aan het oppervlak van de elektrode te wijzigen. 60 , 61 , 62 het gebruik van een handschoenenkast voor metingen van de PFIRE is alleen strikt noodzakelijk als monstes dat anaëroob moet worden behandeld. Echter in de praktijk de zeer constante en lage (< 80 ° C dauwpunt) niveaus van waterdamp die worden geboden door de ' glovebox ' sfeer geven hoge signaal-ruis-waarmee de winning van zeer kleine verticaal absorptie. 44 in veel gevallen een anaëroob milieu, zoals dat verstrekt door de ' glovebox ', is ook wenselijk voor de elektrochemische meting (integraal deel uitmaakt van de PFIRE techniek) om te voorkomen dat de huidige vanwege O2 vermindering op de elektrode werken.
IR verticaal absorptie als gevolg van bulk water, experimentele buffers en de koolstof deeltjes waarop het monster is geadsorbeerd alle aanzienlijk bijdraagt aan de experimentele spectra en kunnen elkaar overlappen bands van belang, met name in het amide I, II en III-regio's van de spectrum. 63 de amide-regio bevat ook gegevens uit biologische soorten zoals flavins of cofactoren nicotinamide, evenals de substraten en producten van vele reacties van oxidatie en reductie. In het geval van connectoren hydrogenases, νCO en νCN bands van de actieve site vallen in een relatief duidelijk deel van het spectrum en zo de PFIRE-techniek is zeer goed geschikt voor de studie van deze enzymen. In andere gevallen echter kunnen verschil spectra in combinatie met isotopische etikettering benaderingen nodig zijn om isoleren van veranderingen als gevolg van de geïmmobiliseerdet proteïne. Soortgelijke benaderingen zijn gebruikt, bijvoorbeeld Protonering om veranderingen te identificeren, structurele herschikkingen en te bestuderen of Michaelis-Menten complexen met behulp van IR spectroscopie. 64 , 65 , 66 PFIRE is dan ook niet, beperkt tot de studie van hydrogenases maar kan worden toegepast op elke redox-eiwit dat bevat (of waarvan substraten, de producten of de remmers bevatten) groepen met diagnostische IR-actieve trillingen; koolmonoxide dehydrogeanses nitrogenases67 ,68,,14 flavoproteinen,40 en formate dehydrogenases, bijvoorbeeld.
De verwante techniek, SEIRA, is zeer goed geschikt voor de studie van membraan-geassocieerde eiwitten in een biomimetische omgeving. 32 SEIRA is een aanpassing van de IR spectroscopie, dat ook een ATR-IR-configuratie gebruikt, en maakt gebruik van een verhoging van de oppervlakte-effect dat de IR-absorptie van moleculen gelegen dicht bij (binnen een paar nm versterkt) van het oppervlak van het ATR-prisma (IRE). SEIRA is dan ook prachtig gevoelig voor spectrale veranderingen die zich voordoen binnen de geadsorbeerde eiwitten en membraan architectuur en is relatief vrij van concurrerende signalen van oplosmiddel en substraten/remmers presenteren in oplossing. Dit is enigszins in tegenstelling tot de techniek van de PFIRE die hier worden beschreven, die gebaseerd op een aanzienlijk grotere indringingsdiepte boven het oppervlak van het IRE is (~ 1 µm), wat betekent dat PFIRE gevoeliger voor substraten is, producten of remmers presenteren in oplossing. Deze verhoogde gevoeligheid voor 'bulk' oplosmiddel kan nuttig zijn; Als het substraat of product worden rechtstreeks door IR waargenomen kan, verslag PFIRE spectra over beide steady-state kinetiek van langlevende actieve soorten en bijbehorende productvorming tijdens electrocatalysis. 69 de mogelijkheid om te observeren steady-state concentratie van substraat en product zullen met name waardevol voor enzymen zoals koolmonoxide dehydrogenase (die katalyseert de omkeerbare oxidatie van CO-CO2, een sterke IR-absorber) of formate dehydrogenase (die katalyseert de omkeerbare oxidatie van formate CO2).
Op dit moment is de PFIRE beperkt tot steady-state kinetische studies van enzym electrocatalysis als gevolg van de macroscopische Koolelektroden gewend 'concentreren' het enzym op het oppervlak van een IRE voor het verzamelen van de gegevens in en ATR-IR geometrie. In dit opzicht zijn PFIRE studies van connectoren hydrogenases complementair aan het werk van Dyer en medewerkers,49,50 , die gebruik maken van licht-geactiveerd voorbijgaande absorptie IR spectroscopie te bestuderen sub omzet kinetiek. Er wordt gewerkt aan de spectroelectrochemical cel,40 miniaturize en met het gebruik van microelectrodes tijd resolutie over de volgorde van microseconden moet haalbaar zijn. Dit maakt studie van sub omzet kinetiek voor enzymen met omzet frequenties tot ca 100-500 s-1, en de studie van zowel reductieve en oxidatieve processen in staat zal stellen.
PFIRE is over het algemeen een spectroscopische techniek waarmee chemische karakterisering van electrocatalytic reacties van Redoxenzymen steady-state omstandigheden. De aanpak van de PFIRE maakt het mogelijk meerdere chemische en elektrochemische titraties worden uitgevoerd op hetzelfde enzym monster, zoals de hoge oppervlakte elektroden gebruikt een robuuste adsorptie van eiwit bieden en de geometrie van de ATR-IR mogelijk facile oplossing te wisselen maakt. De mogelijkheid voor het verzamelen van dergelijke structurele informatie in situ tijdens enzym functie is een waardevol instrument voor de bredere gemeenschap van de bioelectrochemistry.

Een belangrijke uitdaging in de studie van eiwitfunctie heeft betrekking op de ontwikkeling van in situ methoden waarmee directe observatie van eiwitten verrichten hun fysiologische functies, in vivo of met behulp van geïsoleerd EiwitSteekproeven. Dit vereist de integratie van controle of triggering processen in experimentele procedures en het gebruik van gecombineerde technieken waarmee zowel de reactiviteit te worden beoordeeld, en afzonderlijke chemische stappen tijdens eiwitfunctie te worden gemeten, tegelijkertijd. In het geval van redox eiwitten is dit vaak gelijk aan het combineren van elektrochemische technieken, die juist controle van de toegepaste potentieel, maar bieden geen rechtstreekse chemische informatie, met spectroscopische technieken die gevoelig voor chemisch-specifieke zijn wijzigingen eiwitfunctie is gekoppeld. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry is een algemene term voor een aantal gekoppelde elektrochemische en spectroscopische methoden die een verscheidenheid van spectroscopische technieken en niveaus van elektrochemische controle omvatten. Veel eiwitten elektronen met kunstmatige, oplosbaar elektron donoren en Acceptanten kunnen uitwisselen en dit heeft benut in studies die gebruik maken van kleine molecules te bemiddelen elektron overdracht, met inbegrip van de koppeling met UV-zichtbaar,4,5 , 6 , 7 magnetische circulair dichroïsme8 en infrarood5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. In een beperkt aantal gevallen is het mogelijk om te exploiteren onbemiddelde, diffusie-gecontroleerde elektron uitwisseling tussen eiwitten en elektroden gebleken. 15 , 16
Voor katalytische reacties uitgevoerd door Redoxenzymen, oplossing elektrochemie benaderingen aanwezig een duidelijk nadeel. Elektron diffusie-gecontroleerde overdracht via redox bemiddelaars in oplossing dreigt te worden snelheidslimieten. Kinetische en mechanistische informatie over het enzym of kan worden verloren, op zijn minst moeilijk te deconvolute van diffusie artefacten die voortvloeien uit de experimentele methode. Directe, spontane elektrochemische controle is daarom een belangrijk instrument voor de studie van redox eiwitten en enzymen. De techniek van eiwit film elektrochemie (PFE) werkzaam redox-elektrode-geïmmobiliseerd eiwitten, op zodanige wijze dat de elektronen rechtstreeks naar of vanuit de redox cofactoren binnen de proteïne worden overgedragen zoals de elektrode is gepolariseerd op een reeks van mogelijkheden. 17 , 18 , 19 PFE is van bijzonder belang voor de studie van oxidatie of reductie reacties gekatalyseerd door Redoxenzymen, zoals Interfaciale elektronen overdracht kan worden bereikt op een zeer hoog tempo. Bijvoorbeeld, werd de Verwerkingsfrequentie van de electrocatalytic van de nikkel-ijzer ([connectoren]) hydrogenase van Allochromatium vinosum gemeten door PFE als ca 1.000-10.000 s−1 voor H2 oxidatie. 20 de potentiële elektrode fungeert als een trigger om katalyse 'aan' of 'uit', en de huidige verslagen van electrocatalytic over de enzymactiviteit te zetten. PFE is dus een waardevolle methode voor het analyseren van de reactiviteit van complexe enzymen die nauw afhankelijk zijn potentieel, zoals de reacties van de di-strijkijzer actieve site van [FeFe]-hydrogenases met CO en O2,21 of potentieel-geïnduceerde de reacties van de inactivatie van22 koolmonoxide dehydrogenase,23 , hydrogenases en andere complexe Redoxenzymen. 24
De belangrijkste belemmering voor spectroscopische technieken te combineren met de directe elektrochemische besturing geboden door PFE vloeit voort uit de lage oppervlakte dekking van Redoxenzymen, over de volgorde van 1-2 pmol cm-2 voor de [connectoren] hydrogenase van A. vinosum, 20 ten opzichte van de in situ oppervlaktekunde studies van klein molecuul adsorbates op bulk metalen elektroden. Dit vormt een uitdaging voor de gevoeligheid van de spectroscopische meting. Verschillende spectroelectrochemical methoden zijn gemeld voor het bestuderen van geïmmobiliseerd redox eiwitten op een aantal verschillende elektroden: UV-zichtbaar spectroscopie op transparante metaaloxide-elektroden; 25 , 26 , 27 Fluorescentiespectroscopie op gouden elektroden; 28 , 29 oppervlakte verbeterde infraroodabsorptie (SEIRA) spectroscopie op gouden elektroden; 30 , 31 , 32 , 33 en oppervlak verbeterd Raman spectroscopische technieken, hoofdzakelijk op zilveren elektroden. 34 , 35
Hier beschrijven we een methode voor het koppelen van PFE met IR spectroscopie, in een techniek die bekend staat als eiwit film infrarood elektrochemie (PFIRE). 36 de PFIRE methode bestudeert Redoxenzymen geïmmobiliseerd op een hoge oppervlakte koolstof werken elektrode in combinatie met een verzwakte totale reflectantie IR (ATR-IR) geometrie, benutting van het gemak van adsorptie van een reeks eiwitten op koolstof oppervlakken. IR spectroscopie is nuttig in studies van Redoxenzymen en eiwitten als vele kleine molecules, liganden en cofactoren diagnostische verticaal absorptie die kunnen worden gebruikt om bindende, remming, reactiviteit en redox toestand te beoordelen. Voorbeelden zijn bindend voor NO tot ijzer-zwavel centra,37 studie van flavoproteinen,38,39,40 klein molecuul te binden aan Heem centra enz. 41 de ATR-IR geometrie maakt de bouw van een geoptimaliseerde drie-elektrode (spectro) elektrochemische cel42 en daarom biedt uitstekende elektrochemische controle. Oplossing resistentie en mogelijke drift zijn geminimaliseerd door het plaatsen van een referentie-elektrode dicht bij de werken-elektrode. Hoge oppervlakte teller elektroden worden gebruikt die compatibel met hoge electrocatalytic stromingen geproduceerd door snelle enzym omzet op de elektrode werken zijn. Stroom van oplossing via de spectroelectrochemical cel biedt facile controle over de concentratie van substraten, inhibitors en pH. 36 , 43 , 44 de PFIRE methode kan daarom IR spectra te worden opgenomen in situ tijdens aanhoudende enzym electrocatalysis. 36 , 44 PFIRE is ook geschikt voor het verstrekken van chemische informatie in de afwezigheid van katalytische huidige,43 in tegenstelling tot PFE waar het moeilijk is om informatie te extraheren uit niet-katalytische processen in Redoxenzymen kan zijn. 45 , 46
Wij hebben de methode van de PFIRE voor de studie van electrocatalytic H2 oxidatie aangetoond door [connectoren] hydrogenases, waarin intrinsieke CO en GN-liganden afgestemd op Fe op een bimetallic actieve site. 36 , 43 , 44 [connectoren] hydrogenases zijn dan ook bijzonder geschikt om te bestuderen door PFIRE. De methode PFIRE bevat informatie over de soorten die aanwezig tijdens steady-state omzet zijn, en biedt daarom cruciaal mechanistische inzicht naast de rijkdom van de literatuur op IR spectroscopie van hydrogenases zonder experimentele controle over omzet. 47 , 48 Dyer en collega's hebt gebruikt time-resolved IR methoden om te studeren van connectoren hydrogenases,49,50,51 met behulp van een licht trigger toe te passen of een kleine negatieve potentiële stap (via gebruik van oplossing bemiddelaars/mediators en de bron van een 'gekooide' elektron) of photolyse een afhankelijke hydride. Hoewel de PFIRE-methode kan niet, op dit moment tijd resolutie bieden aan deze metingen,40 doet het bestuderen van zowel reductieve en oxidatieve katalytische processen, geraadpleegd op een aantal duidelijk omlijnde potentieel toestaan en vrij van collectief vervoer beperkingen.
De methode PFIRE is verschillend van SEIRA studies van redox eiwitten, die ook de geometrie van een ATR-IR te gebruiken en een nanoschaal-geruwd metaalelektrode ter verbetering van de IR-absorptie van moleculen geadsorbeerd aan het oppervlak van de elektrode in dienst. 30 SEIRA is een uiterst waardevolle techniek voor het bestuderen van membraaneiwitten, in het bijzonder aan geadsorbeerde of binnen mimetische membraan platforms,32 maar de behoefte aan een metalen elektrode kunt beperken het toepassingsgebied van het substraat en remmer als gevolg van reactiviteit van het elektrode-steun ten behoeve van kleine molecules zoals CO, GN--, CO2 enz. Vermindering van de proton en desorptie van zelf geassembleerde enkelgelaagde kunnen worden op metalen oppervlakken op zeer negatieve potentieel problematisch, heeft1,52 hoewel enzym electrocatalysis op onbeschermde elektroden metalen gemeld. 53 , 54 een nadeel van PFIRE ten opzichte van SEIRA is de relatieve moeilijkheidsgraad van het opnemen van membraaneiwitten in native modus of mimetische membraan platforms. Echter, de relatieve chemische bestendigheid van de Koolelektroden concurrerende klein molecuul activering reacties maakt PFIRE een uitstekende techniek voor het bestuderen van enzym electrocatalysis, met name in het lage-potentieel domein relevant zijn voor biologische redox processen zoals proton vermindering door hydrogenases. 1 , 43
Het doel van dit artikel is om de methode van de PFIRE als een techniek voor het bestuderen van redox-elektrode-geïmmobiliseerd eiwitten, connectoren hydrogenase 1 (Hyd1) van Escherichia coli gebruiken als voorbeeld. Overwegingen voor de bereiding van de monsters, de behoefte goed substraat stroom en gegevensverwerking worden besproken. PFIRE is een breed toepasbare techniek, goed geschikt voor het bestuderen van eventuele redox-eiwit (met karakteristieke IR verticaal absorptie) dat kan worden geadsorbeerd op Koolelektroden, hetzij rechtstreeks of met behulp van oppervlakte modificatie, zodanig dat het elektronen met wisselen kan de elektrode.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">680-IR</td>
			<td style="width:167px;">with an external MCT detector</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ATR accessory</td>
			<td style="width:71px;">Pike Technologies</td>
			<td style="width:119px;">GladiATR</td>
			<td>Customised for use with a 5-reflection Si IRE</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glovebox</td>
			<td style="width:71px;">Glove Box Technology Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Custom designed &#39;wet&#39; and &#39;dry&#39; box for anaerobic sample handling and measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KBr window</td>
			<td style="width:71px;">Crystran</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Additional optics</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Components from a PM-IRRAS accessory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Silicon IRE</td>
			<td style="width:71px;">Crystal GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potentiostat</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;">Autolab PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nova 10.1</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling the potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:71px;">Williamson Manufacturing Company Ltd</td>
			<td>QL-1000-024-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pt wire</td>
			<td style="width:71px;">Surepure Chemetals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272</td>
			<td>99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon rod</td>
			<td style="width:71px;">WH Smith</td>
			<td align="right">30729209</td>
			<td>0.7 mm HB pencil lead</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbon black</td>
			<td style="width:71px;">Cabot Corporation</td>
			<td style="width:119px;">Black Pearls 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrasonic bath</td>
			<td style="width:71px;">Ultrawave</td>
			<td style="width:119px;">U100</td>
			<td>35 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC5050BK</td>
			<td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5452000018</td>
			<td>MiniSpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/9240/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HNO3</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">N/2300/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">silicone sealant</td>
			<td style="width:71px;">Cow Corning Toray Co., Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">SE 4486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon paper</td>
			<td style="width:71px;">Toray</td>
			<td style="width:119px;">TGP-H-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro 2015</td>
			<td style="width:71px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis/graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resolutions Pro 4.0</td>
			<td style="width:71px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling FTIR spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase

Inzicht in de chemie van redox eiwitten eisen methoden waarmee nauwkeurige controle over redox centra binnen de proteïne. De techniek van eiwit film elektrochemie, die een eiwit op het oppervlak van een elektrode is geïmmobiliseerd, zodanig dat de elektrode fysiologische elektron donors of acceptanten vervangt, heeft verstrekt functionele inzicht in de redoxreacties van een aantal verschillende eiwitten. Volledige chemische inzicht vereist elektrochemische control worden gecombineerd met andere technieken die extra structurele en mechanistische inzicht kunnen toevoegen. Hier tonen we een techniek, eiwit film infrarood elektrochemie, die eiwit film elektrochemie met infrarood spectroscopische bemonstering van redox eiwitten combineert. De techniek maakt gebruik van een multiple-reflectie verzwakte totale reflectantie geometrie sonde een redox-eiwit geïmmobiliseerd op een hoge oppervlakte roet elektrode. Opneming van deze elektrode in een flow-cel kan pH van de oplossing of opgeloste concentraties worden gewijzigd tijdens de metingen. Dit is bijzonder krachtig bij de aanpak van Redoxenzymen, waar snelle katalytische omzet kan worden ondersteund en gecontroleerd op de elektrode spectroscopische waarnemingen van langlevende tussenliggende soorten in de katalytische mechanisme toe te staan. We laten zien dat de techniek met experimenten op E. coli hydrogenase 1 niet-omzet onder omzet (H2 oxidatie).

Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Hier beschrijven we een techniek, eiwit film infrarood elektrochemie, waarmee geïmmobiliseerdet redox eiwitten spectroscopically worden bestudeerd onder directe elektrochemische controle op een koolstof-elektrode. Infrarood spectra van een enkele eiwitSteekproef kunnen opgenomen worden op een scala van toegepaste potentieel en onder uiteenlopende omstandigheden van de oplossing.

Eiwit Film infrarood elektrochemie voor studie van H2 oxidatie aangetoond door een Hydrogenase [connectoren]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA en CLC: CLF-1-afhankelijke negatieve regulatie van CNTFRa zoals aangetoond door Western blotting, Remming van lysosomale enzymen en immunocytochemie

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriseren van individuele eiwit aggregaten door infrarood nano spectroscopie en Atoom kracht microscopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek