Name: protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

Die Arbeit des K.A.V. und P.A.A. wurde vom European Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), Engineering and Physical Sciences Research Council IB Catalyst Award EP/N013514/1, und Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research unterstützt. Rat (BB/L009722/1 und BB/N006321/1). R.h. wurde unterstützt vom Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, und Lincoln College, Oxford. Die Autoren erkennen Mr. Charlie Jones, Mr. Charlie Evans und Mitarbeiter der mechanischen Werkstatt (Chemie) für die Unterstützung bei der Entwicklung und Herstellung von Spectroelectrochemical Zellen, die in dieser Arbeit verwendet.

(1) neu die internen Probenraum ein FTIR-Spektrometer in einem anaeroben, trockenen Glovebox und allgemeine experimentelle Anforderungen
<ol><li>Verwenden Sie eine kommerzielle FTIR-Spektrometer mit externen Quecksilber Cadmium Tellurid (MCT) Detektor und ATR Zubehör ausgestattet. Löschen Sie den Körper des Spektrometers mit trockener Luft oder Distickstoff, oder verwenden Sie alternativ ein Spektrometer mit einer evakuierten optischen Bank.</li>
	<li>Legen Sie das Spektrometer auf eine stabile und vibrationsfreie Tisch auf der gleichen Höhe wie eine anaerobe (< 1 ppm O2), trocknen (Taupunkt <-75 ° C) Glovebox. Leiten Sie den IR-Strahl des Spektrometers in das Handschuhfach, durch ein IR-transparente Fenster, das groß genug für den defokussierten Strahl ist. Hinweis: Es ist wichtig, dass der Abstand zwischen dem Handschuhfach und Spektrometer ist auch gelöscht oder evakuiert, besonders wenn eine hygroskopische Fenstermaterial, z. B. NaCl oder KBr beispielsweise verwendet wird.</li>
	<li>
Replizieren Sie die internen Probenraum des Spektrometers in das Handschuhfach.
	<ol>
<li>Richten Sie den Strahl in das Handschuhfach auf einer einfallenden Ellipsoid Spiegel, idealerweise mit gleicher Brennweite als interne Fokussierung Spiegel des Spektrometers. Hinweis: Es ist nützlich, um zwei weitere Planspiegel vor dieser Fokussierung Spiegel platziert, um die Höhe und Richtung der IR-Strahl in das Handschuhfach angepasst werden können; gegenläufig wird jede Ungenauigkeit bei der anfänglichen Platzierung des Spektrometers.</li>
		<li>Legen Sie einen externe MCT-Detektor, komplett mit einem geeigneten mit Schwerpunkt Optik (z. B. eine kurze Brennweite ZnSe oder einfallenden Parabolspiegel mit einer kurzen Brennweite) innerhalb der Glovebox positioniert wie die Dimensionen der internen Stichprobe replizieren Fach des Spektrometers.</li>
		<li>Einstellen Sie "Schärfe" von den IR-Strahl zu ungefähr äquidistant zwischen der fokussierenden Spiegel und der MCT-Detektor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cool das Dewar von externen MCT-Detektor mit flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Montieren Sie das ATR-Zubehör in der Glovebox Probenraum. Richten Sie die ein- und Ausgabe mit Schwerpunkt Optik und ATR Accessoire für maximalen Durchsatz an den MCT-Detektor zu erreichen. Verwenden Sie ggf. eine Blende oder andere geeignete Dämpfung (z. B. dem Drahtnetz), Übersättigung des Detektorsignals zu verhindern. Hinweis: für die hier vorgestellten Daten, eine fünf-Reflexion ATR Accessoire mit allen reflektierende Optik und eine abnehmbare trapezförmige Si interne Reflexion Element (IRE) verwendet wird (Crystal GmbH, Maße ca 5 × 8 × 1 mm3, Gesicht Winkel 39,5 °). Das IRE wird in einem abnehmbaren Bodenplatte gefertigt aus Polyether-Ether-Keton (PEEK) montiert.</li>
	<li>Eine Glovebox verwenden, um die neu erstellte Probenraum mit geeigneten Durchführungen ermöglichen Anschluss an ein extern untergebracht Potentiostaten Haus (Gas Dichte BNC-Verbindungen eignen sich für diesen Zweck), Gas-Zugang und Kabel übertragen das Signal aus der MCT Detektor. Es ist wichtig, erhalten Abschirmung am Detektor Kabel einführen Rauschen oder Interferenzen mit den Messungen zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie eine Schlauchpumpe, in der Lage, Strömungsgeschwindigkeiten größer als 60 mL/min in das Handschuhfach. Eine schematische Darstellung des Spektrometers ist ATR Zubehör, peristaltische Pumpe und Potentiostaten Setup in Abbildung 1dargestellt.</li>
	<li>Eine Spectroelectrochemical Zelle, wie Sie schematisch in Abbildung 2, die auf der ATR Dichtungen Zubehör zu konstruieren. Die Zelle sollte eine hohe Oberfläche Gegenelektrode (Pt-Draht oder Gaze), einen Anschluss für die Arbeitselektrode (Kohlestab) und ein Miniatur-Referenzelektrode enthalten. Die Zelle sollte mindestens zwei weitere Ports als Einlass und Auslass für schnelle Strömung der Lösungen durch die Zelle enthalten. Hinweis: Eine Miniatur gesättigt Kalomel Bezugselektrode ist ideal für diesen Zweck. 36
</li>
</ol>2. Vorbereitung des Ruß-Partikel mit E. Coli Hydrogenase 1 geändert
<ol><li>In einer "nassen" anaerobe Glovebox mix 20 mg hohe Fläche Ruß Partikel (> 1.000 m3/g) mit 1 mL höchste Reinheit Wasser (Widerstand > 18 MΩ cm) in einem Microcentrifuge Schlauch. Die Partikel durch stromsparende Ultraschallbehandlung zu zerstreuen (< 100 W) für mindestens 15 Minuten, oder bis die Dispersion ist einheitlich und tut nicht Sediment innerhalb 1 h um eine Ruß-Dispersion mit einer Belastung von ca. 20 mg/mL zu geben.</li>
	<li>
Nehmen Sie eine Aliquote von E. Coli Hydrogenase 1 (Hyd1, etwa 50 µL, zubereitet nach einem veröffentlichten Verfahren55) in einer Konzentration von ~ 7 mg Protein/mL und tauschen Sie es in einen Puffer geringer Ionenstärke bei einem pH-Wert nahe dem isoelektrischen Punkt (bei Beispiel Kalium Phosphat, 15 mM, pH 5.8, kein zusätzliches Salz). Um beste Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie ein Enzympräparat, die so aktiv wie möglich ist. Führen Sie die Buffer Tausch durch Konzentration und Verdünnung in eine zentrifugale Filter-Gerät mit einer entsprechenden Molekulargewicht cutoff (50 kDa funktioniert gut für Hyd1).
	<ol>
<li>Fügen Sie die Hyd1 auf das Filter-Gerät.</li>
		<li>Mit rund 450 µL Austausch Puffer verdünnen.</li>
		<li>Aufkonzentrierung auf ein Volumen von 50 µL mit milden Zentrifugation (< ~ 2700 × g) irreversibel Niederschlag zu verhindern.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 und 2.2.3 bis Buffer Tausch (in der Regel innerhalb von ~ 5 Zyklen) abgeschlossen ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mischen Sie ein 5 µL Volumen von 20 mg/mL Ruß Dispersion (vorbereitet in 2.1) mit 50 µL Aliquot der Puffer ausgetauscht Hyd1. Bewahren Sie die Enzym-Partikel-Mischung im Kühlschrank auf (bei 0 ° C) über Nacht damit das Enzym zu adsorbieren kann. Es möglicherweise notwendig, schütteln Sie die Mischung gelegentlich, um sicherzustellen, dass die Partikel zerstreut bleiben.</li>
	<li>Waschen Sie die Hyd1 modifiziert Teilchen mit geringer Ionenstärke Puffer (Kalium-Phosphat, 15 mM, pH 5.8, kein zusätzliches Salz) von aufeinanderfolgenden Sedimentation und erneute Dispersion Zyklen in einem Microcentrifuge (~ 2.700 × g). Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 - 5 Mal, nicht adsorbiert Enzym zu entfernen. Hinweis: Vor der ersten Wäsche sollte der Überstand nahezu farblos, zeigt gute Adsorption des Enzyms sein.</li>
	<li>Konzentrieren sich die Partikel zu einem Endvolumen von ~ 5 µL, um eine endgültige Beladung von ~ 20 mg/mL der Enzym-modifizierte Teilchen geben. Hinweis: Die Hyd1-modifizierte Partikel können gespeichert werden bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen wenn sie hydratisiert bleiben; Dies geschieht am besten durch Speicherung von Teilchen mit ~ 50 µL höchste Reinheit Wasser verdünnt.</li>
</ol>3. Vorbereitung für PFIRE Messungen auf E. Coli Hydrogenase 1
<ol><li>Reinigen Sie das Si IRE Niedrigstrom-Beschallung (< 100 W), zunächst in H2SO4 (< 90 % w/w) für ca. 15 min, und dann in Druckaufschluss3 (70 % w/w) für bis zu 1 Stunde. Dieses Reinigungsverfahren sollte zu einer hydrophilen IRE Oberfläche führen. Wenn weitere Reinigung erforderlich ist kann der Zorn in Piranha Lösung gelegt werden (Verhältnis 1:3 H2O2: H2SO4) eventuell verbleibende organische Material zu oxidieren. Hinweis: Harten saure Reinigungsmethoden geeignet für den Einsatz mit allen IRE Materialien möglicherweise nicht. Piranha-Lösung ist stark ätzend und ein starkes Oxidationsmittel, Oberflächen sollten sauber sein, bevor Verwendung von Piranha-Lösung und Sorgfalt, während der Zubereitung getroffen werden und Verwendung von Piranha Lösung aufgrund der exothermen Prozess - immer hinzufügen H2O 2 langsam zu H2SO4 und beziehen sich auf die entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen für Vorbereitung, Nutzung und Entsorgung.</li>
	<li>Die saubere IRE in höchster Reinheit Wasser spülen und Trocknen unter einem Strom von trockenem Stickstoffgas. Alle Prism Umgang mit einer sauberen Pinzette zur Vermeidung von Kontaminationen führen.</li>
	<li>Versiegeln Sie den Zorn in der ATR Zubehör Grundplatte mit einem dünnen Streifen von Elektro-Silikon-Dichtstoff. Achten Sie darauf, um die Dichtmasse an den Rändern des IRE zu beschränken. Lassen Sie der Dichtstoff vollständig trocknen.</li>
	<li>Die ATR-Zubehör-Grundplatte auf das Spektrometer Handschuhfach übertragen und auf der ATR-Zubehör montieren. Maßnahme ein Referenzspektrum (Hintergrund) zwischen 4000-1.000 cm-1 4 cm-1 Auflösung, mit der standard Rapid scan Modus des Spektrometers und 1024 gemittelten Interferogrammen (Messung Zeit ~ 3-5 min). Nutzen Sie dieses Spektrum als Eingabe um Berechnung der Absorption Spektren später im Experiment zu ermöglichen. Hinweis: Aufgrund der kleinen Extinktion für Hyd1 aktiven Seite erwartet ist es notwendig, Spektren mit high-Signal zu Rausch-Verhältnis zu sammeln.</li>
	<li>Übertragen Sie die ATR Zubehör Bodenplatte auf der "nassen" Glovebox enthält die vorbereiteten Hyd1 veränderten Partikeldispersion (Abschnitt 2). Drop-Besetzung eine aliquote 1 µL der Partikeldispersion auf der großen Fläche des IRE, und verteilen sie gleichmäßig über die Oberfläche. Hinweis: Lassen Sie nicht die Partikel auf den Zorn völlig trocken werden.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Stück von Kohlepapier, z. B. als Gas-Diffusion-lagen-Material in Brennstoffzellen, um eine Größe ~0.1 mm kleiner als die Oberfläche Abmessungen des IRE (d.h. ca. 8,2 × 4,9 mm2). Die Fläche von der Kohlepapier sollte groß genug, um die Drop-Cast Hyd1 veränderten Partikel zu decken, aber nicht so groß, überschneiden sich die Silikon-Dichtstoff verwendet, um den Zorn zu sichern. Einweichen Sie das Kohlepapier in Wasser, und legen Sie sie vorsichtig über den oberen Teil der Partikel-Film. Das Kohlepapier bieten eine gute elektrische Verbindung über die ganze Partikel-Film. Hinweis: Es empfiehlt sich, mehrere Stücke von Kohlepapier im Voraus vorzubereiten, und sie eingeweicht in Wasser höchster Reinheit in der "nassen" anaerobe Glovebox speichern.</li>
	<li>Montieren Sie die Spectroelectrochemical Zelle (1.7 beschrieben und schematisch in Abbildung 2dargestellten) über den Zorn, in die Bodenplatte mit Schrauben sichern. Fügen Sie ~ 200 µL des experimentellen Puffers, das Enzym hydratisiert zu halten. Eine gemischte Puffersystem zur Pufferung über einen weiten pH-Bereich eignet sich für Studien über NiFe Hydrogenasen:56 Natriumacetat, 2-[N"-Morpholino] Ethan-Sulfo Säure (MES), N'-[2-Hydroxyethyl] Piperazin -N" -[2-Ethan-Sulfo Säure] (HEPES), N'-Tris [macht]-Methyl-3-amino-Propan-Sulfo-Säure (TAPS) und 2-[N'-Cyclohexylamino] Ethan-Sulfo Säure (CHES), mit jeder Komponente auf eine Endkonzentration von 15 mM und mit 0,1 M konzentrierte NaCl als unterstützende Elektrolyt, mit pH-Wert eingestellt mit pH 6 NaOH und HCl. Hinweis: Die funktionierende Elektrode Verbindung ragen sollten leicht unterhalb der Ebene der Spectroelectrochemical Zelle oben (~0.1 mm), gute elektronische Anbindung an das Kohlepapier (Abbildung 2) zu gewährleisten.</li>
	<li>Ein Flow-System mit peristaltischen Pumpe Schlauch und ein Fläschchen des Puffers experimentelle herstellen Sie Lösung zu- und Ablauf der Spectroelectrochemical Zelle. Übertragen Sie die montierte Zelle auf der "trockenen" Glovebox mit dem Spektrometer.</li>
	<li>Montieren Sie die Spectroelectrochemical Zelle Assembly auf die ATR-Zubehör. Schließen Sie die Arbeits-, Zähler und Referenzelektroden an dem Potentiostaten. Den peristaltischen Pumpe Schlauch an die Pumpe anschließen.</li>
	<li>Ein Absorptionsspektrum mit 1024 gemittelt Interferogrammen mit 4 cm-1 Auflösung über einem Spektralbereich von 4.000-1.000 cm-1aufnehmen, mit dem Spektrum als Referenz/Hintergrund in 3.4 gesammelt. An dieser Stelle sollte das Spektrum erhebliche enthalten (> 100 mO.D.) Amid II bands bei ~ 1.540 cm-1 und aktiven Bands der Hyd1 sollte in den Spektralbereich 1.850-2.150 cm-1, weitgehend in oxidiert, inaktive Staaten (Abbildung 3 ersichtlich ).</li>
</ol>(4) Aktivierung von E. Coli Hydrogenase 1 und Tests der Spectroelectrochemical Zelle
<ol><li>Hyd1-modifizierte Partikel Film eine Verringerung Potenzial (−0.8 V Vs SCE) zuweisen. Den experimentelle Puffer mit H2 und Flow Puffer langsam durch die Spectroelectrochemical-Zelle zu sättigen. Lassen Sie die Probe über Nacht voll die Hyd1 aktivieren. Hinweis: Es ist wichtig, anaerobe H2, N2 etc.und so alle anaeroben Gase verwenden sollte durch einen O-2 -Filter übergeben werden.</li>
	<li>Zeichnen Sie ein Absorptionsspektrum der Probe nach der Aktivierung. Die νCO und VCN Bands der aktiven Seite sollte nun eine Verteilung der reduzierten, "aktive" Staaten zeigen. Dies wird am einfachsten durch den Einsatz von ein Unterschied-Spektrum, bezogen auf das Spektrum verzeichneten 3.10 (Abbildung 4) beobachtet.</li>
	<li>Testen Sie die elektrische Verbindung der Spectroelectrochemical Zelle. Um dies zu tun, sättigen Sie die experimentelle Puffer mit N2 Gas. Anwenden einer Abfolge von oxidierenden (0 V Vs SCE) und (−0.8 V Vs SCE) Potenziale ( ca 30 min Dauer) auf der Hyd1-modifizierte Partikel-Film zu reduzieren, und zeichnen ein Absorptionsspektrum jeweils. Die Hyd1 rasch oxidiert und reduziert werden sollte, und wenn der Partikel-Film gut verbunden ist 100 % der Stichprobe sollte reagieren auf das angewandte Potenzial.</li>
	<li>Eine entsprechende Durchfluss des experimentellen Puffers gesetzt. Um dies zu tun, gelten Sie eine Verringerung Potenzial (−0.8 V Vs SCE) zur Probe, und sättigen Sie den experimentellen Puffer mit H2. Eine Reihe von zyklischen Voltammograms zwischen-0.707 Rekord - 0.039 V Vs SCE mit einer Scanrate von 10 mV/s erhöhen die Strömungsgeschwindigkeit des H2-gesättigten Puffer zwischen Voltammograms bis die katalytische Wellenform, die bei einer planaren rotierenden ähnelt CD-Elektrode55 und der maximale Strom ist unabhängig vom Durchfluss (Abbildung 5). Hinweis: Die Löslichkeitsgrenze von H2 in Wasser beträgt ~0.8 mM bei 293 K und 1 Bar.</li>
	<li>Da die Probe jetzt bereit für PFIRE Messungen, sammeln Sie Spektren in einem Bereich von Potentialen, unter einer Reihe von Lösungsbedingungen (pH-Wert, Temperatur, H2 Konzentration etc.). Notieren Sie alle elektrochemische Daten mit Hilfe der Potentiostaten Software, da es wichtig ist, spektroskopische und elektrochemische Daten korrelieren vor allem, wenn elektrokatalytische Prozesse wie H2 Oxidation durch Hyd1 studieren zu können.</li>
</ol>(5) spektroskopische Daten-Handling
<ol><li>Bestätigen Sie, dass die aktive Website nicht dauerhaft im Verlauf der Messungen geändert wurde durch die Aufnahme von Spektren bei 0 V und −0.8 V Vs SCE am Ende des Experiments. Diese sollte identisch mit den Spektren in 4.3 aufgezeichnet werden, und kein Verlust des aktiven Zentrums sollte während der Messung (Abbildung 6) beobachtet werden.</li>
	<li>Absolute Absorption Spektren aus der Spektrometer-Software in ein geeignetes Format exportieren (CSV, ASCII, "Matlab", Jcamp etc.) für die Bearbeitung mit einer Software wie Herkunft oder Matlab.</li>
	<li>
Grundlinie korrigieren Sie die Daten mithilfe des Prozesses in Abbildung 7dargestellt.
	<ol>
<li>Die zweite Ableitung der einzelnen Absorptionsspektrum im Bereich 1.800-2.150 cm-1, zu ergreifen, um kleine identifizieren (< 1 mO.D.) aktiven bands vor dem Hintergrund der stark gebogenen Wasser.</li>
		<li>Grundlinie Markierungspunkte auf der ursprünglichen Absorptionsspektrum und Sollwerte um das experimentelle Spektrum zu fangen.</li>
		<li>Passen Sie eine Grundlinie durch die Punkte mit einer interpolierten kubische Spline-Funktion oder eine Polynomfunktion. Subtrahieren Sie diese Basislinie Funktion aus den experimentellen Daten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

PFIRE ist ein breit anwendbar IR spektroskopischen Verfahren für den Umgang mit Redox-Elektrode immobilisierten Proteine. Insbesondere können elektrokatalytische Reaktionen der Redox-Enzyme schnell Umsatz Bedingungen sondiert werden. Die PFIRE-Methode baut auf der direkten elektrochemischen Kontrolle durch die Technik der PFE, die keine direkten strukturellen informiert, und IR-Spektroskopie an eine Kohlenstoffelektrode Paare zur Verfügung gestellt. Der PFIRE Ansatz so fügt chemische Einblick zu den verfügbaren Informationen von Elektrochemie allein und ist besonders geeignet um zu studieren in niedermolekularer Bindung und Aktivierung von Redox-Proteinen und Enzymen beteiligt. Darüber hinaus kann PFIRE über Potenzial-abhängige strukturelle Veränderungen in den Proteinen in der Abwesenheit von katalytischen Umsatz informieren. Solche nicht Umsatz Electron Transfer Ereignisse sind oft schwer zu erkennen, mit Standardanwendungen der PFE, obwohl die Ausweitung von PFE auf Fourier-transformierten AC Voltammetrie mit großem Erfolg. verwendet worden ist 45 , 46
Die PFIRE-Methode ist prinzipiell geeignet für die Untersuchung Redox-Protein, das mit PFE untersucht werden können. Daher wie bei PFE, ist Protein Adsorption ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche PFIRE-Experiment. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Anwendung der PFIRE-Technik mit E. Coli Hyd1 als eine Fallstudie. 36 , 43 jedoch haben wir auch die PFIRE Technik der zytoplasmatischen regulatorischen Hydrogenase von R. Eutropha,44 und Flavin Mononukleotid adsorbiert an Ruß angewendet. 40 in all diesen Fällen bietet einfache physikalische Adsorption, unverändert hohe Fläche Ruß (wie in diesem Protokoll beschrieben) eine Flächendeckung von Protein, das hoch genug, um gute Aufnahmequalität IR Spektren mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis ist. In Fällen, wo solche hohe Werte bei der Adsorption erreicht werden kann, kann es erforderlich sein, die Oberfläche der Kohlenstoffpartikel, zum Beispiel erlauben kovalente Bindung des Proteins an der Elektrodenoberfläche zu ändern sein. 60 , 61 , 62 die Verwendung einer Glovebox für PFIRE Messungen ist nur unbedingt erforderlich, bei der Untersuchung von Proben, die anaerob behandelt werden müssen. Aber in der Praxis sehr konstant und niedrig (< 80 ° C Taupunkt) Ebenen von Wasserdampf zur Verfügung gestellt von der Glovebox Atmosphäre geben Sie hohen Signal-Rausch-Ebenen, die die Gewinnung von sehr kleinen Absorptionswerte ermöglichen. 44 in vielen Fällen ist eine anaerobe Umgebung wie durch das Handschuhfach auch wünschenswert, dass die elektrochemische Messung (integraler Bestandteil der PFIRE-Technik) zur Vermeidung von aktuellen wegen O2 -Reduktion an der Arbeitselektrode.
IR Absorptionswerte durch Masse Wasser, experimentelle Puffer und die Kohlenstoffpartikel, auf denen die Probe adsorbiert, alle tragen wesentlich zu den experimentellen Spektren und Bands überschneiden könnten Interesse, vor allem in der Amid I, II und III Regionen der Spektrum. 63 die Amid-Region enthält auch Informationen von biologischen Arten wie Flavinen oder Nicotinamid Cofaktoren, sowie der Substrate und Produkte viele Reaktionen für Oxidation und Reduktion. Im Falle von NiFe Hydrogenasen νCO und νCN Bands der aktiven Seite fallen in einer relativ klaren Region des Spektrums und so die PFIRE-Technik eignet sich sehr gut auf das Studium dieser Enzyme. In anderen Fällen können Unterschied Spektren gepaart mit Isotopen Kennzeichnung Ansätze mussten jedoch werden Änderungen durch das immobilisierte Protein zu isolieren. Ähnliche Ansätze haben zu identifizieren, z. B. Protonierung Änderungen, strukturelle Umstellungen und Michaelis-Menten-komplexe mit IR-Spektroskopie zu studieren. 64 , 65 , 66 PFIRE, daher beschränkt sich auf das Studium der Hydrogenasen jedoch nicht auf jede Redox-Protein enthält (oder deren Substrate, Produkte oder Inhibitoren enthalten) angewendet werden können Gruppen mit diagnostischen IR-aktive Vibrationen; Kohlenmonoxid-Dehydrogeanses, Nitrogenases67 ,68,14 Flavoproteine,40 und Formiat Dehydrogenases, zum Beispiel.
Die damit verbundene Technik, SEIRA, eignet sich sehr gut für die Untersuchung von membranassoziierten Proteine in einer biomimetischen Umgebung. 32 SEIRA ist eine Adaption der IR-Spektroskopie, die auch eine ATR-IR-Konfiguration verwendet und nutzt eine Oberfläche Enhancement-Effekt, der die IR-Absorption von Molekülen liegt nahe (wenige nm) verstärkt die Oberfläche des Prismas ATR (IRE). SEIRA ist daher vorzüglich empfindlich auf spektrale Veränderungen, die auftreten innerhalb der adsorbierten Protein und Membran-Architektur und ist relativ frei von konkurrierenden Signale von Lösungsmittel und Substrate/Inhibitoren in Lösung. Dies ist etwas anders als die hier beschriebene PFIRE Technik stützt sich auf eine deutlich größere Eindringtiefe über der Oberfläche des IRE (~ 1 µm), was bedeutet, dass PFIRE empfindlicher auf Substrate, Produkte oder Inhibitoren in Lösung präsentieren. Diese erhöhte Empfindlichkeit gegenüber "Massen" Lösungsmittel kann von Vorteil sein; Wenn das Substrat oder das Produkt direkt von IR beobachtet werden kann, Berichten beide Steady-State-Kinetik der langlebigen aktiven Spezies und damit verbundenen Produktbildung während Electrocatalysis PFIRE Spektren. 69 die Möglichkeit zu beobachten, Steady-State-Konzentration von Substrat und Produkt werden besonders wertvoll für Enzyme wie Kohlenmonoxid-Dehydrogenase (die katalysiert die reversible Oxidation von CO, CO2, eine starke IR-Absorber) oder Formiat-Dehydrogenase (die katalysiert die reversible Oxidation von Formiat CO2).
PFIRE beschränkt sich derzeit auf stationären kinetische Untersuchungen des Enzyms Electrocatalysis aufgrund der makroskopischen Kohleelektroden verwendet, um "das Enzym auf die Oberfläche ein IRE für Datenerhebung und ATR-IR Geometrie konzentrieren". In dieser Hinsicht sind PFIRE Studien der NiFe-Hydrogenasen ergänzen die Arbeit der Dyer und Mitarbeiter,49,50 , die mit Licht ausgelöste vorübergehende Aufnahme IR-Spektroskopie um Sub Umsatz Kinetik zu studieren. Die Spectroelectrochemical Zelle,40 Miniaturisierung wird gearbeitet und mit dem Einsatz von Mikroelektroden zeitliche Auflösung in der Größenordnung von Mikrosekunden erreichbar sein sollte. Dies ermöglicht Studium der Sub-Umsatz Kinetik für Enzyme mit Umsatz-Frequenzen bis zu ca 100-500 s-1und das Studium der reduktiven und oxidative Prozesse ermöglichen.
Insgesamt ist PFIRE eine spektroskopische Technik, die chemische Charakterisierung elektrokatalytische Reaktionen der Redox-Enzyme unter Steady-State-Bedingungen ermöglicht. Der PFIRE Ansatz ermöglicht mehrere chemische und elektrochemische Titrationen derselben Enzym-Probe durchgeführt werden, da die große Oberfläche Elektroden verwendet, eine robuste Adsorption von Protein bieten und die ATR-IR-Geometrie einfache Lösung Austausch ermöglicht. Die Fähigkeit, solche Strukturinformationen in Situ während Enzymfunktion sammeln ist ein unschätzbares Werkzeug für die Bioelectrochemistry Gemeinschaft.

Eine zentrale Herausforderung in der Studie der Proteinfunktion umfasst die Entwicklung von in Situ -Methoden, die es ermöglichen, dass die direkte Beobachtung von Proteinen, die Durchführung ihrer physiologischen Rollen, entweder in Vivo oder Proteinproben isoliert. Dies erfordert die Integration von Steuerung oder in experimentellen Verfahren und Einsatz von kombinierten Techniken, mit denen sowohl die Reaktivität zu prüfenden Prozesse auslösen und chemischen Einzelschritten während Proteinfunktion gleichzeitig gemessen werden. Bei Redox-Proteinen entspricht dies oft Kombination elektrochemische Techniken, die präzise Kontrolle der angewandten Potenzial aber bieten keine direkte chemische Informationen mit spektroskopischen Techniken, die empfindlich auf chemisch-spezifische Veränderungen im Zusammenhang mit Proteinfunktion. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry ist ein allgemeiner Begriff für eine Reihe von gekoppelten elektrochemische und spektroskopische Methoden, die eine Vielzahl von spektroskopischen Techniken und elektrochemische Steuerungsebenen umfassen. Viele Proteine können Elektronen mit künstlichen, lösliches Elektron Spender und Akzeptoren austauschen und dies wurde in Studien die kleine Moleküle zu verwenden, um Elektronentransfer, einschließlich Kupplung mit UV-VIS,4,5 vermitteln ausgeschöpft , 6 , 7 magnetische kreisförmigen Dichroismus8 und Infrarot-5,9,10,11,12,13,14 (IR) Spectroscopies. In einer begrenzten Anzahl von Fällen erwies es sich möglich, unmittelbare, Diffusion-kontrollierte Elektron Austausch zwischen Proteinen und Elektroden zu nutzen. 15 , 16
Für katalytische Reaktionen durchgeführt durch Redox Enzyme, Elektrochemie Lösungsansätze vorhanden einen klaren Nachteil. Diffusion-gesteuerte Elektron Übertragung über Redox Mediatoren in Lösung ist wahrscheinlich zu Bandbreitenbegrenzung. Kinetische und mechanistische Informationen über das Enzym kann verloren gehen, oder zumindest schwer zu deconvolute von Diffusion Artefakte aus der experimentellen Methode geworden. Direkte, unmittelbare elektrochemische Kontrolle ist daher ein wichtiges Instrument für die Untersuchung von Redox-Proteinen und Enzymen. Die Technik des Proteins Film Elektrochemie (PFE) beschäftigt Redox-Elektrode immobilisierten Proteine, in einer Weise, dass Elektronen direkt an oder aus der Redox-Cofaktoren in das Protein übertragen werden, da die Elektrode an einer Reihe von Potentialen polarisiert ist. 17 , 18 , 19 PFE ist von besonderem Wert für die Erforschung der Oxidation oder Reduktion Reaktionen katalysiert durch Redox-Enzyme, wie Grenzflächen Elektronentransfer mit einer sehr hohen Geschwindigkeit erreicht werden kann. Beispielsweise wurde die elektrokatalytische Fluktuationsrate von Nickel-Eisen ([NiFe]) Hydrogenase aus Allochromatium Vinosum ca 1.000-10.000 s−1 für H2 Oxidation von PFE gemessen. 20 mögliche Elektrode wirkt als Auslöser, Katalyse "on" oder "aus" und die elektrokatalytische aktuelle Berichte über die Enzymaktivität zu machen. PFE ist daher eine wertvolle Methode zur Analyse der Reaktivität von komplexen Enzymen, die innig, Potenzial, wie Reaktionen der di-Eisen aktiven Seite des [FeFe abhängen]-Hydrogenasen mit CO und O2,21 oder Potenzial-induzierte Inaktivierung Reaktionen der Hydrogenasen, Kohlenmonoxid-Dehydrogenase22 ,23 und andere komplexe Redox-Enzyme. 24
Das wichtigste Hindernis für Kombination von spektroskopischen Techniken mit der elektrochemischen Direktsteuerung gewährten PFE ergibt sich aus der niedrigen Flächendeckung der Redox-Enzyme in der Größenordnung von 1-2 Pmol cm-2 für die [NiFe] Hydrogenase von A. Vinosum, 20 im Vergleich zu in Situ Oberflächenforschung Studien von niedermolekularer Adsorbate auf Masse Metall-Elektroden. Dies stellt eine Herausforderung für die Empfindlichkeit der spektroskopischen Messung. Verschiedene Spectroelectrochemical Methoden gemeldet wurden für die Untersuchung immobilisiert Redox-Proteine auf eine Reihe von verschiedenen Elektroden: UV-VIS Spektroskopie an transparenten Metalloxid Elektroden; 25 , 26 , 27 -Fluoreszenz-Spektroskopie bei gold-Elektroden; 28 , 29 -Oberfläche verbessert Infrarotabsorption (SEIRA) Spektroskopie an gold-Elektroden; 30 , 31 , 32 , 33 und Oberfläche enhanced Raman spektroskopische Techniken, vor allem an Silber-Elektroden. 34 , 35
Hier beschreiben wir eine Methode zur Kupplung PFE mit IR-Spektroskopie, in einer Technik bekannt als Protein Film Infrarot-Elektrochemie (PFIRE). 36 die PFIRE Methode studiert Redox-Enzyme, die auf eine große Oberfläche Kohlenstoff Arbeitselektrode in Verbindung mit einer abgeschwächten totale Reflexion IR (ATR-IR) Geometrie, nutzen die Leichtigkeit der Adsorption von eine Reihe von Proteinen auf Carbon-Oberflächen immobilisiert. IR-Spektroskopie ist nützlich in Studien von Redox-Enzymen und Proteinen wie viele kleine Moleküle, Liganden und Cofaktoren diagnostische Absorptionswerte, die zur Reaktivität, Bindung, Hemmung und Redox-Zustand Beurteilung herangezogen werden können. Beispiele hierfür sind die Bindung von NO zu Eisen-Schwefel-Zentren,37 Studie der Flavoproteine,38,39,40 kleines Molekül binden an Häm-Zentren etc.. 41 die ATR-IR-Geometrie ermöglicht eine optimierte 3-Elektrode (Spectro) elektrochemische Zelle42 und bietet somit hervorragenden elektrochemischen Kontrolle. Lösung Widerstand und mögliche Drift werden minimiert, indem man eine Referenzelektrode nah an der Arbeitselektrode. Große Oberfläche Zähler Elektroden dienen, die kompatibel mit hohe elektrokatalytische Strömungen durch schnelle Enzym Umsatz an der Arbeitselektrode produziert sind. Lösung durch die Spectroelectrochemical-Zelle ermöglicht einfache Kontrolle über die Konzentration der Substrate, Inhibitoren und pH. 36 , 43 , 44 die PFIRE Methode ermöglicht somit IR Spektren, aufgezeichnete in Situ während nachhaltige Enzym Electrocatalysis zu sein. 36 , 44 PFIRE ist auch in der Lage, chemische Informationen in Ermangelung von katalytischen aktuell43 im Gegensatz zu PFE wo es Informationsextraktion aus nicht-katalytischen Prozessen in Redox Enzyme schwierig sein kann. 45 , 46
Wir haben die PFIRE-Methode für die Studie der elektrokatalytische H2 Oxidation von [NiFe]-Hydrogenasen, bewiesen die intrinsische CO und CN Liganden koordiniert nach Fe an einem Bimetall aktiv-Standort enthalten. 36 , 43 , 44 [NiFe]-Hydrogenasen eignen sich deshalb besonders gut, um PFIRE zu studieren. Die PFIRE-Methode liefert Informationen über die Arten, die bei stationären Umsatzes anwesend sind, und somit entscheidende mechanistischen Erkenntnis neben der Fülle von Literatur auf IR-Spektroskopie der Hydrogenasen ohne experimentelle Kontrolle Umsatz. 47 , 48 Dyer und Mitarbeiter haben Beschäftigte zeitaufgelösten IR Methoden der NiFe Hydrogenasen,49,50,51 mit einen leichten Trigger entweder einen kleinen negativen möglichen Schritt (über Gebrauch anwenden zu studieren der Lösung Mediatoren und ein "Käfig" Elektronenquelle) oder Photolyse gebundene Hydrid. Obwohl die PFIRE-Methode derzeit Zeitauflösung entsprechen diese Messungen40 zur Verfügung stellen kann, es ermöglichen Studium der reduktiven und oxidative katalytischen Prozessen, Zugriff auf eine Reihe von klar definierten Potentiale und frei von Stofftransport Einschränkungen.
Die PFIRE-Methode unterscheidet sich von SEIRA Studien von Redox-Proteine, die auch eine ATR-IR-Geometrie und beschäftigen eine nanoskalige aufgeraut Metallelektroden, die IR-Absorption der Moleküle adsorbiert an der Elektrodenoberfläche zu verbessern. 30 SEIRA ist eine äußerst wertvolle Technik zur Untersuchung der Membranproteine, insbesondere auf adsorbiert oder in mimetischen Membran Architekturen,32 aber das Bedürfnis nach einem Metall-Elektrode kann begrenzen Substrat und Inhibitor durch Reaktivität der Elektrode Unterstützung gegenüber kleinen Molekülen wie CO, CN–, CO2 etc. Proton-Reduktion und selbst-zusammengebauten monomolekularen Film Desorption auf Metalloberflächen bei sehr negativen Potentiale problematisch sein können, wurde1,52 obwohl Enzym Electrocatalysis auf ungeschützten-Elektroden Metall berichtet. 53 , 54 ein Nachteil des PFIRE relativ SEIRA ist die relative Schwierigkeit der Einbeziehung von Membranproteinen in native oder mimetischen Membran-Architekturen. Allerdings macht die relative chemische Inertheit der Kohleelektroden zu konkurrierenden niedermolekularer Aktivierung Reaktionen PFIRE eine hervorragende Technik für das Enzym Electrocatalysis, besonders im Bereich Low-Potential für biologische Redox Studium Prozesse wie Proton Reduktion von Hydrogenasen. 1 , 43
Das Ziel dieses Artikels ist, die PFIRE-Methode als eine Technik zur Untersuchung Redox-Elektrode immobilisierten Proteine, mit NiFe Hydrogenase 1 (Hyd1) von Escherichia coli als Vorbild einzuführen. Überlegungen der Probenvorbereitung, die Voraussetzung für gutes Substrat Fluss und Datenverarbeitung werden diskutiert. PFIRE ist eine allgemein anwendbare Technik, gut geeignet für Studium Redox-Protein (mit charakteristischen IR Absorptionswerte), das auf Kohleelektroden, entweder direkt adsorbiert werden kann oder mit Oberflächenmodifizierung, so dass es Elektronen mit austauschen kann die Elektrode.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">680-IR</td>
			<td style="width:167px;">with an external MCT detector</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ATR accessory</td>
			<td style="width:71px;">Pike Technologies</td>
			<td style="width:119px;">GladiATR</td>
			<td>Customised for use with a 5-reflection Si IRE</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glovebox</td>
			<td style="width:71px;">Glove Box Technology Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Custom designed &#39;wet&#39; and &#39;dry&#39; box for anaerobic sample handling and measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KBr window</td>
			<td style="width:71px;">Crystran</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Additional optics</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Components from a PM-IRRAS accessory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Silicon IRE</td>
			<td style="width:71px;">Crystal GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potentiostat</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;">Autolab PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nova 10.1</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling the potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:71px;">Williamson Manufacturing Company Ltd</td>
			<td>QL-1000-024-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pt wire</td>
			<td style="width:71px;">Surepure Chemetals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272</td>
			<td>99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon rod</td>
			<td style="width:71px;">WH Smith</td>
			<td align="right">30729209</td>
			<td>0.7 mm HB pencil lead</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbon black</td>
			<td style="width:71px;">Cabot Corporation</td>
			<td style="width:119px;">Black Pearls 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrasonic bath</td>
			<td style="width:71px;">Ultrawave</td>
			<td style="width:119px;">U100</td>
			<td>35 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC5050BK</td>
			<td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5452000018</td>
			<td>MiniSpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/9240/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HNO3</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">N/2300/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">silicone sealant</td>
			<td style="width:71px;">Cow Corning Toray Co., Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">SE 4486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon paper</td>
			<td style="width:71px;">Toray</td>
			<td style="width:119px;">TGP-H-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro 2015</td>
			<td style="width:71px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis/graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resolutions Pro 4.0</td>
			<td style="width:71px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling FTIR spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase

Verständnis der Chemie der Redox Proteine Anforderungen Methoden, die präzise Kontrolle über Redox-Zentren innerhalb des Proteins. Die Technik des Proteins Film Elektrochemie, in denen ein Protein auf eine Elektrodenoberfläche immobilisiert ist, so dass die Elektrode physiologischen Elektron Spender oder Akzeptoren, ersetzt hat funktionelle Einblick in die Redox-Reaktionen einer Reihe von unterschiedlichen zur Verfügung gestellt. Proteine. Vollständige chemische Verständnis erfordert eine elektrochemische Steuerung mit anderen Techniken kombiniert werden, die zusätzliche strukturelle und mechanistische Einblicke hinzufügen können. Hier zeigen wir eine Technik, die Protein Film Infrarot-Elektrochemie, das Protein Film Elektrochemie mit Infrarot-Spektroskopie Probenahme von Redox-Proteinen verbindet. Die Technik nutzt eine abgeschwächte totale Reflexion Multiple-Reflexion-Geometrie, ein Redox-Protein immobilisiert auf eine große Oberfläche Ruß Elektrode Sonde. Einbeziehung dieser Elektrode in einer Durchflusszelle ermöglicht Lösung pH oder gelöste Konzentrationen während der Messung verändert werden. Dies ist besonders leistungsfähig bei der Bewältigung Redox Enzyme, wo schnelle katalytischen Umsatz nachhaltig und an der Elektrode so dass spektroskopischen Beobachtung von langlebigen zwischen-Arten in der katalytischen Mechanismus gesteuert werden kann. Wir zeigen die Technik mit Experimenten auf E. Coli Hydrogenase 1 Umsatz (H2 Oxidation) und nicht-Umsatz-Bedingungen.

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Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Hier beschreiben wir eine Technik, die Protein Film Infrarot-Elektrochemie, wodurch immobilisiert Redox Proteine unter direkter elektrochemischer Kontrolle eine Kohlenstoffelektrode spektroskopisch untersucht werden. Infrarot-Spektren einer einzigen Proteins Probe können eine Reihe von angewandten Potenziale und unter einer Vielzahl von Lösungsbedingungen aufgezeichnet werden.

Protein Film Infrarot-Elektrochemie für Studie der H2 Oxidation durch ein [NiFe] Hydrogenase unter Beweis gestellt

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Forschung

Biochemie

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA und CLC: CLF-1-abhängige Herunterregulieren von CNTFR &amp; agr; als Demonstriert durch Western Blotting, Hemmung der lysosomale Enzyme und Immunzytochemie

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...