Name: protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

העבודה של K.A.V. ו P.A.A. נתמכה על ידי המועצה האירופית למחקר (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), פרס הנדסה, מדעים פיסיקליים מחקר המועצה ליברות זרז EP/N013514/1, וביוטכנולוגיה ו ביולוגי מחקר מדעי המועצה (BB/L009722/1 ו- BB/N006321/1). ר. ה נתמכה על ידי Ministerio דה Ciencia y Tecnologìa, למד דה קוסטה ריקה, לינקולן קולג, אוקספורד. המחברים להכיר מר צ'ארלי ג'ונס, מר צ'ארלי אוונס והצוות של הסדנה מכני (המחלקה לכימיה) לקבלת סיוע בעיצוב וייצור של תאים spectroelectrochemical נעשה שימוש בעבודה זו.

1. מסעדה ובר תא הדגימה פנימי של ספקטרומטר FTIR בתוך הכפפות אנאירובית, יבש ודרישות ניסיוני כללי
<ol><li>השתמש ספקטרומטר FTIR מסחריים המצוידים עם חיצוני כספית קדמיום טלוריד (MCT) גלאי, אביזר ATR. גוף ספקטרומטר עם אוויר יבש או dinitrogen, או לחלופין להשתמש ספקטרומטר עם ספסל אופטי פונו.</li>
	<li>למקם את ספקטרומטר על גבי שולחן יציב, ללא רטט באותו גובה כמו אנאירובית (< ppm 1 או2), יבשה, הכפפות (נקודת הטל <-75 ° C). להסיט את קרן IR ספקטרומטר לתוך בתא הכפפות, דרך חלון שקוף IR גדול מספיק כדי להכיל את קרן defocused. הערה: חשוב כי הרווח בין הכפפות ספקטרומטר גם לצמיתות או פונו, במיוחד אם חומר היגרוסקופי חלון, כגון NaCl או KBr לדוגמה, משמש.</li>
	<li>
שכפל תא הדגימה פנימי של ספקטרומטר בתוך בתא הכפפות.
	<ol>
<li>כוונו את הקרן בתוך הכפפות אל ראי אליפסואידי מהציר, באופן אידיאלי עם אורך מוקד זהה במראה התמקדות פנימי של ספקטרומטר. הערה: זה שימושי שיש שתי מראות המטוס נוספים הממוקמים לפני הראי התמקדות הזה, על מנת לאפשר את הגובה וגם את הכיוון של קרן IR יותאם בתוך הכפפות; זה יהיה לקזז כל דיוקים להצבת הראשונית ספקטרומטר.</li>
		<li>המקום של גלאי חיצוני MCT, להשלים עם מתאים מיקוד הראייה (כגון אורך מוקד קצר ZnSe העדשה, או מראה פרבולית מהציר, עם אורך מוקד קצר) בתוך הכפפות ממוצבת כגון כדי לשכפל את הממדים של המדגם פנימי תא המטען של ספקטרומטר.</li>
		<li>להתאים את המוקד' ' של קרן IR להיות כ קו מקביל בין המראה התמקדות והגלאי MCT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מגניב של דיואר של הגלאי MCT חיצוני עם חנקן נוזלי.</li>
	<li>הר האביזר ATR לתוך תא הכפפות הדגימה. יישר את הקלט והפלט התמקדות אופטיקה וסיוע ATR כדי להשיג תפוקה מקסימלית כדי הגלאי MCT. אם יש צורך, להשתמש צמצם או אחרים הנחתה מתאימים (כגון רשת תיל) כדי למנוע oversaturation של האות גלאי. הערה: עבור הנתונים המובאים כאן, אביזר ATR חמש-השתקפות ועם כל אופטיקה רעיוני של Si הבסיסי נשלף רכיב השתקפות פנימית (חמתו) משמש (קריסטל GmbH, מידות ca 5 × 8 × 1 מ3, זווית פניה 39.5 מעלות). חמתו נטענה baseplate נשלף במכונה של פוליאטר אתר קטון (פיק).</li>
	<li>להשתמש עם הכפפות כדי לשכן תא הדגימה המשוחזר עם feedthroughs מתאימה כדי לאפשר חיבור potentiostat שוכן מבחוץ (חיבורי BNC חזק גז שימושיים למטרה זו), גישה לאינטרנט גז, כבל (י) כדי להעביר את האות MCT גלאי. חשוב לשמור על כל סיכוך הכבל גלאי כדי להימנע מציגה רעש או הפרעה למידותיו.</li>
	<li>המקום משאבה סחרור, מסוגל זרימה המחירים גדול מ 60 mL/min בתוך בתא הכפפות. נוף סכמטי של ספקטרומטר, ATR אביזר, סחרור משאבת, potentiostat ההתקנה מוצג באיור1.</li>
	<li>לבנות תא spectroelectrochemical, כמו זה המוצג סכמטי איור 2, כי החותמות על ATR אביזר. התא צריך להכיל שטח גבוהה מונה אלקטרודה (Pt תיל או גזה), חיבור האלקטרודה עבודה (מוט פחמן), אלקטרודה הפניה של מיניאטורי. התא צריך להכיל לפחות שתי יציאות נוספות כמו כניסת ו עודפים לזרימה מהירה של פתרונות דרך התא. הערה: אלקטרודה הפניה calomel רווי מיניאטורי אידיאלי למטרה זו. 36
</li>
</ol>2. הכנת חלקיקי פחמן שחור שופרת e. coli Hydrogenase 1
<ol><li>בהכפפות אנאירובית, 'רטוב' לערבב 20 מ ג של שטח גבוהה חלקיקי פחמן שחור (> 1,000 m3/g) עם מים טוהר על קוליים 1 מ"ל (resistivity > 18 ס מ MΩ) צינור microcentrifuge. לפזר חלקיקי מאת sonication צריכת חשמל נמוכה (< 100 W) לפחות 15 דקות, או עד הפיזור אחיד ועושה את המשקע לא בתוך 1 h, לתת פיזור פחמן שחור עם טעינה של 20 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>
קח aliquot של e. coli hydrogenase 1 (Hyd1, כ- 50 µL, המוכנים לפי הייתה הליך שפורסמו55)-ריכוז חלבון ~ 7 מ"ג/מ"ל, להחליף אותו לתוך מאגר כוח יונית נמוך ב- pH קרוב נקודה איזואלקטרית (עבור דוגמה אשלגן פוספט, 15 מ מ, pH 5.8, בלי. מלח נוספים). כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, השתמש הכנה של אנזים זה פעיל ככל האפשר. לבצע את ההחלפה מאגר על ידי ריכוז דילול, התקן צנטריפוגלי מסנן עם משקל מולקולרי המתאים חיתוך (50 kDa זו פועלת היטב עבור Hyd1).
	<ol>
<li>להוסיף Hyd1 את המכשיר מסנן.</li>
		<li>לדלל עם µL בערך 450 מאגר exchange.</li>
		<li>Reconcentrate לאמצעי אחסון של 50 µL באמצעות צנטריפוגה מתון (< ~ 2700 × g) למניעת משקעים בלתי הפיך.</li>
		<li>חזור על שלבים 2.2.2, 2.2.3 עד מאגר exchange תושלם (בדרך כלל תוך ~ 5 מחזורים).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מערבבים נפח 5 µL של 20 מ"ג/מ"ל פחמן שחור הפיזור (להכין ב 2.1) עם aliquot 50 µL של חילופי-מאגר Hyd1. לאחסן את תערובת אנזימים-חלקיקים מקרר (ב-0 מעלות צלזיוס) למשך הלילה כדי לאפשר את האנזים לספוח. יתכן צורך לנער את התערובת מידי פעם כדי להבטיח שהחלקיקים יישארו התפזרו.</li>
	<li>לשטוף את החלקיקים Hyd1-השתנה עם מאגר כוח יונית נמוך (אשלגן פוספט, 15 מ מ, pH 5.8, בלי. מלח נוספים) על ידי מחזורים רצופים שיקוע, פיזור מחדש ב microcentrifuge (~ 2700 × g). חזור על תהליך זה 3 - 5 פעמים כדי להסיר את האנזים הספוחה. הערה: על לפני כביסה ראשונה תגובת שיקוע צריך להיות כמעט נטול צבע, המציין ספיחה טובה של האנזים.</li>
	<li>רכז החלקיקים לאמצעי הסופי של µL ~ 5, לתת טעינה הסופי של ~ 20 מ"ג/מ"ל של חלקיקים אנזים-השתנה. הערה: החלקיקים Hyd1-לאחרונה ניתן לאחסן ב 4 ° C עד שבועיים אם הם נשארים hydrated; זו מושגת בצורה הטובה ביותר על-ידי אחסון חלקיקים מדולל עם ~ 50 µL של מים טוהר על קוליים.</li>
</ol>3. הכנה המידות PFIRE e. coli Hydrogenase 1
<ol><li>לנקות את חמתו סי על ידי מאפיק נמוך sonication (< 100 W), תחילה ב H2אז4 (< 90% w/w) ~ 15 דקות ולאחר מכן עב ס3 (70% w/w) עבור עד 1 משאבי אנוש. הליך ניקוי זה אמור להוביל חמתו הידרופילי. אם נדרש ניקוי נוסף ניתן להציב את חמתו בפתרון פיראניה (יחס של 1:3 של2O H2: H2אז4) להתחמצן כל חומר אורגני הנותרים. הערה: ייתכן קשים שיטות ניקוי חומצי לא להיות מתאים לשימוש עם כל החומרים חמתו. פתרון פיראניה קורוזיבית מאוד, חמצון חזקים, משטחים צריך להיות נקיות למדי לפני השימוש פיראניה פתרון וטיפול יש לנקוט במהלך ההכנה ולהוסיף שימוש בפתרון פיראניה בשל אופיו אקסותרמית של התהליך - תמיד H2O 2 לאט לאט H2אז4 ולהפנות נוהלי הבטיחות המתאים עבור הכנה, השימוש, סילוק.</li>
	<li>שוטפים את חמתו נקי במים טוהר על קוליים, ומייבשים תחת זרם של גז חנקן יבש. לבצע כל טיפול פריזמה באמצעות פינצטה נקי כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>חותם את חמתו לתוך baseplate אביזר ATR באמצעות רצועה דקה של איטום סיליקון חשמל-כיתה. לטפל כדי להגביל את חומר האיטום על הקצוות של חמתו. לאפשר את חומר האיטום לייבוש מלא.</li>
	<li>להעביר את baseplate אביזר ATR בתא הכפפות ספקטרומטר והר זה אל האביזר ATR. מדד קשת הפניה (רקע) בין 4000-1, 000 ס מ-1 4 ס מ-1 רזולוציה, באמצעות תקן מהירה לסרוק במצב של ספקטרומטר 1024 interferograms בממוצע (מדידה time ~ 3-5 דקות). השתמש הספקטרום הזה כקלט כדי לאפשר חישוב של ספיגת ספקטרה בהמשך הניסוי. הערה: עקב ספיגת קטן הצפוי עבור האתר הפעיל Hyd1 יש צורך לאסוף ספקטרה קליטה גבוהה יחסי הרעש.</li>
	<li>להעביר את baseplate אביזר ATR בתא הכפפות "רטוב" אשר מכיל את פיזור חלקיקים Hyd1-השתנה מוכן מראש (סעיף 2). ירידה-שחקנים aliquot 1 µL של פיזור חלקיקים על הפנים גדול של חמתו, ולהפיץ את אותם באופן שווה על פני השטח. הערה: אל תאפשר את החלקיקים להיות יבש לחלוטין על חמתו.</li>
	<li>חותכים פיסת נייר פחם, כגון בשימוש כחומר דלק דיפוזיה שכבה בתאי דלק גודל ~0.1 מ מ קטן יותר מידות משטח חמתו (קרי ca. 8.2 × 4.9 מ מ2). פני השטח של הנייר פחמן צריך להיות גדול מספיק כדי לכסות את החלקיקים Hyd1-השתנה טיפה-שחקנים, אבל לא כל כך גדולים עד חופפים איטום סיליקון נהגו לאבטח את חמתו. משרים את הנייר פחמן במים, הנח אותו בעדינות מעל הסרט חלקיקים. הנייר פחמן תספק חשמל חיבור טוב לאורך הסרט כל חלקיק. הערה: מומלץ להכין מראש מספר פיסות נייר פחם, ולאחסן אותם מראש ספוגה במים טוהר על קוליים בתוך הכפפות אנאירובית 'רטוב'.</li>
	<li>הר spectroelectrochemical התא (המתוארים 1.7 סכמטי באיור 2) מעל חמתו, לאבטח אותו לתוך baseplate עם ברגים. להוסיף ~ 200 µL של המאגר ניסיוני לשמור את האנזים להתייבש. מערכת מאגר מעורב, יכולת אגירת מעל טווח pH רחב, שימושית עבור מחקרים על ניפה hydrogenases:56 סודיום אצטט, 2-[N'-מורפולינו] אתאן-sulfonic חומצה (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazine -N' -[חומצה 2-אתאן-sulfonic] (HEPES), N'-טריס [hydroxymethyl] חומצה מתיל-3-אמינו-פרופאן-sulfonic (ברזים), ו 2-[N'-cyclohexylamino] אתאן-sulfonic חומצה (צ'ז), עם כל רכיב בריכוז סופי של 15 מ מ, המכיל 0.1 M NaCl תמיכה אלקטרוליט, עם pH להתאים ל- pH 6 שימוש מרוכז NaOH ו- HCl. הערה: החיבור אלקטרודה עבודה צריך לבלוט מעט מתחת למישור העליון תא spectroelectrochemical (~0.1 מ"מ) כדי להבטיח חיבור אלקטרונית טובה על הנייר פחמן (איור 2).</li>
	<li>לחבר את כניסת פתרון ו עודפים של התא spectroelectrochemical מערכת זרימת המכילה צינור משאבת סחרור, בקבוקון של המאגר ניסיוני. להעביר את התא התאספו בתא הכפפות 'יבש' המכיל את ספקטרומטר.</li>
	<li>טעינת ההרכבה תא spectroelectrochemical אל האביזר ATR. להתחבר potentiostat העבודה, מונה ואלקטרודות הפניה. להתחבר לאורך צינור משאבת סחרור המשאבה.</li>
	<li>להקליט על הספקטרום ספיגת עם 1024 בממוצע interferograms ברזולוציה-1 4 ס מ מעל מגוון ספקטרלי של 4,000-1, 000 ס מ-1, באמצעות הקשת שליקט 3.4 כרקע/הפניה. בשלב זה הספקטרום צריך להכיל משמעותי (> 100 mO.D...) להקות השנייה אמיד ב ~ 1,540 ס מ-1 , אתר פעיל להקות של Hyd1 צריך להיות ניכר ספקטרלי מהאולטרא 1,850-2,150 ס מ-1, בארצות הברית מחמצנים, לא פעיל (איור 3 ).</li>
</ol>4. הפעלה של e. coli Hydrogenase 1 ובדיקות התא Spectroelectrochemical
<ol><li>הפחתת פוטנציאל (−0.8 V vs SCE) חלות על הסרט חלקיקים Hyd1-השתנה. עיתוני המאגר ניסיוני עם H2 ואת זרימת מאגר באיטיות דרך התא spectroelectrochemical. להשאיר את הדגימה לילה מלא להפעיל את Hyd1. הערה: חשוב להשתמש H אנאירובית2, N2 וכווגזים אנאירובית אז כל צריך לעבור דרך מסנן2 O.</li>
	<li>שיא של ספקטרום ספיגת המדגם לאחר ההפעלה. ΝCO ולהקות vCN של האתר הפעיל כעת יופיע התפלגות של הברית מופחתת, 'פעיל'. זה הוא ציין ביותר בקלות באמצעות קשת ההבדל, ביחס הספקטרום טלקוה 3.10 (איור 4).</li>
	<li>בדוק את חיבור חשמל של התא spectroelectrochemical. כדי לעשות זאת, עיתוני המאגר ניסיוני עם גז2 N. להחיל רצף של חמצון (0 V vs SCE) וקיצור (−0.8 V vs SCE) פוטנציאל (משך 30 דקות ca ) הסרט חלקיקים Hyd1-לאחרונה, והקלטה של ספקטרום ספיגת בכל אחד. צריך להיות מחומצן, מופחתת במהירות Hyd1, אם הסרט חלקיקים מחובר היטב 100% מכלל המדגם צריך להגיב על פוטנציאל יישומי.</li>
	<li>הגדר של קצב הזרימה המתאימה המאגר ניסיוני. כדי לעשות זאת, להחיל הפחתת פוטנציאל (−0.8 V vs SCE) על המדגם, עיתוני המאגר ניסיוני עם H2. להקליט סדרה של voltammograms מחזורית בין-0.707 - 0.039 V vs SCE בקצב הסריקה של mV 10/ס להגדיל בהדרגה את קצב הזרימה של H2-רוויות חיץ בין voltammograms עד waveshape קטליטי דומה לזו-סיבוב מישורי דיסק אלקטרודה55 , הזרם המרבית היא עצמאית של קצב הזרימה (איור 5). הערה: מגבלת מסיסות של H2 במים הוא מ"מ ~0.8 293 K ו- 1 בר.</li>
	<li>כמו לדוגמה עכשיו הוא מוכן למדידות PFIRE, לאסוף ספקטרה במגוון של פוטנציאל, תחת מגוון תנאים פתרון (pH, טמפרטורה, H2 ריכוז וכדומה). להקליט את כל הנתונים אלקטרוכימי באמצעות התוכנה potentiostat כפי שזה חשוב שניתן יהיה להתאים נתונים ספקטרוסקופיות אלקטרוכימי, במיוחד כאשר לומד electrocatalytic תהליכים כגון H2 חמצון על ידי Hyd1.</li>
</ol>5. טיפול נתונים ספקטרוסקופיות
<ol><li>לאשר כי האתר הפעיל לא לצמיתות שונתה במהלך המדידות בהקלטת ספקטרה-0 V ו−0.8 V vs SCE בסוף הניסוי. אלה צריכים להיות זהים כדי ספקטרום טלקוה 4.3, ללא אובדן של אתר פעיל להתייחס בתקופת המדידה (איור 6).</li>
	<li>ייצוא ספקטרה ספיגת מוחלטת מתוך התוכנה ספקטרומטר בתבנית מתאימה (. csv, ASCII, 'matlab', Jcamp וכדומה) לצורך עיבוד באמצעות תוכנות כגון מקור או Matlab.</li>
	<li>
הבסיס לתקן את הנתונים, באמצעות תהליך מאויר איור7.
	<ol>
<li>לקחת את הנגזרת השנייה של כל ספקטרום ספיגת ב- 1,800-2,150 ס"מ ' טווח '-1, על מנת לזהות קטן (< mO.D 1.) אתר פעיל להקות רקע מים עקומים מאוד.</li>
		<li>במקום בסיסית סמן נקודות על הספקטרום ספיגת המקורי, להגדיר את נקודות 'הצמד' אל הספקטרום ניסיוני.</li>
		<li>להתאים תוכנית בסיסית באמצעות נקודות באמצעות פונקצית spline מעוקב עם אינטרפולציה או פונקציה פולינום. חיסור פונקציה בסיסית זו מתוך נתוני ניסיוני.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום עניין פיננסי מתחרות.

PFIRE היא טכניקה בהרחבה הישים של ספקטרוסקופיות IR למיעון חלבונים אלקטרודה. מרותק למיטה חמצון-חיזור. בפרט, electrocatalytic תגובות חמצון-חיזור אנזימים פתור בתנאים תחלופת מהירה. שיטת PFIRE מתבססת על הפקד אלקטרוכימי ישירה המסופקים על ידי הטכניקה של PFE, אשר מספק מידע מבניים ישירה, זוגות זה ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום-פחמן האלקטרודה. הגישה PFIRE ובכך מוסיף תובנה כימי המידע הזמין של אלקטרוכימיה לבד, מתאימה מאוד ללמוד של חמצון-חיזור חלבונים ואנזימים מעורב מולקולה קטנה קשירה והפעלה. בנוסף, PFIRE יכול לספק מידע אודות שינויים מבניים תלויי-פוטנציאל בחלבונים בהיעדר תחלופת קטליטי. אירועים כאלה של העברת אלקטרונים בלתי-מחזור לעיתים קשה לזהות באמצעות יישומים 'תקן' של PFE, למרות ההרחבה של PFE AC טרנספורמציה-פורייה voltammetry שימש בהצלחה רבה. 45 , 46
השיטה PFIRE הוא, כעיקרון, מתאים המחקר של כל חלבון חמצון-חיזור שניתן ללמוד באמצעות PFE. לכן, בדומה PFE, ספיחה חלבון הוא שלב קריטי עבור ניסוי יירוט מוצלח PFIRE. ב פרוטוקול זה אנו מתארים יישום של הטכניקה PFIRE באמצעות Hyd1 e. coli כמקרה. 36 , 43 . אולם, לנו יש גם מוחלת הטכניקה PFIRE את hydrogenase תקינה cytoplasmic מ ר eutropha,44 ועל פלווין mononucleotide הספוחה על פחמן שחור. 40 בכל המקרים האלה, ספיחה פיסיקלית פשוט כדי שלא שונתה שטח גבוה פחמן שחור (כפי שמתואר פרוטוקול זה) מספק כיסוי השטח של חלבון זה מספיק גבוה כדי להקליט באיכות טובה ספקטרום אינפרא-אדום עם יחס אות לרעש גבוה. במקרים שבהם לא ניתן להשיג ברמה כה גבוהה של ספיחה זה ייתכן שיהיה צורך לשנות את פני השטח של חלקיקי פחמן, לדוגמה לאפשר מצורף קוולנטיות החלבון על פני השטח אלקטרודה. 60 , 61 , 62 השימוש הכפפות למדידות PFIRE נחוץ רק אך ורק כאשר לומד כי חייבים להיות מטופלים anaerobically. עם זאת ב אימון מאוד קבוע ונמוך (נקודת הטל < 80 מעלות) רמות של אדי מים המסופקים על ידי האווירה הכפפות לתת רמות גבוהות של אות לרעש המאפשרים הפקת absorbances קטן מאוד. 44 במקרים רבים סביבה אנאירובית, כגון זו הניתנת בתא הכפפות, רצוי גם עבור המידה אלקטרוכימי (חלק בלתי נפרד הטכניקה PFIRE) על מנת למנוע הנוכחי עקב ירידה של2 O על האלקטרודה עבודה.
IR absorbances עקב מים בכמות גדולה, מאגרי ניסיוני, חלקיקי פחמן שעליו המדגם הוא הספוחה כל לתרום באופן משמעותי ספקטרום ניסיוני, יכול לחפוף להקות של עניין, במיוחד אמיד, II ו- III מחוזות ספקטרום. 63 אזור אמיד מכיל גם מידע ממינים אורגניים כגון flavins או nicotinamide cofactors, כמו גם מצעים ומוצרי של תגובות חמצון וצמצום רבים. במקרה של hydrogenases ניפה, νCO וνCN להקות של האתר הפעיל ליפול באזור צלולים יחסית של הספקטרום, אז השיטה PFIRE הוא מאוד מתאים גם במחקר של אנזימים אלה. במקרים אחרים, עם זאת, ההבדל ספקטרה בשילוב עם גישות labelling איזוטרופי עשוי להיות נחוץ כדי לבודד את השינויים, כתוצאה הפרוטאין קיבוע. גישות דומות שימשו כדי לזהות, לדוגמה, פרוטונציה שינויים מבניים rearrangements וכדי ללמוד מתחמי קינטיקת מיכאליס-מנטן באמצעות ספקטרוסקופית אינפרא-אדום. 64 , 65 , 66 PFIRE ולא מוגבל, לכן, המחקר של hydrogenases, אבל ניתן להחיל על כל חלבון חמצון-חיזור המכיל (או של מי סובסטרטים, מוצרים או מעכבי מכילים) קבוצות עם תנודות IR-פעיל אבחון; פחמן חד-חמצני dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,flavoproteins14 , dehydrogenases40 ו formate, למשל...
הטכניקה קשורים, SEIRA, מתאים מאוד במחקר של חלבוני ממברנה-הקשורים בסביבה ביונים. 32 SEIRA הוא עיבוד של ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום גם משתמש בתצורת ATR-IR ולאחר עושה שימוש אפקט שיפור פני השטח זה מגביר את ספיגת IR של מולקולות ממוקם קרוב (במרחק כמה ננומטר) פני המנסרה ATR (חמתו). SEIRA ולכן הוא רגיש ביותר לשינויים ספקטרלי להטבה הארכיטקטורה חלבון וממברנה הספוחה והיא יחסית בחינם מהמודיעין מתחרות של הממס ולהציג מצעים/מעכבי בפתרון. . זה מעט לעומת הטכניקה PFIRE המתוארים כאן הנשענת על עומק החדירה גדול יותר באופן משמעותי מעל פני השטח של חמתו (~ 1 מיקרומטר), כלומר PFIRE הוא יותר רגישים סובסטרטים, מוצרים או מעכבי להציג פתרון. זו רגישות מוגברת ממס 'בצובר' יכול להיות יתרון; אם המצע או מוצר יכול להיות שנצפו ישירות על-ידי אינפרא-אדום, PFIRE ספקטרה דווח על שני קינטיקה מצב יציב של חיים ארוכים מינים הפעילים ויצירת מוצרים משויכות במהלך electrocatalysis. 69 היכולת להתבונן מצב יציב ריכוזי המצע והמוצר יהיה יקר במיוחד עבור אנזימים כגון פחמן חד-חמצני דהידרוגנאז (אשר מזרז חמצון הפיך של CO ל CO2, בולם חזק IR) או formate דהידרוגנאז (אשר מזרז חמצון הפיך של formate CO2).
בזמן הנוכחי, PFIRE מוגבל מחקרים קינטי מצב יציב של אנזים electrocatalysis עקב האלקטרודות פחמן מאקרוסקופית נהגה "להתרכז" האנזים על פני חמתו של איסוף נתונים, גיאומטריה ATR-IR. במובן זה PFIRE מחקרים של hydrogenases ניפה הם משלימים לעבודה של דייר ועמיתים,49,50 משתמשים מבוססות אור חולף IR בליעה ללמוד קינטיקה תת מחזור. העבודה מתבצע על ממוזער התא spectroelectrochemical,40 , עם השימוש microelectrodes הזמן רזולוציה גודל מיקרו השגה. זה יאפשר לימוד של משנה מחזור קינטיקה של אנזימים בתדירויות מחזור עד ca 100-500 s-1, ויאפשר המחקר של תצלום התקריב ותהליכי חמצון.
בסך הכל, PFIRE היא טכניקה ספקטרוסקופיות המאפשר אפיון כימי של electrocatalytic תגובות של חמצון-חיזור אנזימים בתנאים מצב יציב. הגישה PFIRE מאפשר titrations כימית, אלקטרוכימי מרובות להתבצע על הדגימה אנזים אותו, כמו אלקטרודות שטח גבוהה בשימוש לספק של ספיחה חזקים של חלבון, הגיאומטריה ATR-IR מאפשרת פתרון נתיישב חילופי. היכולת לאסוף כזה מידע מבני בחיי עיר במהלך הפונקציה אנזימים הוא כלי רב ערך עבור הקהל הרחב bioelectrochemistry.

אתגר מפתח במחקר של פונקציה של חלבונים כרוך פיתוח שיטות בחיי עיר המאפשרים תצפית ישירה של חלבונים בביצוע תפקידיהם פיזיולוגיים, או ויוו או באמצעות דגימות חלבון מבודד. פעולה זו דורשת השילוב של שליטה או מפעילה תהליכים לתוך בצרות ושימוש בשילוב טכניקות המאפשרות את תגובתיות לפנות לבדיקה, של צעדים כימיים בודדים במהלך פונקציה של חלבונים כדי למדוד, בו זמנית. במקרה של חמצון-חיזור חלבונים זה לעיתים קרובות משווה ל המשלב טכניקות אלקטרוכימי, אשר בדיוק לשלוט פוטנציאל יישומי אבל לספק מידע כימי ישיר אין, עם שיטות ספקטרוסקופיות רגישים מבחינה כימית ספציפית שינויים הקשורים עם פונקציה של חלבונים. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry הוא מונח כללי עבור טווח בשילוב שיטות אלקטרוכימיות, ספקטרוסקופיות להקיף מגוון רחב של שיטות ספקטרוסקופיות ואת רמת השליטה אלקטרוכימי. חלבונים רבים יכולים להחליף אלקטרונים עם אלקטרון מלאכותי, מסיסים התורמים, acceptors, זו נוצלה במחקרים אשר השתמש מולקולות קטנות כדי לתווך העברת-אלקטרונים, כולל צימוד עם UV הגלוי,4,5 , 6 , קיווטות מגנטי 7 8 ו אינפרא-אדום5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. במספר מצומצם של מקרים הוכיחה אפשרות לנצל אלקטרונים בלתי מבוקרת דיפוזיה, חליפין בין חלבונים אלקטרודות. 15 , 16
לתגובות קטליטי ביצעו על ידי אנזימים חמצון-חיזור, גישות אלקטרוכימיה פתרון קיים חיסרון ברור. העברת אלקטרונים מבוקרת דיפוזיה דרך חמצון-חיזור מגשרים בתמיסה היא צפויה להפוך הגבלת קצב. קינטי, מכניסטית מידע אודות האנזים עלול ללכת לאיבוד או לפחות להקשות על deconvolute של חפצי אמנות טשטוש הנובע השיטה הניסיונית. ישירה, בלתי שליטה אלקטרוכימי לכן כלי חשוב לצורך המחקר של חמצון-חיזור חלבונים ואנזימים. הטכניקה של חלבון הסרט אלקטרוכימיה (PFE) מעסיקה חלבונים אלקטרודה. מרותק למיטה חמצון-חיזור, בצורה כזאת, כי האלקטרונים מועברים ישירות או ממנה את cofactors חמצון-חיזור בתוך החלבון כפי האלקטרודה היא מקוטב-סדרה של פוטנציאל. 17 , 18 , 19 PFE הוא בעל ערך מסוים לצורך המחקר של תגובות חמצון או הפחתת על ידי אנזימים חמצון-חיזור, כמו העברת-אלקטרונים פנים יכול להיעשות בקצב מאוד גבוה. לדוגמה, שיעור תחלופה electrocatalytic hydrogenase ([ניפה]) ניקל וברזל מן Allochromatium vinosum נמדדה על ידי PFE כמו ca 1,000-10,000 s− 1 עבור H2 חמצון. 20 האלקטרודה פוטנציאליים פועל כגורם מפעיל להפוך זרז 'על' או 'ביטול' ולאחר הדיווחים הנוכחי electrocatalytic על פעילות האנזים. PFE ולכן היא שיטה ערך לניתוח את תגובתיות של אנזימים מורכבים באופן אינטימי תלויים פוטנציאלית, כגון תגובות של האתר הפעיל di-ברזל של [FeFe]-hydrogenases עם CO ו- O2,21 או בהשפעת פוטנציאל השתקה של כרומוזום תגובות של hydrogenases דהידרוגנאז פחמן חד-חמצני22 ,23 , אנזימים חמצון-חיזור מורכבים אחרים. 24
המכשול העיקרי בפני שילוב שיטות ספקטרוסקופיות עם הפקד אלקטרוכימי ישירה המוענקת על ידי PFE נובע כיסוי משטחים נמוכה של אנזימים חמצון-חיזור, גודל 1-2 pmol ס מ-2 עבור hydrogenase [ניפה] מ- vinosum א, 20 יחסית בחיי עיר המדע משטח מחקרים של מולקולה קטנה adsorbates על גבי אלקטרודות מתכת בצובר. זה מהווה אתגר על הרגישות של המדידה ספקטרוסקופיות מספר שיטות spectroelectrochemical דווחו ללמוד מתאושש חמצון-חיזור חלבונים במגוון של אלקטרודות שונות: ספקטרוסקופיה UV-גלוי-אלקטרודות תחמוצת מתכת שקוף; 25 , 26 , 27 ספקטרוסקופיה זריחה-אלקטרודות זהב; 28 , 29 השטח משופרת ספקטרוסקופיית בליעה אינפרא-אדום (SEIRA)-אלקטרודות זהב; 30 , 31 , 32 , 33 , משטח משופרים שיטות ספקטרוסקופיות ראמאן, בעיקר על אלקטרודות כסף. 34 , 35
כאן נתאר שיטת צימוד PFE עם ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום, בטכניקה המכונה חלבון הסרט אלקטרוכימיה אינפרא-אדום (PFIRE). 36 PFIRE שיטת מחקרים חמצון-חיזור אנזימים ותשמרו על אלקטרודה עבודה פחמן שטח גבוהה בשיתוף עם גאומטריה אינפרא-אדום (ATR-IR) השתקפות הכולל הקלוש, ניצול הקלות של ספיחה של מגוון של חלבונים על משטחי פחמן. ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום שימושית במחקרים של חמצון-חיזור אנזימים וחלבונים כמו מולקולות קטנות רבות, ליגנדים, cofactors יש absorbances אבחון זה ניתן להשתמש כדי להעריך את מצב תגובתיות, איגוד, עיכוב, חמצון-חיזור. דוגמאות כוללות קשירה של לא למרכזי ברזל-גופרית,37 המחקר של flavoproteins,38,39,40 מולקולה קטנה איגוד מרכזי heme ועוד. 41 הגיאומטריה ATR ה-IR מאפשר בנייה של תא אלקטרוכימי שלוש ממוטבת-אלקטרודה (ספקטרו)42 , ולכן מספק שליטה אלקטרוכימי מעולה. פתרון התנגדות וטיילו פוטנציאליים הן מזעריות על-ידי הצבת של אלקטרודה הפניה ליד האלקטרודה עבודה. אלקטרודות שטח גבוהה מונה משמשים שעולות בקנה אחד עם זרמים electrocatalytic גבוהה המיוצר על ידי האנזים מהירה מחזור ב האלקטרודה עבודה. זרימה של פתרון באמצעות תא spectroelectrochemical מאפשר שליטה נתיישב על הריכוז של מצעים, מעכבי ו- pH. 36 , 43 , 44 PFIRE השיטה מאפשרת לכן ספקטרה IR להיות מוקלט בחיי עיר בזמן ממושך אנזים electrocatalysis. 36 , 44 PFIRE הוא גם מסוגל לספק מידע כימי בהיעדרו של הנוכחי, קטליטי43 בניגוד PFE איפה זה יכול להיות קשה כדי לחלץ מידע שאינו קטליטי בתהליכי חמצון-חיזור אנזימים. 45 , 46
הראו את שיטת PFIRE עבור המחקר של electrocatalytic H2 חמצון על ידי [ניפה] hydrogenases, אשר מכילים ליגנדים CO ו- CN מהותי מתואמת כדי Fe-אתר פעיל בי-מתכתיים. 36 , 43 , 44 [ניפה] hydrogenases ולכן הם התאימו היטב כדי ללמוד על-ידי PFIRE. שיטת PFIRE מספק מידע על מינים שנמצאים במהלך מחזור מצב יציב ומספק ולכן קריטי תובנה מכניסטית בנוסף העושר של ספרות על ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום של hydrogenases ללא שליטה ניסויית על מחזור. 47 , 48 דייר ועמיתים המועסקים זמן לפתור IR שיטות ללימוד ניפה hydrogenases,49,50,51 באמצעות גורם אור כדי להחיל צעד פוטנציאל שלילי קטן (באמצעות שימוש של פתרון מגשרים ומקור אלקטרון "כלואה") או photolyse הידריד מאוגד. למרות השיטה PFIRE לא יכול, בזמן הנוכחי, לספק רזולוציה הזמן כדי להתאים את המידות האלה,40 זה לאפשר לימוד של תהליכים קטליטי חותכות והן חמצוני, לגשת במגוון של פוטנציאל מוגדרים היטב וללא התחבורה ההמונית מגבלות.
השיטה PFIRE היא נבדלת SEIRA מחקרים של חמצון-חיזור חלבונים, אשר גם להשתמש של הגיאומטריה ATR-IR ולהעסיק אלקטרודת מתכת של ננו-roughened כדי לשפר את ספיגת IR של מולקולות הספוחה על פני האלקטרודה. 30 SEIRA היא טכניקה בעלת ערך רב מאוד ללמוד קרום חלבונים, בפרט הספוחה על או בתוך הממברנה מימטי ארכיטקטורות,32 אבל את הצורך אלקטרודת מתכת יכול להגביל את טווח המצע והמעכב עקב תגובתיות את התמיכה אלקטרודה לכיוון מולקולות קטנות כגון CO, CN–, CO2 וכו הפחתת פרוטונים ו טפט עצמית שהורכב desorption יכול להיות בעייתי על משטחי מתכת-פוטנציאל שלילי מאוד,1,52 למרות אנזים electrocatalysis על הגנה מתכת אלקטרודות דווח. 53 , 54 חיסרון של PFIRE ביחס SEIRA הוא הקושי היחסי של שילוב קרום חלבונים בממברנה מקורית או מימטי ארכיטקטורות. עם זאת, יחסי אינרטיות כימית מצוינת ועמידות של החקירה פחמן תגובות הפעלה מתחרה של מולקולה קטנה גורם PFIRE טכניקה מצוינת ללמוד אנזים electrocatalysis, במיוחד בתחום פוטנציאל נמוך הרלוונטיים ביולוגי חמצון-חיזור תהליכים כגון פרוטון הפחתת על-ידי hydrogenases. 1 , 43
מטרת מאמר זה היא להציג את השיטה PFIRE כמו שיטת לימוד חלבונים אלקטרודה. מרותק למיטה חמצון-חיזור, ניפה hydrogenase 1 (Hyd1) מ- Escherichia coli כדוגמא. שיקולים של הכנת הדוגמא, הדרישה זרימה טובה המצע ונתונים טיפול הם דנו. PFIRE היא טכניקה בהרחבה ישימים, מותאם היטב כדי ללמוד כל חלבון חמצון-חיזור (עם absorbances האופיינית IR) זה יכול להיות adsorbed על גבי אלקטרודות פחמן, או ישירות או באמצעות שינוי פני השטח, כך שזה יכול להחליף אלקטרונים עם אלקטרודה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">680-IR</td>
			<td style="width:167px;">with an external MCT detector</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ATR accessory</td>
			<td style="width:71px;">Pike Technologies</td>
			<td style="width:119px;">GladiATR</td>
			<td>Customised for use with a 5-reflection Si IRE</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glovebox</td>
			<td style="width:71px;">Glove Box Technology Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Custom designed &#39;wet&#39; and &#39;dry&#39; box for anaerobic sample handling and measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KBr window</td>
			<td style="width:71px;">Crystran</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Additional optics</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Components from a PM-IRRAS accessory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Silicon IRE</td>
			<td style="width:71px;">Crystal GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potentiostat</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;">Autolab PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nova 10.1</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling the potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:71px;">Williamson Manufacturing Company Ltd</td>
			<td>QL-1000-024-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pt wire</td>
			<td style="width:71px;">Surepure Chemetals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272</td>
			<td>99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon rod</td>
			<td style="width:71px;">WH Smith</td>
			<td align="right">30729209</td>
			<td>0.7 mm HB pencil lead</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbon black</td>
			<td style="width:71px;">Cabot Corporation</td>
			<td style="width:119px;">Black Pearls 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrasonic bath</td>
			<td style="width:71px;">Ultrawave</td>
			<td style="width:119px;">U100</td>
			<td>35 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC5050BK</td>
			<td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5452000018</td>
			<td>MiniSpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/9240/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HNO3</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">N/2300/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">silicone sealant</td>
			<td style="width:71px;">Cow Corning Toray Co., Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">SE 4486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon paper</td>
			<td style="width:71px;">Toray</td>
			<td style="width:119px;">TGP-H-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro 2015</td>
			<td style="width:71px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis/graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resolutions Pro 4.0</td>
			<td style="width:71px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling FTIR spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase

הבנת הכימיה של חמצון-חיזור חלבונים דרישות שיטות המספקים שליטה מדויקת חמצון-חיזור מרכזי בתוך החלבון. הטכניקה של חלבון הסרט אלקטרוכימיה, שבו חלבון זה ותשמרו על פני השטח אלקטרודה כך האלקטרודה מחליפה אלקטרונים פיזיולוגיים או acceptors, סיפקה פונקציונלי תובנה תגובות חמצון-חיזור של מגוון שונה חלבונים. ההבנה כימי מלא דורש שליטה אלקטרוכימי להיות משולבת עם טכניקות אחרות, באפשרותך להוסיף תובנה מכניסטית מבניים נוספים. כאן אנחנו מדגימים טכניקה, חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה, המשלב חלבון הסרט אלקטרוכימיה עם אינפרא אדום ספקטרוסקופיות דגימה של חלבונים חמצון-חיזור. הטכניקה משתמשת של הגיאומטריה מרובות-השתקפות השתקפות הכולל הקלוש כדי לחקור חלבון חמצון-חיזור ותשמרו על אלקטרודה פחמן שחור שטח גבוהה. תיאגוד זו האלקטרודה לתא זרימה מאפשר פתרון pH או ממס ריכוזים להשתנות במהלך המדידות. . זה חזק במיוחד בהתייחסות אנזימים חמצון-חיזור, תחלופה מהירה קטליטי יכול להיות מתמשכת ואיפה נשלטת על האלקטרודה ומאפשר תצפית ספקטרוסקופיות של מינים ביניים מאריכים את המנגנון קטליטי. נדגים את הטכניקה עם ניסויים על e. coli hydrogenase 1 תחת מחזור (H2 חמצון) ומצבים שאינם-מחזור.

Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

כאן, אנו מתארים טכניקה, חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה, המאפשר קיבוע חמצון-חיזור חלבונים שילמדו spectroscopically תחת שליטה ישירה אלקטרוכימי פחמן האלקטרודה. ניתן להקליט ספקטרום אינפרא-אדום של דגימה של חלבון יחיד בטווח של פוטנציאל יישומי, תחת מגוון תנאים פתרון.

חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה שהפגינו למחקר של H2 חמצון Hydrogenase [ניפה]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA ו CLC: downregulation CLF-1-תלוי של CNTFRα כפי שהוכח על ידי המערב סופג, עיכוב של ליזוזומלית אנזימים, ו Immunocytochemistry

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...