Name: protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00
Duration: 10 min 1 s
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K.A.V. और P.A.A. का काम यूरोपीय अनुसंधान परिषद (EnergyBioCatalysis-ईआरसी-२०१०-StG-२५८६००), इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद आईबी उत्प्रेरक पुरस्कार EP/N013514/1, और जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान द्वारा समर्थित था परिषद् (bb/L009722/1 और bb/N006321/ R.H. Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de कोस्टा रिका, और लिंकन कॉलेज, ऑक्सफोर्ड द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक श्री चार्ली जोंस, श्री चार्ली इवांस और यांत्रिक कार्यशाला (रसायन शास्त्र विभाग) के डिजाइन और इस काम में प्रयुक्त spectroelectrochemical कोशिकाओं के निर्माण में सहायता के लिए कर्मचारियों को स्वीकार करते हैं.

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा नहीं वित्तीय हित की घोषणा ।

PFIRE इलेक्ट्रोड-मैटीरियल redox प्रोटीन्स को एड्रेस करने के लिए मोटे तौर पर लागू आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है । विशेष रूप से, redox एंजाइमों की electrocatalytic प्रतिक्रियाओं तेजी से कारोबार की स्थिति के तहत जांच की जा सकती है । PFIRE विधि PFE है, जो कोई प्रत्यक्ष संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है की तकनीक द्वारा प्रदान की प्रत्यक्ष विद्युत नियंत्रण पर बनाता है, और यह एक कार्बन इलेक्ट्रोड पर IR स्पेक्ट्रोस्कोपी को जोड़ों । PFIRE दृष्टिकोण इस प्रकार electrochemistry अकेले से उपलब्ध जानकारी के लिए रासायनिक अंतर्दृष्टि कहते है और उच्च redox प्रोटीन और छोटे अणु बाध्यकारी और सक्रियकरण में शामिल एंजाइमों के अध्ययन के लिए अनुकूल है । इसके अलावा, PFIRE उत्प्रेरक कारोबार के अभाव में प्रोटीन में संभावित निर्भर संरचनात्मक परिवर्तन के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । ऐसी गैर-टर्नओवर इलेक्ट्रॉन अंतरण घटनाएँ प्रायः PFE के ' मानक ' आवेदनों का उपयोग कर पता लगाने में कठिन होती हैं, हालाँकि PFE के विस्तार का रूपान्तर-रूपांतरित एसी voltammetry को बड़ी सफलता के साथ उपयोग में लिया गया है. ४५ , ४६
PFIRE विधि सिद्धांत रूप में, किसी भी redox प्रोटीन है कि PFE का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है के अध्ययन के लिए उपयुक्त है । इसलिए, PFE के साथ के रूप में, प्रोटीन सोखना एक सफल PFIRE प्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । इस प्रोटोकॉल में हम एक मामले का अध्ययन के रूप में ई. कोलाई Hyd1 का उपयोग कर PFIRE तकनीक के एक आवेदन का वर्णन. ३६ , ४३ हालांकि, हमने cytoplasmic रेगुलेटरी hydrogenase से आर eutropha,४४ और कार्बन ब्लैक पर फ्लेविन mononucleotide adsorbed करने के लिए PFIRE तकनीक को भी लागू किया है । ४० इन सभी मामलों में, सरल शारीरिक सोखना को संशोधित उच्च सतह क्षेत्र कार्बन ब्लैक (जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है) प्रोटीन की सतह कवरेज प्रदान करता है जो उच्च सिग्नल से शोर अनुपात के साथ अच्छी गुणवत्ता वाली IR स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त उच्च है । मामलों में जहां सोखना के इस तरह के उच्च स्तर प्राप्त नहीं किया जा सकता है यह कार्बन कणों की सतह को संशोधित करने के लिए आवश्यक हो सकता है, उदाहरण के लिए इलेक्ट्रोड सतह के लिए प्रोटीन के आबंध लगाव की अनुमति देने के लिए. ६० , ६१ , ६२ PFIRE मापन के लिए एक glovebox का उपयोग केवल सख्ती से आवश्यक है जब नमूने है कि anaerobically संभाला जाना चाहिए का अध्ययन । हालांकि अभ्यास में बेहद निरंतर और कम (< ८० ° c ओस बिंदु) glovebox वायुमंडल द्वारा प्रदान की गई जल वाष्प के स्तर को उच्च संकेत-से-शोर स्तर देते हैं जो बहुत छोटे absorbances की निकासी की अनुमति देता है । कई मामलों में ४४ एक anaerobic वातावरण, glovebox द्वारा प्रदान की गई है कि जैसे, विद्युत माप के लिए भी वांछनीय है (PFIRE तकनीक का अभिंन अंग) क्रम में काम इलेक्ट्रोड पर हे2 कमी के कारण वर्तमान से बचने के लिए.
IR थोक पानी के कारण absorbances, प्रयोगात्मक बफ़र्स और कार्बन कणों जिस पर नमूना adsorbed सभी प्रयोगात्मक स्पेक्ट्रा के लिए महत्वपूर्ण योगदान है और ब्याज की बैंड ओवरलैप सकता है, विशेष रूप से के बीच मैं, द्वितीय और तृतीय क्षेत्रों में स्पेक्ट्रम. ६३ के बीच क्षेत्र भी ऐसी flavins या nicotinamide cofactors के रूप में कार्बनिक प्रजातियों से जानकारी शामिल है, साथ ही सब्सट्रेट और कई ऑक्सीकरण और कमी प्रतिक्रियाओं के उत्पादों । नाईफ hydrogenases के मामले में, νCO और सक्रिय साइट के νCN बैंड स्पेक्ट्रम के एक अपेक्षाकृत स्पष्ट क्षेत्र में गिरावट और इसलिए PFIRE तकनीक बहुत अच्छी तरह से इन एंजाइमों के अध्ययन के लिए अनुकूल है । अंय मामलों में, तथापि, अंतर स्पेक्ट्रा isotopic लेबलिंग दृष्टिकोण के साथ युग्मित करने के लिए मैटीरियल प्रोटीन के कारण परिवर्तन को अलग करने की जरूरत हो सकती है । इसी तरह के दृष्टिकोण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, उदाहरण के लिए, प्रोटॉन परिवर्तन, संरचनात्मक पुनर्व्यवस्थाओं और आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर Michaelis-मेनटेन परिसरों का अध्ययन करने के लिए. ६४ , ६५ , ६६ PFIRE नहीं है, इसलिए, hydrogenases के अध्ययन के लिए सीमित है, लेकिन किसी भी redox प्रोटीन है कि शामिल करने के लिए लागू किया जा सकता है (या जिनके सब्सट्रेट, उत्पादों या अवरोधों होते हैं) नैदानिक आईआर सक्रिय कंपन के साथ समूह; कार्बन मोनोऑक्साइड dehydrogeanses,६७ nitrogenases,६८,14 flavoproteins,४० और formate dehydrogenases, उदाहरण के लिए ।
संबंधित तकनीक, SEIRA, एक biomimetic वातावरण में झिल्ली से जुड़े प्रोटीन के अध्ययन के लिए बहुत अच्छी तरह से अनुकूल है । ३२ SEIRA ir स्पेक्ट्रोस्कोपी का एक अनुकूलन है कि यह भी एक एटीआर-ir विंयास का उपयोग करता है, और एक सतह वृद्धि प्रभाव का उपयोग करता है कि करीब स्थित अणुओं के आईआर अवशोषित प्रवर्धक (कुछ एनएम के भीतर) एटीआर चश्मे की सतह (गुस्सा) । SEIRA इसलिए adsorbed प्रोटीन और झिल्ली वास्तुकला के भीतर घटित वर्णक्रमीय परिवर्तन के प्रति अति सुंदर रूप से संवेदनशील है और समाधान में मौजूद विलायक और सब्सट्रेट/अवरोधकों से संकेतों प्रतिस्पर्धा से अपेक्षाकृत मुक्त है । यह PFIRE तकनीक के विपरीत कुछ हद तक यहां वर्णित है जो गुस्सा (~ 1 µm) की सतह से ऊपर एक काफी अधिक पैठ गहराई पर निर्भर करता है, जिसका अर्थ है कि PFIRE अधिक सब्सट्रेट, उत्पाद या अवरोधकों के लिए संवेदनशील है समाधान में मौजूद । इस वृद्धि की संवेदनशीलता को ' थोक ' विलायक लाभप्रद हो सकता है; यदि सब्सट्रेट या उत्पाद IR द्वारा सीधे देखा जा सकता है, PFIRE स्पेक्ट्रा रिपोर्ट लंबे समय से सक्रिय प्रजातियों और electrocatalysis के दौरान जुड़े उत्पाद गठन के दोनों स्थिर राज्य कैनेटीक्स पर । ६९ सब्सट्रेट और उत्पाद के स्थिर राज्य सांद्रता का पालन करने की क्षमता इस तरह के कार्बन मोनोऑक्साइड डिहाइड्रोजनेज के रूप में एंजाइमों के लिए विशेष रूप से मूल्यवान हो जाएगा (जो सह के प्रतिवर्ती ऑक्सीकरण catalyzes2, एक मजबूत आईआर अवशोषक) या formate डिहाइड्रोजनेज (जो प्रारूप के प्रतिवर्ती ऑक्सीकरण के लिए2सह catalyzes) ।
वर्तमान में, PFIRE स्थिर करने के लिए सीमित है एंजाइम electrocatalysis के कारण macroscopic कार्बन इलेक्ट्रोड के लिए ' ध्यान केंद्रित ' में डेटा संग्रह और एटीआर-आईआर ज्यामिति के लिए एक गुस्सा की सतह पर एंजाइम का इस्तेमाल किया । नाईफ hydrogenases के इस संबंध PFIRE अध्ययन में डायर और सह कार्यकर्ताओं के काम के पूरक हैं,४९,५० जो प्रकाश का उपयोग-ट्रिगर क्षणिक अवशोषण आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी उप कारोबार कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए. spectroelectrochemical कक्ष,४० को miniaturize करने के लिए कार्य चल रहा है और microseconds के आदेश पर microelectrodes समय संकल्प के उपयोग के साथ प्राप्त किया जाना चाहिए । यह ca १००-५०० s-1करने के लिए कारोबार आवृत्तियों के साथ एंजाइमों के लिए उप कारोबार कैनेटीक्स के अध्ययन में सक्षम हो जाएगा, और दोनों reडक्टर और oxidative प्रक्रियाओं के अध्ययन में सक्षम हो जाएगा ।
कुल मिलाकर, PFIRE एक स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है कि स्थिर राज्य की स्थितियों में redox एंजाइमों के electrocatalytic प्रतिक्रियाओं के रासायनिक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है । PFIRE दृष्टिकोण एकाधिक रासायनिक और विद्युत titrations एक ही एंजाइम नमूना पर किया जा करने के लिए अनुमति देता है, उच्च सतह क्षेत्र इलेक्ट्रोड के रूप में इस्तेमाल किया प्रोटीन की एक मजबूत सोखना प्रदान करते हैं और एटीआर-आईआर ज्यामिति सतही समाधान विनिमय की अनुमति देता है. एंजाइम समारोह के दौरान सीटू में इस तरह के संरचनात्मक जानकारी एकत्र करने की क्षमता व्यापक bioelectrochemistry समुदाय के लिए एक अमूल्य उपकरण है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">680-IR</td>
			<td style="width:167px;">with an external MCT detector</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ATR accessory</td>
			<td style="width:71px;">Pike Technologies</td>
			<td style="width:119px;">GladiATR</td>
			<td>Customised for use with a 5-reflection Si IRE</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glovebox</td>
			<td style="width:71px;">Glove Box Technology Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Custom designed &#39;wet&#39; and &#39;dry&#39; box for anaerobic sample handling and measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KBr window</td>
			<td style="width:71px;">Crystran</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Additional optics</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Components from a PM-IRRAS accessory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Silicon IRE</td>
			<td style="width:71px;">Crystal GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potentiostat</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;">Autolab PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nova 10.1</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling the potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:71px;">Williamson Manufacturing Company Ltd</td>
			<td>QL-1000-024-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pt wire</td>
			<td style="width:71px;">Surepure Chemetals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272</td>
			<td>99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon rod</td>
			<td style="width:71px;">WH Smith</td>
			<td align="right">30729209</td>
			<td>0.7 mm HB pencil lead</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbon black</td>
			<td style="width:71px;">Cabot Corporation</td>
			<td style="width:119px;">Black Pearls 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrasonic bath</td>
			<td style="width:71px;">Ultrawave</td>
			<td style="width:119px;">U100</td>
			<td>35 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC5050BK</td>
			<td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5452000018</td>
			<td>MiniSpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/9240/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HNO3</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">N/2300/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">silicone sealant</td>
			<td style="width:71px;">Cow Corning Toray Co., Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">SE 4486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon paper</td>
			<td style="width:71px;">Toray</td>
			<td style="width:119px;">TGP-H-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro 2015</td>
			<td style="width:71px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis/graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resolutions Pro 4.0</td>
			<td style="width:71px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling FTIR spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase

redox प्रोटीन की रसायन विज्ञान को समझना तरीकों की मांग है कि प्रोटीन के भीतर redox केंद्रों पर सटीक नियंत्रण प्रदान करते हैं । प्रोटीन फिल्म electrochemistry की तकनीक, जिसमें एक प्रोटीन एक इलेक्ट्रोड सतह पर इस तरह है कि इलेक्ट्रोड शारीरिक इलेक्ट्रॉन दाताओं या स्वीकार करता है पर स्थिर है, अलग की एक सीमा के redox प्रतिक्रियाओं में कार्यात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान की है प्रोटीन. पूर्ण रासायनिक समझ विद्युत नियंत्रण अंय तकनीकों है कि अतिरिक्त संरचनात्मक और यंत्रवत अंतर्दृष्टि जोड़ सकते है के साथ संयुक्त होना चाहिए । यहां हम एक तकनीक, प्रोटीन फिल्म अवरक्त electrochemistry, जो redox प्रोटीन के अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी नमूना के साथ प्रोटीन फिल्म electrochemistry को जोड़ती है प्रदर्शित करता है । तकनीक एक बहु प्रतिबिंब तनु कुल चिंतनशील ज्यामिति जांच एक redox एक उच्च सतह क्षेत्र कार्बन काले इलेक्ट्रोड पर मैटीरियल प्रोटीन का उपयोग करता है । एक प्रवाह सेल में इस इलेक्ट्रोड का निगमन समाधान पीएच या घुला हुआ सांद्रता माप के दौरान बदला जा करने के लिए अनुमति देता है. यह redox एंजाइमों को संबोधित करने में विशेष रूप से शक्तिशाली है, जहां तेजी से उत्प्रेरक कारोबार लगातार और इलेक्ट्रोड में लंबे समय से रहते थे स्पेक्ट्रोस्कोपी अवलोकन की अनुमति पर नियंत्रण कर सकते हैं उत्प्रेरक तंत्र में मध्यवर्ती प्रजातियों । हम कारोबार (एच2 ऑक्सीकरण) और गैर कारोबार की स्थिति के तहत ई. कोलाई hydrogenase 1 पर प्रयोगों के साथ तकनीक का प्रदर्शन ।

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Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

यहां, हम एक तकनीक का वर्णन, प्रोटीन फिल्म अवरक्त electrochemistry, जो एक कार्बन इलेक्ट्रोड पर प्रत्यक्ष विद्युत नियंत्रण के तहत मैटीरियल redox प्रोटीन spectroscopically अध्ययन किया जा करने के लिए अनुमति देता है । एक प्रोटीन नमूने के अवरक्त स्पेक्ट्रा लागू संभावितों की एक श्रेणी में और समाधान की एक किस्म के तहत दर्ज किया जा सकता है ।

प्रोटीन फिल्म अवरक्त Electrochemistry एक [नाईफ] Hydrogenase द्वारा एच2 ऑक्सीकरण के अध्ययन के लिए प्रदर्शन किया

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

एक उपकरण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के रूप में प्रतिदीप्ति एनिसोट्रॉपिक

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SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA और सीएलसी: CNTFRα के जमानती-1-निर्भर downregulation के रूप में पश्चिमी सोख्ता, लाइसोसोमल एंजाइमों का निषेध, और immunocytochemistry द्वारा प्रदर्शन

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