Name: protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

K.A.V. og P.A.A. ble støttet av den europeiske Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), Engineering og Physical Sciences Research Council IB katalysator prisen EP/N013514/1, og bioteknologi og biologisk vitenskap forskning Rådet (BB/L009722/1 og BB/N006321/1). R.H. ble støttet av Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, og Lincoln College, Oxford. Forfatterne bekrefter Mr. Charlie Jones, Mr. Charlie Evans og stab av mekaniske verksted (Institutt for kjemi) for hjelp i design og produksjon av spectroelectrochemical celler brukes i dette arbeidet.

1. gjenskape den interne eksempel kupé av en FTIR Spectrometer inne en anaerob, tørr Glovebox og generelle eksperimentelle krav
<ol><li>Bruk en kommersiell FTIR spectrometer utstyrt med eksterne kvikksølv kadmium telluride (MCT) detektor og ATR tilbehør. Tømme kroppen av spectrometer med tørr luft eller dinitrogen, eller alternativt bruke en spectrometer med en evakuert optisk benk.</li>
	<li>Plasser spectrometer på en stabil, vibrasjonsfritt tabell på samme høyde som en anaerob (< 1 ppm O2), tørke (duggpunkt <-75 ° C) glovebox. Viderekoble IR stråle av spectrometer i glovebox'en, gjennom en IR-gjennomsiktig vindu som er stor nok til defocused strålen. Merk: Det er viktig at avstanden mellom glovebox og spectrometer også renset eller evakuert, spesielt hvis en hygroskopisk vinduet materiale, for eksempel NaCl eller KBr for eksempel brukes.</li>
	<li>
Replikere interne eksempel kupé av spectrometer inne en glovebox.
	<ol>
<li>Direkte strålen i en glovebox på en off-aksen ellipsoidisk speil, helst med samme brennvidde som intern fokus speilet av spectrometer. Merk: Det er nyttig å ha to ekstra flyet speil plassert foran denne fokus speil, slik at både høyden og retningen på IR strålen justeres innenfor en glovebox; Dette vil oppveie noen unøyaktighet i første plassering i spectrometer.</li>
		<li>Plasser en ekstern MCT-detektor, komplett med en fokusere optikk (som en kort brennvidde ZnSe linsen, eller off-aksen parabolske speil, samt en kort brennvidde) inne en glovebox, plassert som for å kopiere dimensjonene av interne prøven rommet spectrometer.</li>
		<li>Justere "fokus" av IR strålen å være omtrent like langt mellom fokus speilet og MCT detektoren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avkjøle dewar av eksterne MCT detektor med flytende nitrogen.</li>
	<li>Montere ATR tilbehøret til glovebox eksempel batterirommet. Juster input og produksjon fokusere optikk og ATR tilbehør for å oppnå maksimal gjennomstrømming til MCT detektoren. Om nødvendig, bruk en blender eller andre passende signaltap (for eksempel en wire rutenett) å hindre oversaturation detektor signalet. Merk: Hvis dataene presenteres her, en fem-refleksjon ATR tilbehør med alle reflekterende optikk og en flyttbar trapesformet Si interne refleksjon elementet (irsk) brukes (Crystal GmbH, dimensjoner ca 5 × 8 × 1 mm3, ansikt vinkel 39.5 °). GÅ er montert i en flyttbar sokkelen maskinert polyether Eter keton (kikk).</li>
	<li>Bruke en glovebox å huse gjenskapt eksempel rommet med egnet feedthroughs til at et eksternt plassert potentiostat (gass stramt BNC-kontakter er nyttig for dette formålet), gass tilgang og kabelen til å overføre signalet fra MCT detektoren. Det er viktig å beholde noen skjerming på detektoren kabelen for å unngå å introdusere støy eller forstyrrelser med målene.</li>
	<li>Plass en peristaltiske pumpe, i stand til strømningsrater større enn 60 mL/min i en glovebox. Skjematisk vise spektrometer, ATR tilbehør, peristaltiske pumpe og potentiostat oppsett er vist i figur 1.</li>
	<li>Konstruere en spectroelectrochemical celle, som vist skjematisk i figur 2, som sel på ATR tilbehør. Cellen må inneholde en høy overflate telleren elektrode (Pt wire eller gasbind), en tilkobling for arbeider elektroden (karbon stav) og en miniatyr referanse elektrode. Cellen må inneholde minst to ytterligere porter som innløp og utløp for rask flyt av løsninger gjennom cellen. Merk: En miniatyr mettet calomel referanse elektrode er ideelt for dette formålet. 36
</li>
</ol>2. forberedelse av sot partikler endret med E. coli Hydrogenase 1
<ol><li>I et 'våte' anaerob hanskerom, bland 20 mg av høy areal sot partikler (> 1000 m3/g) med 1 mL av beryllium renhet vann (resistivitet > 18 MΩ cm) i et microcentrifuge rør. Spre partikler av lav-effekt sonication (< 100 W) i minst 15 minutter, eller til spredning uniform og ikke ikke sediment innen 1 h, for å gi en sot spredning med en lasting av ca 20 mg/mL.</li>
	<li>
Ta en aliquot av E. coli hydrogenase 1 (Hyd1, ca 50 µL, utarbeidet etter en publisert prosedyren55) i en konsentrasjon av ~ 7 mg protein/mL og bytte den inn i en lav ioniske styrke buffer ved pH nær isoelectric punktet (for eksempel kalium fosfat, 15 mM, pH 5.8, ingen ekstra salt). For å oppnå best resultat, bruk et enzym forberedelse som er så aktiv som mulig. Utføre buffer utveksling av konsentrasjon og fortynning, i en sentrifugal filter enhet med en passende molekylvekt cutoff (50 kDa fungerer godt for for Hyd1).
	<ol>
<li>Legg til Hyd1 til filter enheten.</li>
		<li>Fortynn med ca 450 µL exchange bufferen.</li>
		<li>Reconcentrate til et volum på 50 µL med mild sentrifugering (< ~ 2700 × g) å hindre irreversibel nedbør.</li>
		<li>Gjenta trinn 2.2.2 og 2.2.3 til buffer exchange er fullført (vanligvis innen ~ 5 sykluser).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bland et 5 µL volum på 20 mg/mL sot spredning (forberedt i 2.1) med 50 µL aliquot av buffer-byttet Hyd1. Lagre enzym-partikkel blandingen i kjøleskap (ved 0 ° C) over natten slik at enzymet til adsorberes. Det kan være nødvendig å riste blanding innimellom for å sikre partiklene er spredt.</li>
	<li>Vask Hyd1-modifisert partikler med lav ioniske styrke buffer (kalium fosfat, 15 mM, pH 5.8, ingen ekstra salt) av påfølgende sedimentering og re spredning sykluser i en microcentrifuge (~ 2700 × g). Gjenta denne prosessen 3 - 5 ganger å fjerne ikke-adsorbert enzym. Merk: Før første vask nedbryting skal nesten fargeløs, indikerer god adsorpsjon av enzym.</li>
	<li>Konsentrere seg partikler til et endelig antall ~ 5 µL, for å gi en endelig lasting av ~ 20 mg/mL av enzymet endret partikler. Merk: Hyd1-modifisert partikler kan lagres på 4 ° C i opptil to uker hvis hydrated; Dette er best oppnås ved å lagre partikler fortynnet med ~ 50 µL av beryllium renhet vann.</li>
</ol>3. forberedelse til PFIRE målene på E. coli Hydrogenase 1
<ol><li>Rengjør Si IRE ved lav-drevne sonication (< 100 W), først i H2så4 (< 90% w/w) for ~ 15 minutter, og deretter i HNO3 (70% w/w) for opptil 1 time. Denne klargjøringsprosedyren bør føre til en hydrofile IRE overflate. Hvis ytterligere rengjøring er nødvendig IRE kan plasseres i piranha løsning (1:3 forholdet H2O2: H2SO4) å oksidere gjenværende organisk materiale. Merk: Harde surt rensemetoder kan ikke være egnet for bruk med alle IRE materialer. Piranha løsningen er svært etsende og en sterk oksiderende, overflater bør være rimelig rent før bruk av piranha løsning og omsorg bør tas under forberedelse og bruk av piranha løsningen grunn eksoterm prosessen - alltid legge til H2O 2 sakte til H2SO4 og henviser til de aktuelle sikkerhetsrutiner for forberedelse, bruk og disponering.</li>
	<li>Skyll ren IRE i av beryllium renhet vann, og tørk under en strøm av tørr nitrogen gass. Utføre alle prisme håndtering ved hjelp av ren pinsett for å unngå forurensning.</li>
	<li>Forsegle IRE i ATR tilbehør platen med en tynn stripe av elektrisk-silikon fugemasse. Pass på å begrense tetningsmasse til kantene av IRE. Tillate tetningsmasse tørke helt.</li>
	<li>Overføre ATR tilbehør sokkelen til spectrometer glovebox'en og montere den på ATR tilbehøret. Måle en referanse (bakgrunn) spektrum mellom 4000-1000 cm-1 med 4 cm-1 oppløsning, bruker den standard raske scan modus for spectrometer og 1024 gjennomsnitt interferograms (måling tid ~ 3-5 minutter). Bruk dette spekteret som inndata for å tillate beregning av absorbansen spectra senere i eksperimentet. Merk: På grunn av liten absorbansen forventet for det Hyd1 aktive området er det nødvendig å samle spectra med høy signal til støy forhold.</li>
	<li>Overføre ATR tilbehør sokkelen til 'våte' glovebox'en som inneholder ferdig Hyd1 endret partikkel spredning (inndeling 2). Slipp-cast en 1 µL aliquot av partikkel spredningen på store ansiktet av IRE, og spre dem jevnt over overflaten. Merk: Ikke la partikler å bli helt tørt på gå.</li>
	<li>Cut et stykke karbonpapir, som brukes som gass diffusjon lag materiale i brenselceller, til en størrelse ~0.1 mm mindre enn overflaten IRE (dvs. ca. 8.2 × 4,9 mm2). Arealet av karbon papiret bør være store nok til å dekke slipp-cast Hyd1 endret partikler, men ikke så stor som overlapper silikon tetningsmasse brukes til å sikre IRE. Nyt karbonpapir i vannet og forsiktig plassere den over toppen av partikkel filmen. Carbon papiret vil gi god elektrisk tilkobling over hele partikkel filmen. Merk: Det er fordelaktig å forberede flere biter av karbonpapir på forhånd, og lagre dem pre dynket i av beryllium renhet vann inne 'våte' anaerob glovebox'en.</li>
	<li>Montere spectroelectrochemical cellen (beskrevet i 1,7 og vist skjematisk i figur 2) over IRE, sikre det til sokkelen med skruer. Legg ~ 200 µL av eksperimentelle bufferen å holde enzymet hydrert. En blandet buffer system, i stand til bufring over et bredt pH-område, er nyttig for studier av NiFe hydrogenases:56 natrium acetat, 2-[N'-morpholino] etan-sulfonic syre (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazin -N' -[2-etan-sulfonic syre] (HEPES), N'-tris [hydroxymethyl] metyl-3-amino-propan-sulfonic syre (KRANER), og 2-[N'-cyclohexylamino] etan-sulfonic syre (oppgaver), med hver komponent i en siste konsentrasjon av 15 mM og inneholder 0.1 M konsentrert NaCl som støtter elektrolytt, med pH justert til pH 6 bruke NaOH og HCl. Merk: Arbeider elektrode tilkoblingen skal stikker litt under flyet spectroelectrochemical cellen øverst (~0.1 mm) å sikre god elektronisk tilkobling til karbon papiret (figur 2).</li>
	<li>Koble løsning innløp og utløp i spectroelectrochemical cellen til flyt inneholder peristaltiske pumpe rør og ampuller med eksperimentelle bufferen. Overføre montert cellen til "tørre" glovebox'en som inneholder spectrometer.</li>
	<li>Montere samlingen spectroelectrochemical celle på ATR tilbehøret. Koble arbeider, teller og referanse elektroder til potentiostat. Koble peristaltiske pumpe slangen på pumpen.</li>
	<li>Registrere en absorbansen spektrum med 1024 gjennomsnitt interferograms 4 cm-1 oppløsning over en spektral rekke 4000-1000 cm-1, bruker spekteret samlet i 3.4 som referanse/bakgrunn. På dette punktet spekteret skal inneholde betydelig (> 100 mO.D.) amid II band på ~ 1,540 cm-1 og aktive området band av Hyd1 bør være tydelig i de spektrale regionen 1,850-2150 cm-1, hovedsakelig i oksidert, inaktiv statene (Figur 3 ).</li>
</ol>4. aktivering av E. coli Hydrogenase 1 og Testing Spectroelectrochemical cellen
<ol><li>Bruke et redusert potensial (−0.8 V vs SCE) Hyd1 endret partikkel filmen. Mette eksperimentelle bufferen med H2 og flyt buffer sakte gjennom spectroelectrochemical cellen. La prøven overnatting fullt aktivere Hyd1. Merk: Det er viktig å bruke anaerob H2N2 etc.og så alle anaerob gasser bør sendes gjennom en O2 .</li>
	<li>Registrere en absorbansen spekteret av prøven etter aktivering. ΝCO og vCN band av det aktive området viser nå en fordeling av redusert, "aktiv" stater. Dette er mest lett observert ved hjelp av en forskjell spektrum, i forhold til spekteret i 3.10 (Figur 4).</li>
	<li>Teste tilkoblingen til spectroelectrochemical-cellen. Dette gjør mette eksperimentelle bufferen med N2 gass. Bruk en sekvens av oksiderende (0 V vs SCE) og redusere (−0.8 V vs SCE) potensialer (av ca 30 min varighet) til Hyd1-modifisert partikkel filmen og registrere en absorbansen spektrum på hver. Hyd1 bør bli raskt oksideres og redusert, og hvis partikkel filmen er godt forbundet 100% av utvalget skal svare anvendt potensial.</li>
	<li>Angi en passende strømningshastighet på eksperimentell bufferen. Dette gjelder et redusert potensial (−0.8 V vs SCE) for prøven, og Mette eksperimentelle bufferen med H2. Ta opp en serie av syklisk voltammograms mellom-0.707 - 0.039 V vs SCE frekvensen skanning av 10 mV/s. gradvis øke inntakets H2-mettet buffer mellom voltammograms til den katalytiske waveshape ligner det på en plan roterende plate elektrode55 og den maksimale strømmen er uavhengig av flow rate (figur 5). Merk: Løselighet grensen på H2 i vann er ~0.8 mM på 293 K og 1 bar.</li>
	<li>Prøven er nå klar for PFIRE mål, samle spectra på en rekke potensialene, under en rekke løsning forhold (pH, temperatur, H2 konsentrasjon etc.). Registrere alle elektrokjemiske data ved hjelp av potentiostat programvare som det er viktig å kunne koordinere spektroskopiske og elektrokjemiske data, spesielt når studere electrocatalytic prosesser som H2 oksidasjon av Hyd1.</li>
</ol>5. spektroskopiske håndtering
<ol><li>Bekreft at det aktive området ikke er permanent endret i løpet av målinger ved spectra på 0 V og −0.8 V vs SCE på slutten av eksperimentet. Disse skal være identisk til spectra registrert 4,3, og uten tap av aktive området bør være observert under målingen (figur 6).</li>
	<li>Eksportere absolutt absorbansen spectra fra spectrometer programvaren i et egnet format (CSV, ASCII 'matlab', Jcamp etc.) for behandling benytter programvare som opprinnelse eller Matlab.</li>
	<li>
Planlagte retter dataene, bruke illustrert i figur 7.
	<ol>
<li>Ta den andre deriverte av hver absorbansen spekteret i området 1800-2150 cm-1, for å identifisere liten (< 1 mO.D.) aktive området band på svært buede vann bakgrunn.</li>
		<li>Plasser planlagte markør poeng på opprinnelige absorbansen spekteret, og angi poengene festes til eksperimentelle spekteret.</li>
		<li>Passe opprinnelig plan gjennom de bruker en interpolert kubikk spline-funksjonen eller en polynom. Trekk fra denne opprinnelige funksjonen fra eksperimentelle data.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne erklære noen konkurrerende økonomisk interesse.

PFIRE er en bredt aktuelt IR spektroskopiske teknikk for adressering elektrode-immobilisert redoks proteiner. Spesielt kan electrocatalytic reaksjoner av redoks enzymer bli undersøkt under rask omsetning forhold. Metoden PFIRE bygger på direkte elektrokjemiske kontroll av teknikken av PFE, som gir ikke direkte strukturelle informasjon, og par det til IR spektroskopi på en karbon elektrode. PFIRE tilnærmingen dermed legger kjemiske innsikt til informasjonen tilgjengelig fra elektrokjemi alene og er svært egnet til å studere redoks proteiner og enzymer som er involvert i små molekyl bindende og aktivisering. I tillegg kan PFIRE gi informasjon om potensial-avhengige strukturelle endringer i proteiner i fravær av katalytisk omsetning. Slike ikke-omsetning elektron overføre hendelser er ofte vanskelig å oppdage med 'standard' programmer av PFE, men utvidelsen av PFE til Fourier-forvandlet AC voltammetry har blitt brukt med stor suksess. 45 , 46
Metoden PFIRE er, i prinsippet, til studiet av noen redoks protein som kan studeres ved hjelp av PFE. Derfor, som med PFE, protein adsorpsjon er et kritisk punkt for en vellykket PFIRE-eksperiment. Vi beskriver en anvendelse av PFIRE teknikken bruker E. coli Hyd1 som en casestudie i denne protokollen. 36 , 43 men vi har også brukt PFIRE teknikken de cytoplasmatiske regulatoriske hydrogenase fra R. eutropha,44 og flavin mononucleotide adsorbert på karbon svart. 40 i alle disse tilfellene, enkle fysiske adsorpsjon uforandret høy areal karbon svart (som beskrevet i denne protokollen) gir en dekning av protein som er høy nok til å spille god kvalitet IR spectra med en høy signal-til-støy-forhold. I tilfeller der slike høye nivåer av adsorpsjon ikke kan oppnås kan det være nødvendig å endre overflaten av karbon partikler, for eksempel kovalente vedlegg protein til elektroden overflaten. 60 , 61 , 62 bruken av en glovebox for PFIRE mål er bare strengt nødvendig når studere eksempler som må håndteres anaerob. Men i praksis det ekstremt konstant og lav (< 80 ° C duggpunkt) nivåer av vanndamp som glovebox atmosfæren gir høye signal-til-støy-nivåer at utvinning av svært små absorbances. 44 i mange tilfeller en anaerob miljø, for eksempel fra en glovebox er også ønskelig for elektrokjemiske måling (integrert med PFIRE teknikken) for å unngå gjeldende på grunn av O2 reduksjon på arbeider elektroden.
IR absorbances bulk vann, eksperimentelle buffere og karbon partikler som utvalget er adsorbert bidrar betydelig til de eksperimentelle spectra og kan overlappe band av interesse, spesielt i amid I, II og III regionene den spekteret. 63 amid regionen inneholder også informasjon fra organiske arter som flavins eller nikotinamid kofaktorer, som underlag og produkter av mange oksidering og reduksjon reaksjoner. Ved NiFe hydrogenases, νCO og νCN band av det aktive området faller i en relativt klar region av spekteret og så PFIRE teknikken er godt egnet til studiet av disse enzymene. I andre tilfeller, men kan forskjellen spectra kombinert med isotopanrikning merking tilnærminger være nødvendig å isolere endringer på grunn av immobilisert protein. Lignende tilnærminger har blitt brukt til å identifisere, for eksempel protonation endres, strukturelle rearrangements og studere Michaelis-Menten komplekser bruker IR spektroskopi. 64 , 65 , 66 PFIRE er derfor, ikke begrenset til studiet av hydrogenases men kan brukes på alle redoks protein som inneholder (eller som underlag, produkter eller hemmere inneholder) grupper med diagnostiske IR-aktiv vibrasjoner; karbonmonoksid dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40 og formiat dehydrogenases, for eksempel.
Relaterte teknikken, SEIRA, er godt egnet til studiet av membran-assosiert proteiner i biomimetic omgivelser. 32 SEIRA er en tilpasning av IR spektroskopi som også bruker en ATR-IR-konfigurasjon, og gjør bruk av en overflate ekstrautstyr effekt som forsterker IR absorbansen molekyler ligger nær (noen nm) overflaten av ATR prisme (irsk). SEIRA er derfor utsøkt sensitive til spectral endringer som oppstår innen adsorbert protein og membran arkitekturen og er relativt fri for konkurrerende signaler fra løsemiddel og underlag/hemmere finnes i løsningen. Dette er noe i kontrast til PFIRE teknikken beskrevet her som er avhengig av en betydelig større gjennomtrenging dyp over overflaten av IRE (~ 1 µm), betyr at PFIRE er mer følsomme for underlag, produkter eller hemmere finnes i løsningen. Dette økt følsomhet for "bulk" løsemiddel kan være fordelaktig; Hvis den substrat eller produktet kan observeres direkte av IR, rapport PFIRE spectra om begge steady state kinetics varige aktiv arter og tilknyttet produktet formasjon under electrocatalysis. 69 muligheten til å observere steady state konsentrasjoner av underlaget og produktet vil være spesielt verdifull for enzymer som karbonmonoksid dehydrogenase (som gir reversibel oksidasjon av CO til CO2, en sterk IR absorber) eller formiat dehydrogenase (som gir reversibel oksidasjon av formiat CO2).
I dag er PFIRE begrenset til stabil kinetic studier av enzymet electrocatalysis på grunn av makroskopisk karbon elektrodene pleide konsentrere enzymet på overflaten av en IRE for datainnsamling i og ATR-IR geometri. I denne forbindelse er PFIRE studier av NiFe hydrogenases komplementære til arbeidet med Dyer og kolleger,49,50 som bruker lys-utløst forbigående absorpsjon IR spektroskopi for å studere sub omsetning kinetics. Arbeides å miniaturize spectroelectrochemical cellen,40 og med bruk av microelectrodes tid oppløsning på mikrosekunder bør være oppnåelig. Dette vil aktivere studie av sub omsetning kinetics for enzymer med omsetning frekvenser opp til ca 100-500 s-1og gjør studiet av både reductive og kjemiske prosesser.
Samlet er PFIRE en spektroskopiske teknikk som lar kjemisk karakterisering av electrocatalytic reaksjoner av redoks enzymer under steady state forhold. PFIRE tilnærming kan flere kjemiske og elektrokjemiske titrations utføres på samme enzym prøven, som høy areal elektrodene brukes gir en robust adsorpsjon protein og ATR-IR geometri gjør lettvinte løsning utveksling. Muligheten til å samle slik strukturinformasjon i situ under enzym funksjonen er et uvurderlig verktøy for bioelectrochemistry samfunnet.

En viktig utfordring i studiet av protein funksjonen innebærer utvikling av i situ metodene som tillater direkte observasjon av proteiner utføre sine fysiologiske roller, enten i vivo eller bruke isolert protein prøver. Dette krever integrering av kontroll eller utløse prosesser i eksperimentell prosedyrer og bruk av kombinerte teknikker som tillater både den reaktivitet skal vurderes, og kjemiske enkelttrinn under protein funksjonen skal måles, samtidig. I tilfelle av redoks proteiner at dette ofte tilsvarer kombinere elektrokjemiske teknikker, som nøyaktig kontroll anvendt potensial, men gir ingen direkte kjemiske informasjon, med spektroskopiske teknikker som kjemisk-spesifikke endre forbundet med protein-funksjonen. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry er en generell term for en rekke kombinert elektrokjemiske og spektroskopiske metoder som omfatter en rekke spektroskopiske teknikker og elektrokjemiske kontrollnivåene. Mange proteiner kan utveksle elektroner med kunstige, løselig elektron givere og acceptors og dette har blitt utnyttet i studier som bruker små molekyler for å megle elektron overføring, inkludert kobling med UV-synlig,4,5 , 6 , 7 magnetiske sirkulære dichroism8 og infrarød5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. I noen tilfeller har det vist mulig å utnytte unmediated, diffusjon-kontrollert elektron utveksling mellom proteiner og elektroder. 15 , 16
For katalytisk reaksjoner utført av redoks enzymer, løsning elektrokjemi tilnærminger finnes en klar ulempe. Diffusjon-kontrollerte elektron overføring via redoks meklarar i løsningen er trolig bli begrense frekvensen. Informasjon om enzymet Kinetic og mekanistisk kan gå tapt, eller minst bli vanskelig å deconvolute fra diffusjon gjenstander fra experimental metoden. Direkte, unmediated elektrokjemiske kontroll er derfor et viktig verktøy for studiet av redoks proteiner og enzymer. Teknikken av protein filmen elektrokjemi (PFE) benytter elektrode-immobilisert redoks proteiner, slik at elektroner overføres direkte til eller fra redoks kofaktorer i protein som elektroden er polarisert på en rekke potensialer. 17 , 18 , 19 PFE er av spesiell verdi for studiet av oksidasjon eller reduksjon reaksjoner katalysert av redoks enzymer, som interfacial elektron overføring kan oppnås med en svært høy hastighet. For eksempel ble electrocatalytic omløpshastighet av nikkel-jern ([NiFe]) hydrogenase fra Allochromatium vinosum målt ved PFE som ca 1000-10.000 s−1 for H2 oksidering. 20 elektroden potensielle fungerer som en utløser for katalyse "på" eller "off" og electrocatalytic gjeldende rapporter om enzym aktivitet. PFE er derfor en nyttig metode for å analysere reaktivitet av komplekse enzymer som nært potensial, som reaksjoner av di-jern aktiv stedet for [FeFe]-hydrogenases med CO og O221 eller potensial-indusert inaktivering reaksjoner på hydrogenases,22 karbonmonoksid dehydrogenase,23 og andre komplekse redoks enzymer. 24
Det viktigste hinderet for kombinere spektroskopiske teknikker med direkte elektrokjemiske kontroll by av PFE oppstår i lav dekning av redoks enzymer, på 1-2 pmol cm-2 for [NiFe] hydrogenase fra A. vinosum, 20 i forhold til i situ overflaten vitenskap studier av små molekyl adsorbates på bulk metall elektroder. Dette utgjør en utfordring for følsomhet for spektroskopiske målingen. Flere spectroelectrochemical metoder er rapportert for å studere immobilisert redoks proteiner på en rekke forskjellige elektroder: UV-synlig spektroskopi på gjennomsiktig metalloksid elektroder; 25 , 26 , 27 fluorescens spektroskopi på gull elektroder; 28 , 29 overflaten forbedret infrarød absorpsjon (SEIRA) spektroskopi på gull elektroder; 30 , 31 , 32 , 33 og overflaten forbedret Raman spektroskopiske teknikker, hovedsakelig på sølv elektroder. 34 , 35
Her beskriver vi en metode for kopling PFE med IR spektroskopi, i en teknikk kjent som protein filmen infrarød elektrokjemi (PFIRE). 36 the PFIRE metoden studier redoks enzymer immobilisert på en høy areal karbon arbeider elektrode sammen med en dempes totale refleksjon IR (ATR-IR) geometri, utnytte enkel opptak av en rekke proteiner til karbon overflater. IR spektroskopi er nyttig i studier av redoks enzymer og proteiner som mange små molekyler, ligander og kofaktorer har diagnostiske absorbances som kan brukes til å vurdere reaktivitet, binding, hemming og redox. Eksempler binding av nei til jern-svovel sentre,37 studiet av flavoproteins,38,39,40 små molekyl binding til måltema sentre etc. 41 the ATR-IR geometri tillater bygging av en optimalisert tre elektrode (spectro) elektrokjemiske cellen42 og derfor gir utmerket elektrokjemiske kontroll. Løsning motstand og potensielle drift minimeres ved å plassere en referanse elektrode nær arbeider elektroden. Høy overflate telleren elektrodene brukes som er kompatible med høy electrocatalytic strøm produsert av rask enzym omsetning på arbeider elektroden. Flyten av løsning gjennom spectroelectrochemical cellen gir lettvinte kontroll over konsentrasjonen av underlag, hemmere og pH. 36 , 43 , 44 the PFIRE metoden kan derfor IR spectra å være registrert i situ under vedvarende enzymet electrocatalysis. 36 , 44 PFIRE er likeledes dugelig av kjemiske informasjon i fravær av katalytisk oppdatert43 i motsetning til PFE hvor det kan være vanskelig å trekke ut informasjon fra ikke-katalytiske prosesser i redoks enzymer. 45 , 46
Vi har vist PFIRE metoden for studiet av electrocatalytic H2 oksidasjon av [NiFe] hydrogenases, som inneholder innebygde CO og CN ligander koordinert til Fe hos en bimetall aktiv. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases er derfor spesielt godt egnet til å studere ved PFIRE. Metoden PFIRE gir informasjon om arter som er under stabil omsetning, og derfor gir avgjørende mekanistisk innsikt i tillegg til mengde litteratur på IR spektroskopi av hydrogenases uten eksperimentelle kontroll over omsetning. 47 , 48 Dyer og medarbeidere har ansatt tid-løst IR metoder å studere av NiFe hydrogenases,49,50,51 bruker en lett utløse enten bruke et lite negative potensielle skritt (via bruk løsning meglere og en "bur" elektron kilde) eller photolyse en bundet hydrid. Selv om metoden PFIRE kan foreløpig gi tid løsning å matche disse målingene,40 det tillate studie av både reductive og oksidativt katalytiske prosesser, på en rekke veldefinerte potensialer og fri fra masse transport begrensninger.
Metoden PFIRE er forskjellig fra SEIRA studier av redoks proteiner, som også bruker en ATR-IR geometri og ansette en nanoskala-sklifri metall elektrode å forbedre IR absorbansen molekyler adsorbert på elektroden overflaten. 30 SEIRA er en svært verdifull teknikk for å studere membran proteiner, særlig adsorbert på eller innenfor mimetic membran arkitekturer,32 men behovet for en metall elektrode kan begrense det underlag og hemmer omfanget på grunn av reaktivitet av elektroden støtte mot små molekyler som CO, CN-, CO2 osv. Proton reduksjon og selv montert monolayer desorpsjon kan være problematisk på metallflater på svært negativt potensialene, er1,52 selv om enzymet electrocatalysis på ubeskyttet metal elektrodene rapportert. 53 , 54 en ulempe av PFIRE i forhold til SEIRA er relativ vanskeligheten med å innlemme membran proteiner i native eller mimetic membran arkitekturer. Men gjør den relative kjemiske inertness av karbon elektrodene til konkurrerende små molekyl aktivisering reaksjoner PFIRE en glimrende teknikk for å studere enzymet electrocatalysis, spesielt i lav potensial domenet relevant for biologiske redoks prosesser som proton reduksjon av hydrogenases. 1 , 43
Målet med denne artikkelen er å innføre metoden PFIRE som en teknikk for å studere elektrode-immobilisert redoks proteiner, bruke NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) fra Escherichia coli som et eksempel. Betraktninger av prøven forberedelse, behovet for god substrat flyt og data håndtering drøftes. PFIRE er en bredt aktuelt teknikk, velegnet til studere noen redoks protein (med karakteristiske IR absorbances) som kan være adsorbert på karbon elektroder, enten direkte eller ved hjelp av overflaten endring, slik at det kan utveksle elektroner med den elektroden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">680-IR</td>
			<td style="width:167px;">with an external MCT detector</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ATR accessory</td>
			<td style="width:71px;">Pike Technologies</td>
			<td style="width:119px;">GladiATR</td>
			<td>Customised for use with a 5-reflection Si IRE</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glovebox</td>
			<td style="width:71px;">Glove Box Technology Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Custom designed &#39;wet&#39; and &#39;dry&#39; box for anaerobic sample handling and measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KBr window</td>
			<td style="width:71px;">Crystran</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Additional optics</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Components from a PM-IRRAS accessory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Silicon IRE</td>
			<td style="width:71px;">Crystal GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potentiostat</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;">Autolab PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nova 10.1</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling the potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:71px;">Williamson Manufacturing Company Ltd</td>
			<td>QL-1000-024-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pt wire</td>
			<td style="width:71px;">Surepure Chemetals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272</td>
			<td>99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon rod</td>
			<td style="width:71px;">WH Smith</td>
			<td align="right">30729209</td>
			<td>0.7 mm HB pencil lead</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbon black</td>
			<td style="width:71px;">Cabot Corporation</td>
			<td style="width:119px;">Black Pearls 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrasonic bath</td>
			<td style="width:71px;">Ultrawave</td>
			<td style="width:119px;">U100</td>
			<td>35 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC5050BK</td>
			<td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5452000018</td>
			<td>MiniSpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/9240/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HNO3</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">N/2300/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">silicone sealant</td>
			<td style="width:71px;">Cow Corning Toray Co., Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">SE 4486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon paper</td>
			<td style="width:71px;">Toray</td>
			<td style="width:119px;">TGP-H-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro 2015</td>
			<td style="width:71px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis/graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resolutions Pro 4.0</td>
			<td style="width:71px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling FTIR spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase

Forstå kjemi redox proteiner krav metoder som gir presis kontroll over redoks sentre i protein. Teknikken av protein filmen elektrokjemi, der et protein er immobilized på en elektrode underlag slik at elektroden erstatter fysiologiske elektron givere eller acceptors, har gitt funksjonelle innsikt i redoksreaksjoner på en rekke forskjellige proteiner. Kjemikalier forståelse krever elektrokjemiske kontroll kombineres med andre teknikker som kan legge ekstra strukturelle og mekanistisk innsikt. Her viser vi en teknikk, protein filmen infrarød elektrokjemi, som kombinerer protein filmen elektrokjemi med infrarød spektroskopiske utvalg av redoks proteiner. Teknikken bruker en flere-refleksjon dempes totale refleksjon geometri for å undersøke en redoks protein immobilisert på en høy areal sot elektrode. Inkorporering av denne elektroden en flyt celle kan løsningen pH eller stoff konsentrasjoner endres under mål. Dette er spesielt kraftig i adressering redoks enzymer, hvor rask katalytisk omsetning kan vedvarende og kontrollert på elektroden tillater spektroskopiske observasjon av varige mellomliggende arter i katalytisk mekanismen. Vi demonstrere teknikken med eksperimenter på E. coli hydrogenase 1 under omsetning (H2 oksidasjon) og ikke-omsetning forhold.

Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Her beskriver vi en teknikk, protein filmen infrarød elektrokjemi, hvilke innrømmer immobilisert redoks proteiner til studeres tyske under direkte elektrokjemiske føring en karbon elektrode. Infrarød spektra av et enkelt protein utvalg kan registreres på en rekke anvendt potensialer og under en rekke løsning forhold.

Protein Film infrarød elektrokjemi demonstrert for studier av H2 oksidasjon av en [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere protein-protein interaksjoner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA og CLC: CLF-en-avhengige nedregulering av CNTFRα som demonstrert ved Western Blotting, Hemming av lysosomale enzymer, og Immunocytochemistry

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Måling av proteinbinding til F-aktin ved co-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gjennomtrengende peptider å studere intracellulær Protein-protein interaksjoner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposome mål for studiet av Proton pumpe membran enzymer elektrokjemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriserer individuelle protein aggregater av infrarød Nanospectroscopy og Atomic Force mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...