Name: protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

Работа K.A.V. и P.A.A. поддержали Европейский исследовательский совет (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), инженерных и естественных наук исследовательский совет IB Катализатор премии EP/N013514/1 и биотехнологии и биологических наук исследований Совет (BB/L009722/1 и BB/N006321/1). О.в. была поддержана Ministerio де наук y Tecnologìa, Университет Коста-Рики и Линкольн колледж, Оксфорд. Авторы признают сотрудников механической мастерской (химический факультет), г-н Чарли Эванс и г-н Чарли Джонс, для оказания помощи в разработке и производстве spectroelectrochemical клетки, используемые в этой работе.

Авторы заявляют не конкурирующие финансового интереса.

PFIRE методика широко применимым ИК спектроскопических для адресации электрод прикол редокс белков. В частности электрокаталитические реакции окислительно-восстановительных ферментов может быть исследован в условиях быстрого оборота. Метод PFIRE строит на прямых электрохимических управления, представленная техника PFE, который не предоставляет прямых структурной информации и пары с ИК-спектроскопии в углеродных электродов. PFIRE подход таким образом добавляет химический анализ имеющейся информации от электрохимии самостоятельно и очень подходит для изучения редокс белков и ферментов, участвует в малые молекулы привязке и активации. Кроме того PFIRE предоставят информацию о потенциал зависимых структурные изменения в белках в отсутствие каталитических оборота. Такие события передачи электронов-оборот зачастую трудно обнаружить с помощью «стандарт» приложений PFE, хотя расширение PFE для Фурье преобразования переменного тока вольтамперометрии использовался с большим успехом. 45 , 46
Метод PFIRE является, в принципе, подходит для изучения любого редокс белков, которые могут быть изучены с помощью PFE. Таким образом как и в случае с PFE, белок адсорбции является важным шагом для успешного эксперимента PFIRE. В этом протоколе мы описывают приложение PFIRE техники, используя E. coli Hyd1 в качестве тематического исследования. 36 , 43 однако, мы также применили технику PFIRE цитоплазматических регулирования hydrogenase от р. eutropha,44 и Флавинмононуклеотид адсорбированные на углерод. 40 во всех этих случаях, простой физической адсорбции неизмененном высокой поверхности сажи (как описано в настоящем протоколе) обеспечивает поверхности покрытие белка, который является достаточно высоким, чтобы хорошее качество записи ИК спектры с высоким соотношением сигнал шум. В тех случаях, когда невозможно достичь такой высокий уровень адсорбции может быть необходимо изменить на поверхности частиц углерода, например разрешить ковалентных вложение белка на поверхности электрода. 60 , 61 , 62 бардачком для PFIRE измерений используется только строго необходимыми при изучении образцов, которые должны быть обработаны методом анаэробной очистки. Однако на практике чрезвычайно постоянной и уровней низкого (точка росы < 80 ° C) водяного пара, предоставляемый бардачком атмосфера дает высокий уровень сигнала к шуму, которые позволяют извлечение очень маленькие absorbances. 44 во многих случаях анаэробной среде, например, предоставляемый бардачком, желательно также для электрохимических измерений (неотъемлемой частью PFIRE техника) для того, чтобы избежать текущих за счет уменьшения2 O на рабочем электроде.
ИК absorbances из-за воды, экспериментальных буферов и частицы углерода, на которых адсорбированные образца все в значительной степени способствовать экспериментальные спектры и может перекрывать полос интерес, особенно в амидной I, II и III регионов спектра. 63 региона Амида также содержит информацию из органических видов, таких как flavins или никотинамид кофакторы, а также субстратов и продукции многих реакций окисления и сокращения. В случае трансгидрогеназы NiFe νCO и νCN полос на активном узле попадают в довольно ясно области спектра и так PFIRE техника очень хорошо подходит для изучения этих ферментов. В других случаях однако, разница спектров, в сочетании с изотопный маркировки подходов может быть необходимо изолировать изменения вследствие подвижности белков. Аналогичные подходы были использованы для выявления, например, изменения протонирование, структурных перестроек и учиться Михаэлиса-Menten комплексов с использованием ИК-спектроскопии. 64 , 65 , 66 PFIRE не ограничивается, поэтому, исследование трансгидрогеназы, но может быть применен к любой редокс белок, содержащий (или чьи субстратов, продукты или ингибиторы содержат) группы с диагностики ИК Активные вибрации; окиси углерода dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,флавопротеидов14 ,40 и формате дегидрогеназ, например.
Близкой методикой, SEIRA, очень хорошо подходит к изучению связанный мембранами белков в среде biomimetic. 32 SEIRA является адаптация ИК-спектроскопии, который также использует конфигурацию ATR-IR и делает использование поверхности повышение эффекта, что усиливает поглощение ИК молекул, расположенных близко к (в течение нескольких Нм) на поверхности призмы ATR (IRE). SEIRA поэтому особенно чувствительна к спектральные изменения, которые происходят в пределах адсорбированных белка и мембраны архитектуры и относительно свободны от конкурирующих сигналов от растворителя и субстратов/ингибиторы в раствор. Это отчасти в отличие от PFIRE метод, описанный здесь, которая опирается на значительно большую глубину проникновения над поверхностью IRE (~ 1 мкм), означает, что PFIRE является более чувствительным к субстратам, продуктов или ингибиторы представить в растворе. Это повышенная чувствительность к «основной» растворителя может быть выгодным; Если субстрат или продукта можно наблюдать непосредственно в ИК, PFIRE спектры доклад о обоих установившемся кинетика долгоживущих активных видов и формирования связанный продукт во время электрокатализа. 69 способность наблюдать за стационарное состояние концентрации субстрата и продукта будут особенно ценными для ферментов, таких как угарный дегидрогеназа (которая катализирует реверсивные окисления CO-CO2, сильная ИК амортизатора) или Формиат дегидрогеназа (которая катализирует реверсивные окисления Формиат CO2).
В настоящее время PFIRE ограничивается установившегося кинетические исследования фермента электрокатализа благодаря макроскопических углеродных электродов, используется для «сосредоточиться» фермента на поверхность IRE для сбора данных и ATR-IR геометрии. В этом отношении PFIRE исследования NiFe трансгидрогеназы дополняет работу Дайер и коллег,,4950 , которые используют свет срабатывает переходных поглощения ИК спектроскопии для изучения кинетики югу оборот. Чтобы уменьшить spectroelectrochemical клеток,40 ведется работа и с использованием микроэлектродов время резолюции порядка микросекунд должны быть достижимыми. Это позволит исследование кинетики югу оборота для ферментов с частотами оборот до ca s 100-500-1и даст возможность изучения восстановительной и окислительных процессов.
В целом PFIRE является спектроскопический метод, который позволяет химическая характеристика электрокаталитическая реакций окислительно-восстановительных ферментов в условиях устойчивого состояния. PFIRE подход позволяет несколько химическое и Электрохимическое титрование осуществляться на том же образце фермента, как используются электроды высокой поверхности обеспечивают надежный адсорбции белка и ATR-IR геометрии позволяет простое решение exchange. Возможность собирать такую структурную информацию на месте во время функции фермента является бесценным инструментом для более широкого сообщества bioelectrochemistry.

Ключевой задачей в изучении белков функции предполагает развитие в situ методов, которые позволяют прямого наблюдения белков, выполнении их физиологических функций, либо в естественных условиях или с помощью изолированных образцы протеина. Это требует интеграции управления или запуска процессов в экспериментальной процедуры и использования комбинированных методов, которые позволяют как реакционную способность оценить и отдельных химических шаги во время функции протеина измеряется, одновременно. В случае редокс белки это часто приравнивается к сочетания электрохимических методов, которые точно контролировать прикладной потенциал, но не дают прямой химической информации, с спектроскопических методов, которые чувствительны к химически конкретных изменения, связанные с функцией белка. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry — общий термин для ряда сопряженных электрохимических и спектральные методы, которые охватывают различные спектральные методы и уровни электрохимического контроля. Многие белки могут обмениваться с искусственным, растворимые электрона доноров и акцепторов электронов и это была использована в исследованиях, которые используют маленькие молекулы посредничать перенос электрона, включая сцепление с УФ видно,4,5 , 6 , 7 магнитных круговой дихроизма8 и ИК5,9,10,11,12,13,14 (IR) Рентгеновская спектроскопия. В ограниченном числе случаев оказалось возможным использовать безрассудной, контролируемой диффузии электронного обмена между белками и электродов. 15 , 16
Для каталитических реакций проводимых окислительно-восстановительных ферментов, решение электрохимии подходы настоящий четкий недостаток. Передачи электронно контролируемые диффузии через редокс посредников в растворе может стать ограничение скорости. Кинетические и механистические информацию о фермента может быть потеряно, или по крайней мере стать трудно deconvolute от диффузии артефакты в результате экспериментального метода. Прямые, электрохимических управления поэтому является важным инструментом для изучения редокс белков и ферментов. Техника белка фильм электрохимии (PFE) использует белки Редокс электроды прикол, таким образом, что электроны передаются непосредственно в или из кофакторов редокс внутри белка как электрод поляризовано на серию потенциалов. 17 , 18 , 19 PFE имеет особую ценность для изучения реакции окисления или сокращения, катализируемые окислительно-восстановительных ферментов, как поверхностное электрона передачи может быть достигнуто с очень высокой скоростью. Например электрокаталитические текучести hydrogenase ([NiFe]) никель железо от фолиевой vinosum был измерен PFE как ca 1000-10000 s−1 для окисления H2 . 20 электродный потенциал действует как триггер для катализа «на» или «Выкл», и текущие отчеты электрокаталитическая на активность фермента. PFE поэтому является ценным методом для анализа реактивности комплекс ферментов, которые тесно зависят от потенциала, например реакциях железо ди активного узла [FeFe]-трансгидрогеназы с CO и O2,21 или потенциал индуцированной инактивация реакции трансгидрогеназы, дегидрогеназа окиси углерода22 ,23 и других сложных окислительно-восстановительных ферментов. 24
Главным препятствием для объединения спектроскопических методов с прямых электрохимических управления, обеспечиваемой PFE обусловлена низким поверхности покрытия окислительно-восстановительных ферментов, порядка 1-2 пмоль см-2 для [NiFe] hydrogenase от A. vinosum, 20 относительно в situ исследования поверхности науки адсорбатов малых молекул на массовых металлическими электродами. Это представляет собой проблему для чувствительности спектроскопических измерений. Несколько методов spectroelectrochemical были зарегистрированы для изучения иммобилизованных редокс белков на широкий спектр различных электродов: УФ видимый спектроскопии в прозрачной окиси металла электродов; 25 , 26 , 27 флуоресцентной спектроскопии в Золотые электроды; 28 , 29 поверхности расширенной инфракрасного поглощения (SEIRA) спектроскопия в Золотые электроды; 30 , 31 , 32 , 33 и поверхности расширения спектроскопических методов Раман, главным образом на серебряных электродов. 34 , 35
Здесь мы описываем метод сцепления PFE с ИК-спектроскопии, в метод, известный как белка фильм инфракрасный электрохимии (PFIRE). 36 PFIRE метод исследования окислительно-восстановительных ферментов, иммобилизованных на большую площадь поверхности углерода рабочих электродом в сочетании с аттенуированные полного отражения IR (ATR-IR) геометрии, используя простота адсорбции целого ряда белков на поверхности углеродных. ИК-спектроскопии полезны в изучении окислительно-восстановительных ферментов и белков, как многие малые молекулы, лиганды и кофакторы диагностических absorbances, которые могут быть использованы для оценки реактивности, привязки, торможение и окислительно-восстановительного состояния. Примеры включают привязку нет центров железо сера,37 исследования необходим,38,39,40 малых молекул привязки к гема центры и т.д. 41 ATR-IR геометрии позволяет строительство оптимизированный тремя электродами (spectro) электрохимической ячейки42 и таким образом обеспечивает отличную электрохимического контроля. Решение сопротивления и потенциальных дрейф сведены к минимуму путем размещения электрод сравнения рядом рабочих электродом. Большую площадь поверхности Счетчик электроды используются которые совместимы с токами высокой электрокаталитическая производства быстро фермента оборот на рабочем электроде. Потока раствора через spectroelectrochemical клеток позволяет легким контролировать концентрацию субстратов, ингибиторы и рН. 36 , 43 , 44 PFIRE метод позволяет ИК спектры быть записанные на месте во время устойчивого фермента электрокатализа. 36 , 44 PFIRE способен также предоставление химической информации в отсутствие каталитических ток,43 , в отличие от PFE, где он может быть трудным для извлечения информации из не каталитических процессов в окислительно-восстановительных ферментов. 45 , 46
Мы продемонстрировали метод PFIRE для изучения электрокаталитическая H2 окисления [NiFe] трансгидрогеназы, которые содержат встроенные CO и CN лигандов, координируемых Фе на биметаллического активного узла. 36 , 43 , Трансгидрогеназы 44 [NiFe] поэтому особенно хорошо подходит для изучения PFIRE. Метод PFIRE предоставляет информацию о видах, которые присутствуют во время статичных оборот и таким образом обеспечивает решающую механистический понимание помимо богатства литературы ИК спектроскопии трансгидрогеназы без экспериментальной контроля за оборот. 47 , 48 Дайер и коллеги использовали время решена ИК методы для изучения NiFe трансгидрогеназы,,,495051 использование триггера света либо применить небольшой отрицательный потенциал шаг (через использование решение посредников и источник «клетке» электрона) или фотолизу связанного Гидрид. Хотя метод PFIRE не может в настоящее время обеспечивают разрешение время для соответствия этих измерений,40 он позволяет исследование восстановительной и окислительных каталитических процессов, доступны в целый ряд четко определенных потенциалов и свободной от массового транспорта ограничения.
Метод PFIRE отличается от исследования SEIRA редокс белков, которые также используют ATR-IR геометрии и использовать шероховатую наноразмерных металлическим электродом для повышения поглощения ИК молекул адсорбироваться на поверхности электрода. 30 SEIRA является чрезвычайно полезен для изучения мембранных белков, в частности адсорбированные на или в пределах подражательный мембраны архитектуры,32 , но потребность в металлический электрод может ограничить субстрата и АБС битор благодаря реактивности электрод поддержки к малых молекул, таких, как CO, CN–, CO2 и т.д. Протон сокращения и собственн-собранные монослоя десорбции могут быть проблематичными на металлических поверхностях на весьма негативные потенциалы,1,52 хотя фермента электрокатализа на незащищенные металлические электроды сообщалось. 53 , 54 недостатком PFIRE относительно SEIRA является относительная трудность включения мембранных белков в родной или миметические мембраны архитектуры. Однако относительная химическая инертность углеродных электродов для конкурирующих реакций активации малые молекулы делает PFIRE отличную технику для изучения электрокатализа фермента, особенно в области низкопродуктивных отношение к биологической окислительно-восстановительные процессы, такие как Протон сокращения трансгидрогеназы. 1 , 43
Целью этой статьи является ознакомление PFIRE метод как метод для изучения белков Редокс электроды прикол, используя NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) от кишечной палочки в качестве примера. Обсуждаются вопросы пробоподготовки, требование, хороший субстрат потока и обработки данных. PFIRE является широко применимым методом, хорошо подходит для изучения любой редокс белок (с характерным IR absorbances), который может адсорбироваться на углеродных электродов, либо непосредственно или с помощью модификации поверхности, таким образом, что она может обмениваться электронов с электрод.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">680-IR</td>
			<td style="width:167px;">with an external MCT detector</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ATR accessory</td>
			<td style="width:71px;">Pike Technologies</td>
			<td style="width:119px;">GladiATR</td>
			<td>Customised for use with a 5-reflection Si IRE</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glovebox</td>
			<td style="width:71px;">Glove Box Technology Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Custom designed &#39;wet&#39; and &#39;dry&#39; box for anaerobic sample handling and measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KBr window</td>
			<td style="width:71px;">Crystran</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Additional optics</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Components from a PM-IRRAS accessory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Silicon IRE</td>
			<td style="width:71px;">Crystal GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potentiostat</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;">Autolab PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nova 10.1</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling the potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:71px;">Williamson Manufacturing Company Ltd</td>
			<td>QL-1000-024-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pt wire</td>
			<td style="width:71px;">Surepure Chemetals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272</td>
			<td>99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon rod</td>
			<td style="width:71px;">WH Smith</td>
			<td align="right">30729209</td>
			<td>0.7 mm HB pencil lead</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbon black</td>
			<td style="width:71px;">Cabot Corporation</td>
			<td style="width:119px;">Black Pearls 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrasonic bath</td>
			<td style="width:71px;">Ultrawave</td>
			<td style="width:119px;">U100</td>
			<td>35 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC5050BK</td>
			<td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5452000018</td>
			<td>MiniSpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/9240/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HNO3</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">N/2300/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">silicone sealant</td>
			<td style="width:71px;">Cow Corning Toray Co., Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">SE 4486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon paper</td>
			<td style="width:71px;">Toray</td>
			<td style="width:119px;">TGP-H-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro 2015</td>
			<td style="width:71px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis/graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resolutions Pro 4.0</td>
			<td style="width:71px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling FTIR spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase

Понимание химии редокс белки требования методы, которые обеспечивают точный контроль над редокс центров в рамках белка. Техника белка электрохимии фильм, в котором белок иммобилизованных на поверхности электрода, таким образом, что электрод заменяет физиологических электрона доноров и акцепторов, предоставил функциональных проницательность в окислительно-восстановительных реакций целого ряда различных белки. Полный химический понимание требует электрохимического контроля в сочетании с другими методами, которые можно добавить дополнительные структурные и механистического понимания. Здесь мы показываем, техника, белок фильм инфракрасный электрохимии, который сочетает в себе белок фильм электрохимии инфракрасную спектральные выборки редокс белков. Техника использует несколько отражение аттенуированные всего отражения геометрии зонда редокс белка, иммобилизованных на большую площадь поверхности электрода сажи. Включение этого электрода в ячейку потока позволяет рН раствора или концентрации вещества быть изменены во время измерений. Это особенно мощный в решении окислительно-восстановительных ферментов, где быстрый оборот катализатора может быть устойчивой и контролируется на электроде, позволяя спектроскопических наблюдений долгоживущих промежуточных видов в механизме катализатора. Мы продемонстрировать технику с экспериментов на E. coli hydrogenase 1 условиях оборот (H2 окисления) и не оборот.

Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Здесь мы опишем технику, белок фильм инфракрасный электрохимии, который позволяет иммобилизованных редокс белки спектроскопически изучаться под непосредственным контролем электрохимических на углеродных электродов. Инфракрасные спектры образец одного белка могут быть записаны в диапазоне прикладной потенциалов и при различных условиях решение.

Белка инфракрасный электрохимии фильм продемонстрировано [NiFe] Hydrogenase для изучения окисления2 H

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA и CLC: КТМ-1-зависимый Подавление CNTFRα в продемонстрированной Вестерн-блоттинга, ингибирование лизосомальных ферментов и иммуноцитохимию

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Измерение связывания белка с F-актином путем совместного осаждения

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Биотинилированным клеток-проникая пептиды для изучения внутриклеточный белок белковых взаимодействий

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Обнаружение мест убиквитирования белка путем обогащения пептида и масс-спектрометрии

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Характеристика индивидуальных белковых агрегатов с помощью инфракрасной наноспектроскопии и микроскопии атомной силы

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Создание высокоспецифических химически индуцированных систем димеризации белка по шагу Phage Выбор комбинаторных однодоменных антител библиотеки

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...