Name: protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

K.A.V. och P.A.A. arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), teknik och Physical Sciences Research rådet IB katalysator award EP/N013514/1, och bioteknik och biologiska vetenskaper forskning Rådet (BB/L009722/1 och BB/N006321/1). R.H. stöddes av Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, och Lincoln College, Oxford. Författarna erkänner Mr Charlie Jones, Mr Charlie Evans och personal på den mekaniska verkstaden (Institutionen för kemi) för hjälp med design och tillverkning av spektroelektrokemisk celler som används i detta arbete.

1. återskapa inre prov facket av en FTIR spektrometer inuti en anaerob, torr handskfack och allmänna experimentella krav
<ol><li>Använda en kommersiell FTIR spektrometer utrustad med en extern kvicksilver kadmium telluride (MCT) detektor och ATR tillbehör. Rensa kroppen av spektrometern med torr luft eller Kvävetetroxid, eller alternativt använda en spektrometer med en evakuerade Optisk bänk.</li>
	<li>Placera spektrometern på en stabil och vibrationsfri tabell på samma höjd som en anaerob (< 1 ppm O2), torr (daggpunkt <-75 ° C) handskfack. Avleda strålen av spektrometern i glovebox, genom en IR genomskinliga fönster som är tillräckligt stor för att rymma oskärpa balken. Obs: Det är viktigt att utrymmet mellan handskfack och spektrometer också är renade eller evakueras, speciellt om en hygroskopisk fönster material, t ex NaCl eller KBr exempelvis används.</li>
	<li>
Replikera den inre prov facket av spektrometern inuti glovebox.
	<ol>
<li>Rikta strålen inuti glovebox på en off-axeln elliptiskt spegel, helst med samma brännvidd som spektrometern inre fokuserande spegel. Obs: Det är bra att ha två ytterligare plan speglar placerade innan denna fokuserande spegel, för att möjliggöra både höjd och riktning mot strålen justeras inuti glovebox; Detta kommer att uppväga eventuella felaktigheter i inledande placeringen av spektrometern.</li>
		<li>Placera en extern MCT-detektor, komplett med en lämplig fokus optik (t.ex. ett objektiv med kort brännvidd ZnSe eller off-axeln parabolisk spegel, med en kort brännvidd) inuti glovebox, placerad såsom för att replikera dimensionerna av interna provet fack av spektrometern.</li>
		<li>Justera 'fokus' av strålen vara ungefär lika avstånd mellan de fokuserande spegeln och MCT detektorn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cool dewar av externa MCT detektorn med flytande kväve.</li>
	<li>Montera ATR tillbehöret i handskfack prov facket. Justera indata och utdata fokus optik och ATR tillbehör för att uppnå maximal genomströmning till MCT detektorn. Om nödvändigt, använda en bländare eller annan lämplig dämpning (till exempel en tråd rutnät) att förhindra oversaturation av detektorsignalen. Obs: för de data som presenteras här, en fem-reflektion ATR tillbehör med alla reflekterande optik och en flyttbar Trapetsformat Si inre reflektion elementet (IRE) används (Crystal GmbH, mått ca 5 × 8 × 1 mm3, face angle 39,5 °). IRE är monterad i en löstagbar bottenplatta som bearbetas från etereterketonplast (PEEK).</li>
	<li>Använda ett handskfack att hysa det återskapade prov facket med lämpliga feedthroughs att tillåta anslutning till ett externt inrymt potentiostat (gas snäva BNC-anslutningar är användbar för detta ändamål), gas tillgång och kablar att överföra signalen från MCT detektorn. Det är viktigt att behålla någon avskärmning på detektorn kabeln att undvika införa brus eller störningar i mätningarna.</li>
	<li>Placera en Peristaltisk pump, kan flöden som är större än 60 mL/min släpper glovebox. En schematisk vy av spektrometern, ATR tillbehör, peristaltiska pumpen och potentiostat setup visas i figur 1.</li>
	<li>Konstruera en spektroelektrokemisk cell, som det visas schematiskt i figur 2, som tätar mot ATR tillbehör. Cellen bör innehålla en hög yta counter elektrod (Pt tråd eller gasväv), en anslutning för arbetselektroden (kolfiber stav) och en miniatyr referenselektrod. Cellen måste innehålla minst två ytterligare portar som inlopp och utlopp för snabba flödet av lösningar genom cellen. Obs: En miniatyr mättade kalomelelektrod som referens är idealisk för detta ändamål. 36
</li>
</ol>2. beredning av kimrök partiklar modifierad med E. coli Hydrogenase 1
<ol><li>I ett 'vått' anaerob handskfack, blanda 20 mg hög yta kimrök partiklar (> 1 000 m3g) med 1 mL ultrahög renhet vatten (resistivitet > 18 MΩ cm) i en mikrocentrifug rör. Skingra partiklarna av lågenergi-ultraljudsbehandling (< 100 W) i minst 15 minuter, eller tills spridningen är enhetliga och gör inte sediment inom 1 h, för att ge en sotfördelningen med en lastning av cirka 20 mg/mL.</li>
	<li>
Ta en alikvot av E. coli hydrogenase 1 (Hyd1, ca 50 µL, upprättad enligt en publicerade förfarande55) vid en koncentration på ~ 7 mg protein/mL och byta ut det till en låg jonstyrka buffert vid pH nära den isoelektriska punkten (för exempel kaliumfosfat, 15 mM, pH 5.8, inget extra salt). För att uppnå bästa resultat, Använd ett enzympreparat som är så aktiv som möjligt. Utföra buffert utbyte av koncentration eller utspädning, i en centrifugal filterenhet med en lämplig molekylvikt cutoff (50 kDa fungerar bra för för Hyd1).
	<ol>
<li>Lägga till Hyd1 på filter-enheten.</li>
		<li>Späd med ca 450 µL av exchange buffert.</li>
		<li>Reconcentrate till en volym på 50 µL med mild centrifugering (< ~ 2700 × g) att förhindra oåterkalleliga nederbörd.</li>
		<li>Upprepa steg 2.2.2 och 2.2.3 tills bufferten exchange är klar (vanligtvis inom ~ 5 cykler).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blanda en 5 µL volym av 20 mg/mL sotfördelningen (förberedd i 2.1) med den 50 µL alikvoten av buffert-utbytte Hyd1. Lagra enzym-partikel blandningen i kylskåp (vid 0 ° C) över natten för att tillåta enzymet att adsorbera. Det kan vara nödvändigt att skaka blandningen då och då för att säkerställa partiklarna förbli splittrade.</li>
	<li>Tvätta Hyd1 modifierade partiklarna med låg jonstyrka buffert (kaliumfosfat, 15 mM, pH 5.8, inget extra salt) genom successiva sedimentering och återdispergering cykler i en mikrocentrifug (~ 2 700 × g). Upprepa denna procedur 3 - 5 gånger att ta bort icke-adsorberat enzym. Obs: Innan första tvätten supernatanten bör vara nästan färglös, som visar bra adsorption av enzym.</li>
	<li>Koncentrera sig partiklarna till en slutlig volym av ~ 5 µL, för att ge en sista lastning ~ 20 mg/ml av enzym-modifierade partiklar. Obs: Hyd1-modifierade partiklarna kan lagras vid 4 ° C i upp till två veckor om de förblir återfuktad; Detta uppnås bäst genom att lagra partiklar späds med ~ 50 µL av ultrahög renhet vatten.</li>
</ol>3. förberedelser för PFIRE mätningar på E. coli Hydrogenase 1
<ol><li>Rengör den Si vrede genom låg-drivna ultraljudsbehandling (< 100 W), först i H2så4 (< 90% w/w) ~ 15 min och sedan HNO3 (70% w/w) för upp till 1 tim. Här rengöringsproceduren bör leda till en hydrofil IRE yta. Om ytterligare rengöring krävs IRE kan placeras i piranha lösning (förhållandet 1:3 H2O2: H2SO4) att oxidera resterande organiskt material. Obs: Hårda sura rengöring metoder kanske inte lämplig för användning med alla IRE material. Piranha lösningen är starkt frätande och en stark antioxidant, ytor ska vara någorlunda ren innan användning av piranha lösning och vård bör vidtas under beredning och användning av piranha lösning på grund av hur exoterma processen - alltid lägga till H2O 2 långsamt till H2SO4 och hänvisa till de lämpliga säkerhetsrutiner för förberedelse, användning och bortskaffande.</li>
	<li>Spola ren IRE i ultrahög renhet vatten, och torka under en ström av torr kvävgas. Utföra alla Prisma hantering med ren pincett för att undvika kontaminering.</li>
	<li>Försegla IRE i ATR tillbehör bottenplattan med hjälp av en tunn remsa av elektriska-grade silikon. Var noga med för att begränsa tätningsmedlet till kanterna på IRE. Tillåta tätningsmedlet att torka helt.</li>
	<li>Överföra ATR tillbehör bottenplattan till spektrometer glovebox och montera det på ATR tillbehöret. Åtgärd en referens (bakgrund) spektrumet mellan 4000-1000 cm-1 på 4 cm-1 upplösning, använder standard snabbt Skanna funktionsläget av spektrometern och 1024 i genomsnitt interferograms (mättid ~ 3-5 min). Använda detta spektrum som indata så att uträkningen av absorbansen spectra senare i experimentet. Obs: På grund av små absorbansen förväntas för den Hyd1 aktiva platsen är det nödvändigt att samla in spectra med hög signal till brus nyckeltal.</li>
	<li>Överföra ATR tillbehör bottenplattan till 'vått' glovebox som innehåller färdiga Hyd1-modifierade partikel dispersion (avsnitt 2). Drop-cast en 1 µL alikvot av partikel spridningen på de stora ansiktet av IRE, och Sprid ut dem jämnt över ytan. Obs: Låt inte partiklarna att bli helt torr på IRE.</li>
	<li>Skär en bit av karbonpapper, som används som gas diffusion lager material i bränsleceller, till en storlek ~0.1 mm mindre än ytan måtten av IRE (dvs. ca. 8,2 × 4,9 mm2). Ytan på karbonpapper bör vara tillräckligt stor för att täcka drop-cast Hyd1 modifierade partiklarna, men inte så stort att överlappa silikon används för att säkra IRE. Blötlägg karbonpapper i vatten och försiktigt placera den över toppen av partikel filmen. Karbonpapper kommer att ge en bra elektrisk anslutning över hela partikel filmen. Obs: Det är fördelaktigt att förbereda flera bitar av karbonpapper i förväg och förvara dem före indränkt i ultrahög renhet vatten inuti 'vått' anaerob glovebox.</li>
	<li>Montera spektroelektrokemisk cellen (beskrivs i 1.7 och visas schematiskt i figur 2) över IRE, säkra den i bottenplattan med skruvar. Tillsätt ~ 200 µL av experimentella bufferten att hålla enzymet hydrerad. En blandad buffertsystem kan buffring över ett brett pH-område, är användbart för studier på NiFe hydrogenases:56 natriumacetat, 2-[N'-morpholino] etan-sulfonsyra (MES), N'-[2-hydroxietyl] piperazin -N' -[2-etan-sulfonsyra] (HEPES), N'-tris [hydroxymetyl] metyl-3-amino-propan-sulfonsyra (kranar), och 2-[N'-cyclohexylamino] etan-sulfonsyra (CHES), med varje komponent med en slutlig koncentration på 15 mM och innehåller 0,1 M koncentrerad NaCl som stödjande elektrolyt, med pH justerat till pH 6 med NaOH och HCl. Obs: Arbetande elektroden anslutningen ska sticka ut något under planet av spektroelektrokemisk cell toppen (~0.1 mm) för att säkerställa bra elektronisk anslutning till karbonpapper (figur 2).</li>
	<li>Anslut lösning in- och utlopp av spektroelektrokemisk cellen till ett flödessystem som innehåller peristaltiska pumpen slangar och en flaska med experimentella bufferten. Överföra monterade cellen till 'torra' glovebox innehållande spektrometern.</li>
	<li>Montera spektroelektrokemisk cell församlingen på ATR tillbehöret. Anslut arbetande, räknare och referenselektroder till potentiostaten. Anslut den peristaltiska pump slangen till pumpen.</li>
	<li>Spela en absorbans spektrum med 1024 i genomsnitt interferograms 4 cm-1 upplösning över en spektralområde 4 000-1 000 cm-1, använder spektrumet samlas i 3.4 som referens/bakgrund. På denna punkt spektrumet bör innehålla betydande (> 100 mO.D.) amide II band på ~ 1 540 cm-1 och aktiva platsen band av Hyd1 bör vara tydligt i den spektrala regionen 1,850-2,150 cm-1, till stor del i oxiderat, inaktiva staterna (figur 3 ).</li>
</ol>4. aktivering av E. coli Hydrogenase 1 och testning cellen spektroelektrokemisk
<ol><li>Tillämpa en reducerande potential (−0, 8 V vs SCE) till Hyd1-modifierade partikel film. Mätta experimentella bufferten med H2 och flöde buffert långsamt genom den spektroelektrokemisk cellen. Lämna provet över natten för att fullt ut aktivera Hyd1. Obs: Det är viktigt att använda anaerob H2, N2 etc.och så alla anaeroba gaser ska skickas genom ett O2 filter.</li>
	<li>Spela in en absorbans spektrum av provet efter aktiveringen. De νCO och vCN band av den aktiva platsen bör nu visa en fördelning av reducerad, 'aktiv' stater. Detta observeras lättast med hjälp av en skillnaden spektrum, i förhållande till det spektrum som registrerats i 3.10 (figur 4).</li>
	<li>Testa den elektriska anslutningen av spektroelektrokemisk cellen. Detta gör att mätta experimentella bufferten med N2 gas. Tillämpa en sekvens av oxiderande (0 V vs SCE) och minska (−0, 8 V vs SCE) potentialer (av ca 30 min längd) till Hyd1-modifierade partikel filma och spela in en absorbans spektrum vid varje. Hyd1 bör bli snabbt oxideras och reduceras, och om partikel filmen är väl ansluten 100% av provet bör reagera på tillämpad potential.</li>
	<li>Ställ in en lämplig flöde av experimentella bufferten. För att göra detta, applicera en reducerande potential (−0, 8 V vs SCE) till provet, och mätta experimentella bufferten med H2. Spela in en serie av cykliska voltamogrammen mellan-0.707 - 0,039 V vs SCE på en avsökningshastighet av 10 mV/s. gradvis öka flödet klassar av H2-mättade buffert mellan voltamogrammen tills den katalytiska vågform liknar det vid en planar roterande skiva elektrod55 och den maximala strömmen är oberoende av flöde (figur 5). Obs: Löslighet H2 i vatten är ~0.8 mM på 293 K och 1 bar.</li>
	<li>Eftersom provet är nu redo för PFIRE mätningar, samla spectra på en rad potentialer, enligt en rad lösning tillstånd (pH, temperatur, H2 koncentration osv). Registrera alla elektrokemiska data med programvaran potentiostat eftersom det är viktigt att kunna korrelera spektroskopiska och elektrokemiska data, speciellt när man studerar elektrokatalytiska processer såsom H2 oxidation av Hyd1.</li>
</ol>5. spektroskopiska datahantering
<ol><li>Bekräfta att den aktiva platsen inte har permanent ändrats under mätningarna av inspelning spectra vid 0 V och −0, 8 V vs SCE slutet av experimentet. Dessa bör vara identisk med spektra registreras i 4.3 och ingen förlust av aktiv plats bör observeras under mätningen (figur 6).</li>
	<li>Exportera absolut absorbansen spectra från spektrometer mjukvaran i ett lämpligt format (CSV, ASCII, 'matlab', Jcamp etc.) för bearbetning med hjälp av programvara såsom ursprung eller Matlab.</li>
	<li>
Baslinjen korrekt data, med hjälp av processen illustreras i figur 7.
	<ol>
<li>Ta andra derivatan av varje absorbansen spektrum i det intervallet 1 800-2 150 cm-1, för att identifiera små (< 1, mO.D.) aktiva platsen band mot högt-böjda vatten bakgrund.</li>
		<li>Placera baslinjen markören pekar på det ursprungliga absorbansen spektrumet och ange points to 'snap' till experimentella spektrum.</li>
		<li>Passa en originalplan genom punkter med en interpolerade kubisk spline-funktion eller ett polynom funktion. Subtrahera denna baslinje funktion från experimentella data.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

PFIRE är en allmänt tillämplig IR spektroskopisk teknik för adressering elektrod-orörlig redox proteiner. Elektrokatalytiska reaktioner av redox enzymer kan i synnerhet vara probed snabb omsättning villkor. Metoden PFIRE bygger på direkta elektrokemiska kontroll som tillhandahålls av tekniken av PFE, som ger inga direkta strukturinformation, och par det att IR spektroskopi på en kol elektroden. Metoden PFIRE således lägger kemisk insikt till tillgänglig information från elektrokemi ensam och är mycket lämpad att studera redox proteiner och enzymer involverade i liten molekyl bindning och aktivering. PFIRE kan dessutom ge information om potential beroende av strukturella förändringar i proteiner i avsaknad av katalytisk omsättning. Sådana icke-omsättning elektron överföring händelser är ofta svåra att upptäcka med hjälp av 'standard' tillämpningar av PFE, även om tillägget av PFE att Fourier-omvandlad AC voltametri har använts med stor framgång. 45 , 46
Den PFIRE metoden är, i princip, lämplig för studier av något redox-protein som kan studeras med hjälp av PFE. Därför, som med PFE, protein adsorption är ett kritiskt steg för en framgångsrik PFIRE experiment. I detta protokoll beskriver vi ett program i PFIRE teknik med E. coli Hyd1 som en fallstudie. 36 , 43 men vi har också tillämpat PFIRE tekniken att den cytoplasmiska reglerande hydrogenase från R. eutropha,44 och titulerades mononucleotide adsorberat på kimrök. 40 i alla dessa fall, enkla fysiska adsorption till oförändrad hög yta kimrök (som beskrivs i detta protokoll) ger en yttäckning av protein som är tillräckligt hög för att bra inspelningskvalitet IR spectra med högt signal-brus-förhållande. I fall där sådana höga nivåer av adsorption inte kan uppnås kan det vara nödvändigt att ändra ytan av kolpartiklar, till exempel att tillåta covalent tillbehöret av protein till elektrod ytan. 60 , 61 , 62 ett handskfack för PFIRE mätningar används endast absolut nödvändigt när man studerar prover som måste hanteras anaerobt. Men i praktiken den extremt konstant och låg (< 80 ° C daggpunkt) nivåer av vattenånga som tillhandahålls av glovebox atmosfären ger hög signal-brus-nivåer som tillåter utvinning av mycket små absorbanserna. 44 i många fall en syrefri miljö, till exempel som tillhandahålls av glovebox, är också önskvärt för elektrokemisk mätning (integrerad med tekniken som PFIRE) för att undvika nuvarande på grund av O2 minskning på arbetselektroden.
IR absorbanserna på grund av bulk vatten, experimentell buffertar och de kolpartiklar som provet är adsorberat bidrar avsevärt till de experimentella spectrana och kan överlappa band av intresse, särskilt i amiden I, II och III regioner i den Spectrum. 63 regionen amide innehåller också information från organiska arter såsom flaviner eller nikotinamid kofaktorer, såväl som substrat och produkter av många oxidation och reduktion reaktioner. När det gäller NiFe hydrogenases, νCO och νCN band av den aktiva platsen faller i en relativt tydlig region av spektrumet och så den PFIRE tekniken är mycket väl lämpad för studier av dessa enzymer. I andra fall dock kan skillnaden spectra tillsammans med isotopiska märkning metoder behövas att isolera förändringar på grund av immobiliserade proteinet. Liknande metoder har använts att identifiera, exempelvis protonation förändringar, strukturella rearrangements och studera Michaelis-Menten komplex med IR spektroskopi. 64 , 65 , 66 PFIRE begränsas inte, därför att studien av hydrogenases men kan tillämpas på något redox protein som innehåller (eller vars substrat, produkter eller hämmare innehålla) grupper med diagnostiska IR-aktiva vibrationer; kolmonoxid dehydrogeanses67 nitrogenases,68,14 andningskedjans,40 formate mellan östradiol och östron, till exempel.
Den relaterade tekniken, SEIRA, är mycket väl lämpad för studier av membran-associerade proteiner i biomimetiska miljö. 32 SEIRA är en anpassning av IR spektroskopi som också använder ett ATR-IR, och använder sig av en yta enhancement effekt som förstärker IR absorbansen av molekyler som ligger nära (inom några nm) ytan av ATR prismat (IRE). SEIRA är därför utsökt känslig för spektrala förändringar som inträffar inom den adsorberade protein och membran arkitekturen och är relativt fri från konkurrerande signaler från lösningsmedel och substrat/hämmare finns i lösningen. Detta är något i motsats till den PFIRE teknik som beskrivs här som förlitar sig på en betydligt större genomträngningsdjupet ovanför ytan av IRE (~ 1 µm), vilket innebär att PFIRE är mer känsliga för substrat, produkter eller hämmare presentera i lösning. Denna ökade känslighet för 'bulk' lösningsmedel kan vara fördelaktiga; om den substrat eller produkt kan observeras direkt av IR, rapportera PFIRE spectra om båda steady-state kinetiken för långlivat aktiva arter och associerade produkten bildandet under elektrokatalys. 69 förmåga att iaktta steady state-koncentrationer av substrat och produkten kommer att vara särskilt värdefull för enzymer såsom kolmonoxid dehydrogenas (som katalyserar reversibel oxidation av CO till CO2, en stark IR absorbator) eller formate dehydrogenas (som katalyserar reversibel oxidation av formate till CO2).
För närvarande är PFIRE begränsad till steady state kinetiska studier av enzymet elektrokatalys på grund av de makroskopiska Kolelektroder brukade 'koncentrera' enzymet på ytan av en IRE för insamlingen av uppgifter och ATR-IR geometri. I detta avseende är PFIRE studier av NiFe hydrogenases kompletterande arbete Dyer och medarbetare,49,50 som använder ljus-utlöst övergående absorption IR spektroskopi för att studera sub omsättning kinetik. Arbete pågår för att krympa den spektroelektrokemisk cellen,40 och med användning av mikroelektroder tidsupplösning på order av mikrosekunder bör uppnås. Det gör att studien av sub omsättning kinetik för enzymer med omsättning frekvenser upp till ca 100-500 s-1, och gör det möjligt att studera både reduktiv och oxidativa processer.
Sammantaget är PFIRE en spektroskopisk teknik som tillåter kemisk karakterisering av elektrokatalytiska reaktioner av redox enzymer under steady state-förhållanden. Den PFIRE metoden tillåter flera kemiska och elektrokemiska titreringar skall utföras på samma enzym prov, eftersom de höga yta elektroder används ger en robust adsorption av protein och ATR-IR geometri tillåter lättköpt lösning exchange. Förmågan att samla sådan strukturell information i situ under enzym funktion är ett ovärderligt verktyg för samhället i bioelektrokemi.

En viktig utmaning i studien av proteinfunktion innebär utveckling av i situ metoder som tillåter direkt observation av proteiner som utför sina fysiologiska roller, antingen i vivo eller använda isolerade protein prover. Detta kräver integrering av kontroll eller utlösa processer experimentella rutiner och användning av kombinerade tekniker som tillåter både reaktiviteten bedömas och enskilda kemiska steg under proteinfunktion skall mätas, samtidigt. När det gäller redox proteiner motsvarar detta ofta kombinera elektrokemiska tekniker, som exakt styr tillämpad potential men ger ingen direkt kemisk information, med spektroskopiska tekniker som är känsliga för kemiskt-specifika förändringar i samband med proteinfunktion. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry är en allmän term för en rad kopplat elektrokemiska och spektroskopiska metoder som omfattar en mängd olika spektroskopiska tekniker och elektrokemiska kontroll. Många proteiner kan utbyta elektroner med konstgjorda, lösligt Elektronoljedoseringar och acceptorer och detta har utnyttjats i studier som använder små molekyler för att medla elektronöverföring, inklusive koppling med UV-synliga,4,5 , 6 , 7 magnetisk cirkulärdichroism8 och infraröd5,9,10,11,12,13,14 (IR) spektroskopier. I ett begränsat antal fall har det visat sig möjligt att utnyttja oförmedlat, diffusion-kontrollerad elektron utbyte mellan proteiner och elektroder. 15 , 16
För katalytiska reaktioner som utförs av redox enzymer, lösning elektrokemi metoder finns en klar nackdel. Diffusion-controlled electron överföring via redox medlare i lösningen kommer sannolikt att bli hastighetsbegränsning. Kinetiska och mekanistiska information om enzymet kan förloras eller åtminstone bli svårt att deconvolute från diffusion artefakter som härrör från den experimentella metoden. Direkt och oförmedlat elektrokemiska kontroll är därför ett viktigt verktyg för studiet av redox proteiner och enzymer. Tekniken med protein film elektrokemi (PFE) sysselsätter elektrod-orörlig redox proteiner, på ett sådant sätt att elektroner överförs direkt till eller från de redox kofaktorer inom proteinet som elektroden är polariserat på en rad möjligheter. 17 , 18 , 19 PFE är av särskilt värde för studien av oxidation eller reduktion reaktioner katalyseras av enzymer som redox, gränsskiktspänning elektronöverföring kan uppnås med en mycket hög hastighet. Exempelvis mättes elektrokatalytiska Omsättningshastigheten av det nickel-järn ([NiFe]) hydrogenase från Allochromatium vinosum av PFE som ca 1.000-10.000 s−1 för H2 oxidation. 20 elektroden potentiella fungerar som en utlösare att vända katalys 'på' eller 'off', och elektrokatalytiska aktuella rapporter på enzymaktivitet. PFE är därför en värdefull metod för att analysera Reaktiviteten hos komplexa enzymer som intimt beroende av potential, såsom reaktioner av di-järn aktiva platsen för [FeFe]-hydrogenases med CO och O2,21 eller potential-inducerad inaktivering reaktioner av hydrogenases,22 kolmonoxid dehydrogenas,23 och andra komplexa redox enzymer. 24
Det främsta hindren för att kombinera spektroskopiska tekniker med direkt elektrokemiska kontroll ges av PFE uppstår från den låga yttäckning av redox enzymer, storleksordningen 1-2 pmol cm-2 för den [NiFe] hydrogenase från A. vinosum, 20 i förhållande till i situ ytan naturvetenskapliga studier av små molekyler adsorbates på bulk metallelektroderna. Detta är en utmaning för känsligheten i spectroscopic mätningen. Flera spektroelektrokemisk metoder har rapporterats för att studera orörlig redox proteiner på en rad olika elektroder: UV-synliga spektroskopi på transparent metalloxid elektroder; 25 , 26 , 27 fluorescens-spektroskopi på guld elektroder; 28 , 29 surface enhanced infraröd absorption (SEIRA) spektroskopi på guld elektroder; 30 , 31 , 32 , 33 och surface enhanced Raman spektroskopiska tekniker, främst på silver elektroder. 34 , 35
Här beskriver vi en metod för koppling PFE med IR spektroskopi, i en teknik som kallas protein film infraröd elektrokemi (PFIRE). 36 den PFIRE metoden studier redox enzymer orörlig på en hög yta kol arbetselektroden i samband med ett försvagat totala reflektans IR (ATR-IR) geometri, att utnyttja användarvänlighet adsorption av en rad proteiner på kol ytor. IR-spektroskopi är användbar i studier av redox enzymer och proteiner som många små molekyler, ligander och kofaktorer har diagnostiska absorbanserna som kan användas för att bedöma reaktivitet, bindande, hämning och redox tillstånd. Exempel: bindande av nej till järn-svavel centrerar,37 studie av andningskedjans,38,39,40 liten molekyl binder till heme centers etc. 41 ATR-IR-geometri tillåter byggandet av en optimerad tre-elektrod (spectro) elektrokemiska cellen42 och ger därför utmärkt elektrokemiska kontroll. Lösning motstånd och potentiella drift minimeras genom att placera en referenselektrod nära arbetselektroden. Höga yta counter elektroder används som är kompatibla med hög elektrokatalytiska strömmar produceras av snabb enzym omsättning på arbetselektroden. Flödet av lösning genom den spektroelektrokemisk cellen tillåter lättköpt kontroll över koncentrationen av substrat, hämmare och pH. 36 , 43 , 44 den PFIRE metoden tillåter därför IR spectra att vara inspelad i situ under ihållande enzym elektrokatalys. 36 , 44 PFIRE är också kan ge kemisk information i avsaknad av katalytisk nuvarande,43 i motsats till PFE där det kan vara svårt att utvinna information från icke-katalytiska processer i redox enzymer. 45 , 46
Vi har visat den PFIRE metoden för studien av elektrokatalytiska H2 oxidation av [NiFe] hydrogenases, som innehåller inneboende CO och CN ligander samordnas till Fe på en bimetallic aktiv webbplats. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases är därför särskilt väl lämpade att studera genom PFIRE. Metoden PFIRE ger information om de arter som är närvarande under steady state omsättning, och därför ger avgörande mekanistisk insikt förutom rikedomen av litteratur om IR spektroskopi av hydrogenases utan experimentell kontroll över omsättningen. 47 , 48 Dyer och medarbetare har sysselsatt tid-löst IR metoder för att studera av NiFe hydrogenases,49,50,51 med en ljus utlösare att antingen använda ett litet negativa potentiella steg (via användning av lösning medlare och en 'bur' elektron källa) eller photolyse en bunden hydrid. Även om metoden PFIRE kan för närvarande ge tidsupplösning att matcha dessa mätningar,40 det tillåta studie av både reduktiv och oxidativ katalytiska processer, finns på en rad väldefinierade potentialer och fri från masstransporter begränsningar.
Den PFIRE metoden är skild från SEIRA studier av redox proteiner, som också använder ett ATR-IR-geometri och anställa en nanoskala ruggas-upp metall elektroden att förbättra IR absorbans molekyler adsorberat på elektrod ytan. 30 SEIRA är en ytterst värdefull teknik för att studera membranproteiner, särskilt adsorberat på eller inom mimetiska membran arkitekturer,32 men behovet av en metall elektrod kan begränsa substrat och hämmare på grund av reaktivitet av stödet som elektrod för små molekyler som CO, CN–, CO2 osv Proton minskning och själv monterade enskiktslager desorption kan vara problematiskt på metallytor på mycket negativ potential, har1,52 även om enzym elektrokatalys på oskyddade metall elektroder rapporterats. 53 , 54 en nackdel med PFIRE i förhållande till SEIRA är relativa svårigheten att införliva membranproteiner i enhetligt eller mimetiska membran arkitekturer. Men gör den relativa kemiska tröghet av kol elektroderna till konkurrerande småmolekylära aktiveringen reaktioner PFIRE en utmärkt teknik för att studera enzym elektrokatalys, särskilt i låg-potential domänen relevanta för biologiska redox processer såsom proton minskning av hydrogenases. 1 , 43
Syftet med denna artikel är att införa metoden PFIRE som en teknik för att studera elektrod-orörlig redox proteiner, med NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) från Escherichia coli som exempel. Överväganden för provberedning, kravet på bra substrat flöde och hantering av data diskuteras. PFIRE är en allmänt tillämplig teknik, väl lämpad att studera någon redox protein (med karakteristiska IR absorbanserna) som kan vara adsorberat på Kolelektroder, antingen direkt eller med hjälp av ytmodifiering, sådan att det kan utbyta elektroner med den elektroden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">680-IR</td>
			<td style="width:167px;">with an external MCT detector</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ATR accessory</td>
			<td style="width:71px;">Pike Technologies</td>
			<td style="width:119px;">GladiATR</td>
			<td>Customised for use with a 5-reflection Si IRE</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glovebox</td>
			<td style="width:71px;">Glove Box Technology Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Custom designed &#39;wet&#39; and &#39;dry&#39; box for anaerobic sample handling and measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KBr window</td>
			<td style="width:71px;">Crystran</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Additional optics</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Components from a PM-IRRAS accessory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Silicon IRE</td>
			<td style="width:71px;">Crystal GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potentiostat</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;">Autolab PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nova 10.1</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling the potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:71px;">Williamson Manufacturing Company Ltd</td>
			<td>QL-1000-024-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pt wire</td>
			<td style="width:71px;">Surepure Chemetals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272</td>
			<td>99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon rod</td>
			<td style="width:71px;">WH Smith</td>
			<td align="right">30729209</td>
			<td>0.7 mm HB pencil lead</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbon black</td>
			<td style="width:71px;">Cabot Corporation</td>
			<td style="width:119px;">Black Pearls 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrasonic bath</td>
			<td style="width:71px;">Ultrawave</td>
			<td style="width:119px;">U100</td>
			<td>35 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC5050BK</td>
			<td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5452000018</td>
			<td>MiniSpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/9240/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HNO3</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">N/2300/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">silicone sealant</td>
			<td style="width:71px;">Cow Corning Toray Co., Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">SE 4486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon paper</td>
			<td style="width:71px;">Toray</td>
			<td style="width:119px;">TGP-H-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro 2015</td>
			<td style="width:71px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis/graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resolutions Pro 4.0</td>
			<td style="width:71px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling FTIR spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase

Förstå kemi redox proteiner krav metoder som ger exakt kontroll över redox centra inom proteinet. Tekniken med protein film elektrokemi, där ett protein är orörlig på en elektrod ytan så att elektroden ersätter fysiologiska Elektronoljedoseringar eller acceptorer, har lämnat funktionella inblick in i redoxreaktioner av en rad olika proteiner. Fullständiga kemiska förståelse kräver elektrokemiska kontroll ska kombineras med andra tekniker som kan lägga till ytterligare strukturella och mekanistiska insikt. Här visar vi en teknik, protein film infraröd elektrokemi, som kombinerar protein film elektrokemi med infraröd spektroskopiska provtagning av redox proteiner. Tekniken använder en multipel-reflektion försvagat totala reflektans geometri sond en redox protein orörlig på en hög yta kimrök elektrod. Införlivandet av denna elektrod i en flöde cell tillåter lösning pH eller Lösningens koncentration ändras under mätningarna. Detta är särskilt kraftfull i att ta itu med redox enzymer, där snabb katalytisk omsättning kan bevaras och kontrollerade på elektroden tillåter spektroskopiska observationer av långlivade mellanliggande arter i katalytiska mekanismen. Vi demonstrera tekniken med experiment på E. coli hydrogenase 1 omsättning (H2 oxidation) och icke-omsättning villkor.

Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Här, beskriver vi en teknik, protein film infraröd elektrokemi, som tillåter immobiliserade redox proteiner studeras spectroscopically under direkt kontroll av elektrokemiska på en kol elektroden. Infraröda spektra av ett enda protein prov kan registreras på ett utbud av tillämpad potentialer och under en mängd lösning villkor.

Protein Film infraröd elektrokemi visat för studie av H2 Oxidation av en [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescensanisotropi som ett verktyg för att studera protein-proteininteraktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA och CLC: CLF-1-beroende nedreglering av CNTFRa som framgår av Western blotting, Hämning av lysosomala enzymer och Immunocytochemistry

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Mätning av proteinbindning till F-aktin genom sam-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylerade Cell-penetrerande peptider att studera intracellulära Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enda Liposom mätningar för studien av Proton-pumpning membran enzymer med elektrokemi och fluorescerande mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisera enskilda protein aggregat med infraröd Nanospektroskopi och atomkraft mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...