Name: protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

K.A.V. ve P.A.A. çalışmalarını Avrupa Araştırma Konseyi (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), mühendislik ve fizik Bilimleri Araştırma Konseyi IB Catalyst Ödülü EP/N013514/1 ve Biyoteknoloji ve biyolojik bilimler araştırma tarafından desteklenmiştir Konseyi (BB/L009722/1 ve 1/N006321/BB). Hirsch "gayri resmi" de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Kosta Rika ve Lincoln College, Oxford'da tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Bay Charlie Jones, Bay Charlie Evans ve mekanik Atölyesi (Kimya bölümü) personel için tasarım ve imalatı, bu çalışmada kullanılan Spektroelektrokimyasal hücre yardım etmiş oluyorsunuz.

1. bir FTIR Spektrometre bir anaerobik, Kuru torpidoda ve genel deneysel koşullar içinde iç örnek bölmesinin yeniden
<ol><li>Bir dış Merkür kadmiyum telluride (MCT) dedektörü ve ATR aksesuar ile donatılmış bir ticari FTIR Spektrometre kullanın. Kuru hava veya diazot Spektrometre gövdesini temizlemek veya alternatif olarak bir Spektrometre ile tahliye bir optik tezgah kullanın.</li>
	<li>Bir anaerobik olarak aynı yükseklikte Spektrometre istikrarlı, titreşim içermeyen bir tablo üzerine yerleştirin (< 1 ppm O2), Kuru (çiğ noktası <-75 ° C) torpidoda. Spektrometre IR demeti ufuk ışın kapsayacak kadar geniş bir IR şeffaf pencere üzerinden torpidoda içine başka yöne çek. Not: özellikle NaCl veya KBr gibi higroskopik pencere malzeme Örneğin, kullanılırsa torpidoda ve Spektrometre arasındaki boşluğu da tasfiye veya tahliye, önemli değildir.</li>
	<li>
Spektrometre torpidoda içinde iç örnek bölmesinin çoğaltmak.
	<ol>
<li>Işını Spektrometre iç odaklanma ayna olarak aynı odak uzaklığı ile ideal bir eksen dışı ellipsoidal ayna üzerine torpidoda içinde doğrudan. Not: Yüksekliği ve torpido içinde ayarlanacak IR ışın yönünü izin vermek için bu odak ayna önce yerleştirilen iki ek düzlem aynalar yararlıdır; Bu ilk Spektrometre yerleşimini herhangi bir yanlışlık mahsup.</li>
		<li>Bir dış MCT dedektörü yer, tam ile uygun bir torpido içinde (kısa odak uzaklığı ZnSe lens veya eksen dışı parabolik ayna kısa bir odak uzaklığı ile gibi) optik odaklama konumlandırılmış gibi iç örnek boyutları çoğaltmak için Spektrometre bölmesinin.</li>
		<li>Odaklama ayna ve MCT Dedektör arasında yaklaşık olarak eşit uzaklıkta olması IR demetinin odağı ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dış MCT bulmak sıvı azot ile dewar ne yapıyorsun?</li>
	<li>ATR Aksesuar torpidoda örnek yuvası içine monte. Giriş ve çıkış optik ve ATR Aksesuar MCT Detector maksimum verim elde etmek için odaklanan hizalayın. Gerekirse, bir diyafram veya uygun diğer zayıflama (örneğin bir tel ızgara) oversaturation Dedektör sinyal engellemek için kullanın. Not: Burada, tüm yansıtıcı optik ve çıkarılabilir bir trapez Si iç yansıma öğesi (IRE) kullanılan beş-yansıma ATR aksesuarıyla sunulan veriler için (Crystal GmbH, boyutları ca 5 × 8 × 1 mm3, yüz açısı 39,5 °). IRE polieter eter keton (göz) işlenmiş çıkarılabilir bir baseplate monte edilir.</li>
	<li>Bir harici olarak yer alan potansiyostat izin vermek için uygun feedthroughs ile yeniden oluşturulmuş örnek bölme evine bir torpido kullanın (gaz sıkı BNC bağlantıları yararlı bu amaç için), gaz erişim ve kablolarını sinyal MCT aktarmak için Dedektör. Herhangi bir tanıtımı gürültü ya da müdahale ölçümleri için önlemek için Dedektör kablonun koruyucu korumak önemlidir.</li>
	<li>Peristaltik pompa, Kabil akış hızı 60 mL/dak torpidoda içinde daha büyük bir yer. Spektrometre şematik, ATR Aksesuar, Peristaltik pompa ve potansiyostat Kur şekil 1' de gösterilen.</li>
	<li>ATR mühürler Şekil 2, şematik gösterilen aksesuar gibi bir Spektroelektrokimyasal hücre oluşturmak. Hücre bir yüksek yüzey alanı counter elektrot (Pt tel veya gazlı bez), çalışma elektrot (karbon çubuk) ve bir minyatür referans elektrot için bir bağlantı içermelidir. Hücre olarak giriş ve çıkış hücre çözümleri hızlı akışı için en az iki başka bağlantı noktaları içermelidir. Not: Bir minyatür doymuş kalomel referans elektrot bu amaç için idealdir. 36
</li>
</ol>2. E. coli Hydrogenase 1 ile modifiye karbon siyah parçacıklar hazırlanması
<ol><li>Bir 'ıslak' anaerobik torpido, 20 mg yüksek yüzey alanının karbon siyah parçacıklar mix (> 1000 m3/g) 1 mL ultrahigh saflık su ile (direnci > 18 MΩ cm) bir microcentrifuge tüp. Parçacıklar tarafından düşük güç sonication dağıtmak (< 100W) en az 15 dk ya kadar dağılım üniforma ve yaklaşık 20 mg/mL bir karbon siyah dağılımı bir yükleme ile vermek değil tortu 1 h içinde yok.</li>
	<li>
~ 7 mg protein/mL konsantrasyonu E. coli hydrogenase 1 (Hyd1, yayımlanmış yordamı55göre hazırlanan yaklaşık 50 µL) bir aliquot alın ve içine bir düşük iyonik gücü arabellek (için isoelectric noktası yakın bir pH değişimi örnek potasyum fosfat, 15 mM, pH 5.8, ek tuz). En iyi sonuçları elde etmek için etkin olarak bir enzim hazırlık kullanın. Arabellek exchange (Hyd1 için de için 50 kDa çalışır) konsantrasyon ve seyreltme, uygun bir molekül ağırlığı kesme santrifüj filtre aygıtla tarafından gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Hyd1 filtre aygıt ekleme.</li>
		<li>Exchange arabellek yaklaşık 450 µL ile sulandırmak.</li>
		<li>50 µL hafif Santrifüjü kullanarak bir birime reconcentrate (< ~ 2700 × g) geri dönüşü olmayan yağış önlemek için.</li>
		<li>Arabellek exchange (genellikle ~ 5 döngü içinde) tamamlanana kadar 2.2.2 ve 2.2.3 adımları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 mg/mL 5 µL hacmi (2.1 hazır) karbon siyah dağılım arabellek değiş tokuş Hyd1 50 µL aliquot ile karıştırın. Enzim-parçacık karışımı bir buzdolabı (0 ° C'de) gecede enzim absorbe izin vermek için saklayın. Zaman zaman parçacıkları dağınık kalır emin olmak için karışım sallamak için gerekli olabilir.</li>
	<li>Bir microcentrifuge (~ 2.700 × g) birbirini izleyen sedimantasyon ve yeniden dağılım döngüleri tarafından Hyd1-modified parçacıklar düşük iyonik gücü arabelleği (potasyum fosfat, 15 mM, pH 5.8, ek tuz) ile yıkayın. Bu işlemi 3 - 5 kez tekrarlayın sigara adsorbe enzim kaldırmak için. Not: daha önce ilk yıkama süpernatant neredeyse renksiz, enzim iyi adsorpsiyon gösteren olmalıdır.</li>
	<li>~ 5 µL, son hacmiyle parçacıklar ~ 20 mg/mL enzim-modified parçacıkların son yüklenmesini vermek için konsantre ol. Not: susuz kalırsa Hyd1-modified parçacıklar 4 ° C'de iki haftaya kadar saklanabilir; Bu en iyi ~ 50 µL ultrahigh saflık su ile seyreltilmiş parçacıklar depolayarak gerçekleştirilir.</li>
</ol>3. E. coli Hydrogenase 1 PFIRE ölçümler için hazırlık
<ol><li>Si IRE düşük enerjili sonication (< 100 W), ilk olarak H2tarafından çok temiz4 (< %90 w/w) ~ 15 dakika ve sonra HNO3 (% 70 w/w) için ilâ 1 saat içinde. Bu temizlik yordamı hidrofilik bir öfke yüzeye götürmesi gerekiyor. Daha fazla temizlik gerekliyse IRE-ebilmek var olmak konulmak piranha çözümde (H2O21:3 oranında: H2SO4) kalan herhangi bir organik madde okside için kullanılır. Not: Sert asidik Temizleme yöntemleri tüm öfke malzemeler ile kullanım için uygun olmayabilir. Piranha çözüm son derece korozif ve güçlü bir oksidan, yüzeyler ve piranha çözüm sürecinin - her zaman ekzotermik olması nedeniyle Ekle H2O piranha çözüm ve bakım hazırlık sırasında alınması gereken makul temiz olmalıdır önce 2 yavaş yavaş H2SO4 ve uygun güvenlik prosedürleri hazırlık, kullanımı ve bertaraf için başvurulacak.</li>
	<li>Ultrahigh saflık su temiz IRE durulayın ve kuru azot gazı akışı altında kuru. Kirlenmesini önlemek için temiz cımbız kullanarak tüm prizma işlemenin dışarı taşımak.</li>
	<li>IRE elektrik-grade silikon dolgu macunu bir ince şerit kullanarak ATR Aksesuar baseplate mühür. Dolgu macunu IRE kenarlarını kısıtlamak için dikkat ediniz. Dolgu macunu tamamen kurumasını sağlar.</li>
	<li>ATR Aksesuar baseplate Spektrometre torpidoda aktarmak ve ATR Aksesuar monte edin. Ölçü bir başvuru (arka plan) spektrum arasında 4000-1000 cm-1 standart hızlı kullanarak 4 cm-1 çözünürlükte tarama moduna Spektrometre ve 1024 ortalama interferograms (ölçüm zaman ~ 3-5 dk). Bu yelpazenin girdi olarak hesaplama Absorbans spectra ürününün daha sonra denemeye izin vermek için kullanın. Not: Hyd1 etkin site için beklenen küçük Absorbans nedeniyle bu spectra ile yüksek sinyal gürültü oranı toplamak gereklidir.</li>
	<li>ATR Aksesuar baseplate önceden hazırlanmış Hyd1-modified parçacık dağılım (Bölüm 2) içeren 'ıslak' torpidoda aktarın. Damla-döküm IRE, parçacık dağılım büyük yüz üzerine bir 1 µL aliquot ve onları eşit yüzeyi boyunca yayıldı. Not: IRE üzerinde tamamen kuru olmak parçacıkları izin vermez.</li>
	<li>Karbon kağıdı, gaz Difüzyon tabakası malzemesi olarak Yakıt pilleri, mm IRE (Yani ca. 8.2 × 4.9 mm2) yüzey boyutları küçük bir boyut ~0.1 için kullanılan gibi bir parça kesti. Karbon kağıdı yüzey alanı damla-cast Hyd1-modified parçacıklar kapsayacak kadar büyük olmalı, ama değil çok büyük üst üste olarak silikon dolgu macunu eskiden IRE güvenli. Karbon kağıdı suda ıslatın ve yavaşça parçacık filmin üstüne yerleştirin. Karbon kağıdı tüm parçacık film arasında iyi bir elektrik bağlantısı sağlar. Not: Karbon kağıdı gibi birkaç önceden hazırlamak ve ultrahigh saflık su 'ıslak' anaerobik torpidoda içinde önceden batırılmış depolamak yararlıdır.</li>
	<li>(1,7 içinde açıklanan ve şematik Şekil 2' de gösterilen) Spektroelektrokimyasal hücre üzerinde IRE mount, içine baseplate vida ile güvenli. ~ 200 µL sulu enzim tutmak için deneysel arabelleği ekleyin. Karma arabellek sistem, bir geniş pH aralığında arabelleğe alma yeteneğine sahip NiFe hydrogenases araştırmalar yararlıdır:56 sodyum asetat, 2-[N'-morpholino] etan-sulfonic asit (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazin -N' -[2-etan-sulfonic asit] (HEPES), N'-tris [hydroxymethyl] metil-3-amino-propan-sulfonic asit (MUSLUKLAR) ve 2-[N'-cyclohexylamino] her bileşen, 15 mM son bir konsantrasyon ile etan-sulfonic asit (CHES), ve 0.1 M içeren NaCl ile pH pH 6 kullanmaya ayarlanabilir elektrolit, destek olarak NaOH ve HCl yoğunlaşmıştır. Not: Çalışan elektrot bağlantı biraz Karbon kağıdı (Şekil 2) iyi elektronik bağlantı sağlamak için Spektroelektrokimyasal hücre üst (~0.1 mm) boyutunda altında çıkıntı.</li>
	<li>Çözüm giriş ve çıkış Spektroelektrokimyasal hücrenin Peristaltik pompa boru ve deneysel arabellek bir şişe içeren bir akış sisteme bağlayın. Birleştirilmiş hücre içeren Spektrometre 'kuru' torpidoda aktarın.</li>
	<li>Spektroelektrokimyasal hücre derleme ATR Aksesuar üzerine monte. Çalışma, sayaç ve referans elektrotlar potansiyostat için bağlayın. Peristaltik pompa boru pompa bağlayın.</li>
	<li>Spektral Aralık 3.4 içinde başvuru/arka plan olarak toplanan spektrumu kullanılarak 4.000 1.000 cm-1üzerinde bir Absorbans spektrum ortalama olarak 1024 interferograms 4 cm-1 çözünürlükte ile kaydedin. Bu noktada spektrum önemli içermelidir (> 100 mO.D.) Amid II ~ 1,540 cm-1 bantları ve Hyd1 etkin site grupları spektral bölge 1,850-2150 cm-1, büyük ölçüde Devletleri'nde oksitlenmiş, etkin olmayan (şekil 3 belirgin olmalı ).</li>
</ol>4. E. coli Hydrogenase 1 ve test Spektroelektrokimyasal hücre aktivasyonu
<ol><li>Azaltılması potansiyeli (−0.8 V vs SCE) Hyd1-modified parçacık film için geçerlidir. H2 ve akış arabellek yavaş yavaş Spektroelektrokimyasal hücre aracılığıyla Deneysel önbellekle doyurmak. Örnek tamamen Hyd1 etkinleştirmek için gece bırakın. Not: Bu önemlidir anaerobik H2, N2 vbve böylece tüm anaerobik gazlar kullanmak için bir O2 süzgeci kabul edilmelidir.</li>
	<li>Örnek bir Absorbans spektrum etkinleştirmeden sonra kaydedin. νCO ve vCN etkin site grupları artık azaltılmış, 'etkin' Birleşik bir dağılımının gösterilmesi gerekir. Bu en kolay kullanımı ile 3.10 (şekil 4) kaydedilen spektrum göre bir fark spektrum görülmektedir.</li>
	<li>Spektroelektrokimyasal hücre elektrik bağlantısını sınayın. Bunu yapmak için N2 gaz ile deneysel arabellek doyurmak. Oksitleyici (0 V vs SCE) ve (−0.8 V vs SCE) potansiyelleri ( ca 30 dk süresi) Hyd1-modified parçacık filmin bir dizi uygulamak ve her bir Absorbans spektrum kaydedin. Hyd1 hızla okside olur ve azaltılmış ve parçacık film iyi bağlanmış ise % 100 örnek uygulamalı potansiyeline yapmalıdır.</li>
	<li>Uygun bir Debi deneysel arabelleği ayarlayın. Bunu yapmak için azalan bakiyeli potansiyel (−0.8 V vs SCE) için örnek uygulama ve deneysel arabellek H2ile emdirmek. -0.707 arasında çevrimsel voltammograms bir dizi kayıt - 0,039 V vs SCE 10 mV/s. tarama oranında yavaş yavaş H2akış hızı artırmak-katalitik waveshape bir düzlemsel döner benzer kadar voltammograms arasında doymuş tampon elektrot55 disk ve maksimum akım akış hızı (şekil 5) bağımsızdır. Not: H2 suda çözünürlük sınırının 293 K ve 1 bar ~0.8 mm'dir.</li>
	<li>Örnek şimdi PFIRE ölçümleri için hazır olduğu gibi spectra potansiyelleri, çözüm koşullar (pH, sıcaklık, H2 konsantrasyon vb) bir dizi altında bir mesafeden toplamak. Spektroskopik ve elektrokimyasal veri, özellikle H2 oksidasyon Hyd1 tarafından gibi electrocatalytic süreçleri okurken ilişkilendirmek önemli olduğu gibi potansiyostat yazılımı kullanarak tüm elektrokimyasal verilerini kaydeder.</li>
</ol>5. spektroskopik veri işleme
<ol><li>Etkin siteyi kalıcı olarak ölçümleri boyunca spectra 0 V ile −0.8 V vs SCE deneme sonunda kaydı tarafından değiştirilmiş değil olduğunu onaylayın. Bunlar 4,3 kaydedilen spectra için aynı olması gerekir ve aktif kaybı olmaksızın (şekil 6) ölçüm sırasında dikkat edilmelidir.</li>
	<li>Spektrometre yazılım uygun bir biçimde mutlak Absorbans spectra verilecek (.csv, ASCII, 'matlab', Jcamp vb) kökenli veya Matlab gibi yazılım kullanarak işleme.</li>
	<li>
Temel Şekil 7' de gösterilen süreci kullanarak verileri düzeltmek.
	<ol>
<li>Küçük tanımlamak için Aralık 1800-2150 cm-1içinde her Absorbans spektrum ikinci türev almak (< 1 mO.D.) aktif bantları su son derece eğimli arka planı.</li>
		<li>Temel işaret noktaları orijinal Absorbans spektrumda yerleştirin ve ' deneysel spektrum yapıştırmak ' noktaları ayarlayın.</li>
		<li>Temel bir enterpolasyonlu kübik spline işlevi veya bir polinom fonksiyon kullanarak noktaları üzerinden uygun. Bu temel işlevi deneysel verilerden çıkarma.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar rakip mali ilgi bildirin.

PFIRE Redoks elektrodu immobilize proteinler adresleme için bir genel olarak uygulanabilir IR spektroskopik tekniktir. Özellikle, electrocatalytic reaksiyonlar Redoks enzimlerin hızlı ciro koşullar altında probed. PFIRE yöntemi doğrudan yapısal bilgi sağlar ve IR spektroskopisi, karbon elektrot için çiftler PFE tekniği ile sağlanan doğrudan elektrokimyasal denetimi üzerine kurar. PFIRE yaklaşım böylece kimyasal anlayış mevcut bilgilere elektrokimya yalnız ekler ve çalışma için son derece uygundur Redoks proteinler ve enzimler dahil küçük molekül bağlama ve harekete geçirmek. Buna ek olarak, PFIRE katalitik ciro potansiyeli bağlı proteinler yokluğunda yapısal değişiklikleri hakkında bilgi sağlar. Bu tür ciro elektron transferi olayları PFE, 'standart' uygulamaları kullanarak tespit etmek zor çoğu kez PFE uzantısı Fourier dönüşüm AC voltammetry için büyük bir başarı ile. yolculuklarında uygulanmış olsa 45 , 46
PFIRE, prensip olarak, PFE kullanarak okudu herhangi bir Redoks protein çalışma için uygun bir yöntemdir. Bu nedenle, PFE gibi ile protein adsorpsiyon başarılı bir PFIRE deneme için önemli bir adım. Bu protokol için bir uygulama E. coli Hyd1 bir vaka çalışması olarak kullanarak PFIRE tekniği tarif. 36 , 43 ancak, biz de PFIRE tekniği sitoplazmik düzenleyici hydrogenase R. eutropha,44 üzerinden ve flavin karbon siyah üzerine adsorbe mononucleotide başvurdum. 40 tüm bu durumlarda, basit fiziksel adsorpsiyon değiştirilmemiş yüksek yüzey alanı karbon (Bu protokol için açıklandığı gibi) siyah bir yüzey kapsama için kayıt kaliteli IR spectra yüksek sinyal gürültü oranı ile yüksek protein sağlar. Nerede adsorpsiyon .yüksek seviyede elde edilemez durumda karbon parçacıkları, örneğin kovalent bağlanma elektrot yüzeyi protein izin vermek yüzey değiştirmek gerekli olabilir. 60 , 61 , 62 PFIRE ölçümleri için bir torpido kullanımını yalnızca anaerobik işlenmeli örnekleri okurken kesinlikle gereklidir. Ancak uygulama son derece sabit ve düşük (< 80 ° C çiğ noktası) su buharı torpidoda atmosfer tarafından sağlanan düzeylerde çok küçük absorbances çıkarma izin yüksek sinyal gürültü düzeyleri sağlar. 44 birçok durumda bir anaerobik ortamda torpidoda tarafından sağlanan gibi aynı zamanda geçerli çalışma elektrot O2 azalma nedeniyle önlemek için elektrokimyasal ölçüm (PFIRE tekniği için ayrılmaz) için istek uyandırıcı.
IR absorbances toplu su, deneysel arabellekleri ve üzerinde örnek adsorbe karbon partikülleri nedeniyle tüm önemli ölçüde deneysel spectra katkıda bulunur ve bantları örtüşme ilgi, özellikle Amid ı, II ve III bölgelerinde spektrum. 63 Amid bölge flavins veya Nikotinamid Kofaktörler, gibi yüzeylerde ve birçok oksidasyon ve Redüksiyon reaksiyonları ürünleri gibi organik türlerden bilgileri de içerir. NiFe hydrogenases, söz konusu olduğunda νCO ve νCN etkin site grupları spektrum nispeten açık bir bölgede düşer ve bu yüzden PFIRE tekniği çok iyi bu enzimlerin çalışmasına uygundur. Diğer durumlarda, ancak, fark spectra izotopik etiketleme yaklaşımlar ile birleştiğinde değişiklikleri immobilize protein nedeniyle yalıtmak için gerekli olabilir. Benzer yaklaşımlar tanımlamak, örneğin, protonation değişiklikler, yapısal düzenlemeler ve Michaelis-Menten kompleksleri IR Spektroskopi kullanarak eğitim için kullanılmıştır. 64 , 65 , 66 PFIRE bu nedenle, hydrogenases çalışma için sınırlı değildir, ancak herhangi bir Redoks protein içeren (veya olan yüzeylerde, ürün veya inhibitörleri içeren) gibi uygulanabilir grupları ile tanı IR-aktif titreşimler; karbon monoksit dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins, örneğin40 ve format dehydrogenases.
İlgili teknik, SEIRA, çok iyi membran ilişkili proteinler biomimetic ortamında incelenmesi uygundur. 32 SEIRA da bir ATR-IR yapılandırmayı kullanır ve ATR prizma (IRE) yüzeyine yakın (içinde birkaç nm) yer alan moleküllerin IR Absorbans yükselterek bir yüzey geliştirme etkisi kullanımı yapar IR spektroskopisi bir uyarlamasıdır. SEIRA bu nedenle zarif adsorbed protein ve membran mimari içinde ortaya ve nispeten solvent rakip sinyalleri arınmış spektral değişiklik duyarlıdır ve yüzeylerde/inhibitörleri çözümde mevcut. Hangi öfke yüzeyinin üzerinde önemli ölçüde daha fazla penetrasyon derinliği kullanır biraz burada açıklanan PFIRE tekniği aksine bu (~ 1 µm), PFIRE yüzeyler için daha duyarlı olduğu anlamına gelir, ürün veya inhibitörleri çözüm sunuyoruz. Bu artan duyarlılık için 'toplu' solvent avantajlı olabilir; substrat veya ürün doğrudan IR tarafından görülebilir, her iki kararlı duruma Kinetik uzun ömürlü etkin tür ve ilişkili ürün oluşumu sırasında electrocatalysis üzerinde PFIRE spectra bildirin. 69 -ecek var olmak (ki CO-CO2, güçlü bir IR emici tersinir oksidasyonunu tromboksan) karbon monoksit dehidrojenaz gibi enzimler için özellikle önemli bir substrat ve ürün kararlı duruma konsantrasyonları gözlemlemek için yetenek ya da (hangi Format CO2ters çevrilebilir oksidasyonunu tromboksan) Format dehidrogenaz.
Şu anda, PFIRE enzim electrocatalysis 'veri toplama ve ATR-IR geometri için bir öfke yüzeyinin enzim konsantre eskiden makroskopik karbon elektrotlar nedeniyle kararlı durum Kinetik çalışmalar sınırlıdır. Bu bağlamda NiFe hydrogenases PFIRE çalışmaları Dyer ve iş arkadaşları, iş alt ciro Kinetik çalışma için geçici emme ışık tetiklemeli IR spektroskopisi kullanan49,50 için tamamlayıcı niteliktedir. Çalışmaları devam Spektroelektrokimyasal hücre,40 olmak için ve microelectrodes kullanımı ile zaman çözünürlüğü mikrosaniye sırasına ulaşılabilir olmalıdır. Bu enzimler ile ca kadar ciro Frekanslar için alt ciro Kinetik incelenmesi 100-500 s-1sağlayacak ve indirgeyici ve oksidatif süreçlerinin incelenmesi sağlayacaktır.
Genel olarak, PFIRE kimyasal electrocatalytic reaksiyonlar kararlı duruma koşullar altında Redoks enzimlerin karakterizasyonu sağlar spektroskopik bir tekniktir. PFIRE yaklaşım aynı enzim örnek üzerinde yüksek yüzey alanı elektrotları sağlam adsorpsiyon protein sağlamak ve ATR-IR geometri facile çözüm geçişine izin verir gibi gerçekleştirilebilmesi birden fazla kimyasal ve elektrokimyasal titrations sağlar. Enzim fonksiyonu sırasında böyle yapısal bilgi in situ toplamak için paha biçilmez bir araç daha geniş bioelectrochemistry toplum için yeteneğidir.

Çalışmada protein işlevi, önemli bir sorun doğrudan gözlem fizyolojik rollerini, in vivo veya kullanarak taşıyan proteinlerin protein örnekleri izole izin in situ yöntem geliştirme içerir. Bu protein işlevi aynı anda ölçülen sırasında denetim veya işlemleri deneysel prosedürler ve her iki reaktivite değerlendirilmek izin kombine tekniklerin kullanılması halinde tetikleme bütünleştirilmesi ve bireysel kimyasal adımları gerektirir. Redoks proteinler durumunda bu kez kesin olarak uygulanan potansiyel kontrol ama özel için kimyasal hassas spektroskopik teknikleri ile doğrudan hiçbir kimyasal bilgi sağlamak elektrokimyasal teknikleri birleştirerek için eşittir protein fonksiyonu ile ilgili değişiklikler. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry spektroskopik teknikler ve düzeyde elektrokimyasal denetimler kapsayacak eşleşmiş elektrokimyasal ve spektroskopik yöntemleri bir dizi için genel bir terimdir. Çoğu protein yapay, çözünür elektron bağış ve alıcısı ile elektron alış verişi yapabilir ve bu çalışmalarda hangi küçük moleküller elektron transferi kavraması ile UV-görünür,4,5 de dahil olmak üzere, arabuluculuk için istismar , 6 , 7 manyetik dairesel dichroism8 ve kızılötesi5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. Sınırlı bir dizi davayı proteinler ve elektrotlar arasında unmediated, difüzyon kontrollü elektron alış verişi yararlanmaya mümkün kanıtlamıştır. 15 , 16
Katalitik reaksiyonlar için açık bir dezavantaj Redoks enzimler, çözüm elektrokimya yaklaşımlar mevcut tarafından yürütülen. Difüzyon kontrollü elektron transferi yoluyla Redoks arabulucu çözüm olmak büyük olasılıkla hızı sınırlaması. Kinetik ve mekanik enzim hakkında bilgi kayıp veya en azından deneysel yönteminden kaynaklanan Difüzyon eserler üzerinden deconvolute zor olur. Doğrudan, unmediated elektrokimyasal kontrol bu nedenle Redoks proteinler ve enzimler için önemli bir araçtır. Protein film elektrokimya (PFE) tekniği Redoks elektrodu immobilize proteinler, elektrot potansiyelleri bir dizi polarize gibi elektron doğrudan yerel bilgisayardan veya Redoks Kofaktörler protein içinde transfer edilir şekilde çalışmaktadır. 17 , 18 , 19 interfacial elektron transferi çok yüksek bir oranda elde edilebilir gibi PFE oksidasyon veya azaltma reaksiyonları katalize Redoks enzimler tarafından incelenmesi için belirli değeri var. Örneğin, nikel-demir ([NiFe]) hydrogenase Allochromatium vinosum gelen electrocatalytic Ciro oranı olarak ca 1.000 10.000 s– 1 H2 oksidasyon için PFE tarafından ölçüldü. 20 elektrot potansiyel kataliz 'on' veya 'off' ve electrocatalytic geçerli raporlar enzim aktivite için tetikleyici olarak davranır. PFE bu nedenle potansiyel reaksiyonlar [FeFe] di-demir etkin sitenin gibi yakından bağlıdır karmaşık enzimler reaktivite analiz etmek için değerli bir yöntem-CO ve O2,21 ile hydrogenases veya potansiyel kaynaklı hydrogenases,22 karbon monoksit dehidrojenaz,23 ve diğer karmaşık Redoks enzimler inactivation reaksiyonları. 24
1-2 pmol cm-2 [NiFe] hydrogenase A. vinosumgelen sırasına Redoks enzimlerin düşük yüzey kapsama PFE tarafından tanınan doğrudan elektrokimyasal kontrol spektroskopik teknikleri birleştiren için asıl engel kaynaklanmaktadır, 20 in situ yüzey bilim çalışmaları toplu metal elektrotlar üzerinde küçük molekül adsorbates göre. Bu bir meydan okuma spektroskopik ölçüm hassasiyeti sunuyor. Birkaç Spektroelektrokimyasal yöntem bildirilmiştir eğitimi için immobilize Redoks proteinler farklı elektrotlar bir mesafeden: UV-görünür spektroskopisi, şeffaf metal oksit elektrotlar; 25 , 26 , 27 Floresans spektroskopisi, altın elektrot; 28 , 29 yüzey kızılötesi emme (SEIRA) spektroskopisi altın elektrotlar, Gelişmiş; 30 , 31 , 32 , 33 ve yüzey Raman spektroskopik teknikleri, gümüş elektrotlar, prensip olarak gelişmiş. 34 , 35
Burada PFE IR spektroskopisi, protein film kızılötesi elektrokimya (PFIRE) bilinen bir tekniği ile kaplin bir yöntem açıklanmaktadır. 36 PFIRE yöntemi bir yüksek yüzey alanı karbon çalışma elektrot adsorpsiyon proteinler karbon yüzeyler üzerine bir dizi kolaylığı istismar bir zayıflatılmış toplam yansıma IR (ATR-IR) geometri ile birlikte üzerinde immobilize Redoks enzimler çalışmaları. Gibi birçok küçük moleküller, ligandlar ve Kofaktörler reaktivite, bağlama, inhibisyonu ve Redoks durumu değerlendirmek için kullanılan tanı absorbances IR spektroskopisi Redoks enzimler ve protein çalışmalarda yararlı olur. Bağlama No37 çalışma flavoproteins,38,39,40 küçük molekül heme merkezleri vbbağlama demir-kükürt merkezlerine, örnekler. 41 ATR-IR geometri inşaat bir en iyi duruma getirilmiş üç-elektrot (spectro) elektrokimyasal hücre42 ve bu nedenle mükemmel elektrokimyasal kontrol sağlar. Çözüm direnç ve potansiyel drift bir referans elektrot çalışma elektrot yakın yerleştirerek en aza indirilir. Yüksek yüzey alanı counter elektrotlar hızlı enzim ciro çalışma elektrot, tarafından üretilen yüksek electrocatalytic akımları ile uyumlu kullanılır. Solution'ı Spektroelektrokimyasal hücre akışının yüzeylerde, inhibitörleri ve pH konsantrasyon üzerinde facile kontrolü sağlar. 36 , 43 , 44 PFIRE yöntemi bu nedenle IR spectra sürekli enzim electrocatalysis sırasında kaydedilen situ içinde olmasını sağlar. 36 , 44 PFIRE Ayrıca katalitik geçerli,43 nerede Redoks enzimlerin katalitik sigara süreçleri gelen bilgileri ayıklamak zor olabilir PFE aksine yokluğunda kimyasal bilgi verebilmektedir. 45 , 46
Bimetal aktif Fe için koordine içsel CO ve CN ligandlar içeren [NiFe] hydrogenases tarafından eğitim electrocatalytic H2 oksidasyon PFIRE yöntem göstermiştir. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases bu nedenle PFIRE tarafından çalışma özellikle de uygundur. PFIRE yöntemi kararlı durum ciro sırasında mevcut türler hakkında bilgi sağlar ve bu nedenle çok önemli mekanik kavrama yanı sıra edebiyat hazinesi IR spektroskopisi, hydrogenases deneysel kontrol olmadan sağlar ciro. 47 , 48 Dyer ve ortak çalışanlar NiFe hydrogenases,49,50,ya da küçük bir negatif potansiyel adım (kullanımyolu ile uygulamak için hafif bir tetikleyici kullanma51 çalışmaya zaman çözüldü IR yöntemler çözüm arabulucu ve bir 'Kafesli' elektron kaynağı) veya photolyse bağlı Hidrit. Her ne kadar PFIRE yöntemi şu anda, bu ölçümler maç için zaman çözünürlüğü iyi tanımlanmış potansiyelleri mesafeden erişilen indirgeyici ve oksidatif katalitik işlemler çalışma izin ve toplu taşıma ücretsiz40 sağlayamaz sınırlamalar.
PFIRE yöntemi SEIRA çalışmaları da bir ATR-IR geometri kullanabilecek ve IR Absorbans moleküllerinin elektrot yüzeyinde adsorbe geliştirmek için bir Nano-pürüzlü metal elektrot istihdam Redoks proteinlerin ayrıdır. 30 SEIRA membran proteinlerinin, özellikle üzerinde adsorbe çalışmak için son derece değerli bir tekniktir veya içinde mimetic membran mimarileri,32 ama metal elektrot için ihtiyaç nedeniyle reaktivite substrat ve inhibitörü kapsam sınırlayabilirsiniz CO, CN-, CO2 vb gibi küçük moleküllerin doğru elektrot desteği Her ne kadar korumasız olarak enzim electrocatalysis elektrot metal proton azaltma ve kendi kendine monte monolayer desorpsiyon çok olumsuz potansiyelleri, metal yüzeylerde sorunlu olabilir,1,52 bildirilmiştir. 53 , 54 yerel veya mimetic membran mimarileri membran proteinlerinin birleşmeyle göreli zorluk PFIRE SEIRA göre bir dezavantajdır. Ancak, karbon elektrotlar rakip küçük molekül harekete geçirmek reaksiyonlar için göreli kimyasal hareketsizlik enzim electrocatalysis, özellikle de düşük potansiyel etki alanı için biyolojik Redoks ilgili çalışmak için mükemmel bir teknik PFIRE yapar proton azaltma tarafından hydrogenases gibi süreçleri. 1 , 43
Bu makalenin amacı Redoks elektrodu immobilize proteinler, Escherichia coli üzerinden NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) örnek olarak kullanarak eğitim için bir teknik olarak PFIRE yöntemi tanıtmaktır. Numune hazırlama, iyi yüzey akışı ve veri işleme gereksinimini konuları ele alınmıştır. PFIRE bir tekniktir geniş uygulanabilir, karbon elektrotlar de doğrudan adsorbe herhangi bir Redoks protein (ile karakteristik IR absorbances) eğitim veya yüzey modifikasyonu, öyle ki elektron ile değiştirebilirsin kullanarak uygun elektrot.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">680-IR</td>
			<td style="width:167px;">with an external MCT detector</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ATR accessory</td>
			<td style="width:71px;">Pike Technologies</td>
			<td style="width:119px;">GladiATR</td>
			<td>Customised for use with a 5-reflection Si IRE</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glovebox</td>
			<td style="width:71px;">Glove Box Technology Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Custom designed &#39;wet&#39; and &#39;dry&#39; box for anaerobic sample handling and measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KBr window</td>
			<td style="width:71px;">Crystran</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Additional optics</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Components from a PM-IRRAS accessory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Silicon IRE</td>
			<td style="width:71px;">Crystal GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potentiostat</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;">Autolab PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nova 10.1</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling the potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:71px;">Williamson Manufacturing Company Ltd</td>
			<td>QL-1000-024-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pt wire</td>
			<td style="width:71px;">Surepure Chemetals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272</td>
			<td>99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon rod</td>
			<td style="width:71px;">WH Smith</td>
			<td align="right">30729209</td>
			<td>0.7 mm HB pencil lead</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbon black</td>
			<td style="width:71px;">Cabot Corporation</td>
			<td style="width:119px;">Black Pearls 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrasonic bath</td>
			<td style="width:71px;">Ultrawave</td>
			<td style="width:119px;">U100</td>
			<td>35 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC5050BK</td>
			<td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5452000018</td>
			<td>MiniSpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/9240/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HNO3</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">N/2300/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">silicone sealant</td>
			<td style="width:71px;">Cow Corning Toray Co., Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">SE 4486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon paper</td>
			<td style="width:71px;">Toray</td>
			<td style="width:119px;">TGP-H-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro 2015</td>
			<td style="width:71px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis/graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resolutions Pro 4.0</td>
			<td style="width:71px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling FTIR spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase

Kimya Redoks üzerinde tam denetim sağlamak Redoks protein talepleri yöntemlerini anlama protein içinde ortalar. Bir elektrot yüzeyinde böyle olduğunu fizyolojik elektron bağış veya alıcısı, elektrot değiştirir bir protein immobilize neden protein film elektrokimya tekniği farklı bir dizi Redoks reaksiyonları fonksiyonel içgörü sağlamıştır proteinler. Tam kimyasal ek yapısal ve mekanik fikir ekleyebilirsiniz diğer teknikleri ile kombine olarak elektrokimyasal denetim gerektirir. Burada biz bir tekniği, protein film elektrokimya Redoks proteinler kızılötesi spektroskopik örnekleme ile birleştiren protein film kızılötesi elektrokimya göstermek. Yüksek yüzey alanı karbon siyah elektrot üzerinde immobilize bir Redoks protein yoklama için birden çok yansıma zayıflatılmış toplam yansıma geometri tekniğini kullanır. Bu elektrot birleşme bir akış hücreye çözüm pH veya çözünen konsantrasyonları ölçümleri sırasında değiştirilecek sağlar. Bu özellikle Redoks enzimler, nerede hızlı katalitik ciro sürekli ve uzun ömürlü ara türlerin spektroskopik gözlem katalitik yönteminde izin elektrot, kontrollü ele güçlüdür. Biz tekniği E. coli hydrogenase 1 ciro (H2 oksidasyon) ve ciro olmayan koşullar altında üzerinde deney ile göstermek.

Watch this Scientific Journal Video about Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase at JoVE.com

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Burada, bir tekniği, spectroscopically karbon elektrot, doğrudan elektrokimyasal kontrol altında incelenecektir immobilize Redoks proteinler sağlar protein film kızılötesi elektrokimya açıklayın. Kızılötesi spectra tek protein örneği bir mesafeden uygulanan potansiyelleri ve çözüm koşulları çeşitli altında kaydedilir.

Protein Film kızılötesi elektrokimya H2 oksidasyon çalışma için [NiFe] Hydrogenase tarafından gösterdi

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA CLC: Western Blot, lizozomal enzimlerin inhibisyonu ve immunositokimya ile gösterildiği gibi CNTFRα CLF-1 bağımlı baskılanması

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Ko-çöktürme yoluyla F-aktine Bağlı Proteinin Ölçülmesi

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma