Name: measuring synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2017-09-04T12:30:00
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우리 감사 박사 용 링 Zhu synaptophysin pHluorin2x 구조, 및 박사 제임스 E. 로스 VAMP2 phluorin를 제공 하기 위한 제공. 우리가 그들의 기술 지원 및 도움말에 대 한 박사 수잔 쳉과 버지니아 크 로커 NINDS 전자 현미경 시설의 감사합니다. 이 작품은 신경 성 질환의 국가 학회 및 미국 및 생명 공학 연구소 연구 이니셔티브 프로그램 (한국 생명 과학자 친목 프로그램), 한국 연구 학회에서에서 부여에 선 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 생명 과학, 생명 공학, 한국

참고: 다음 프로토콜 pHluorin 이미징 방법 및 교양 hippocampal 신경. pHluorin 모니터 시 냅 스 소포 단백질 통풍 관에 살아있는 세포에 사용 되는 EM 방법에 설명 하 고 그들 시 냅 스 소포의 감지 및 ultrastructural 변경.
 동물 보호 및 절차 NIH 지침을 따라와 NIH 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
 1. pHluorin 이미징 <ol><li>Hippocampal 신경 문화 <ol...

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	<li>Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+vesicle-SNARE+recycling+in+synapses+of+the+central+nervous+system.">Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system.</a> Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).</li><li>Sun, T., Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcium/calmodulin-activated+calcineurin+in+rapid+and+slow+endocytosis+at+central+synapses.">The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses.</a> J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).</li><li>Wu, X. -. S. S., Lee, S. 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L., Puchkov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin/AP-2+mediate+synaptic+vesicle+reformation+from+endosome-like+vacuoles+but+are+not+essential+for+membrane+retrieval+at+central+synapses.">Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses.</a> Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).</li><li>Wu, Y., O'Toole, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamin+1-,+dynamin+3-+and+clathrin-independent+pathway+of+synaptic+vesicle+recycling+mediated+by+bulk+endocytosis.">A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis.</a> eLife. 2014 (3), e01621 (2014).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).</li><li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. 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R., Garrett, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+artifacts+in+protein-ligand+X-ray+structures:+implications+for+the+development+of+docking+scoring+functions.">Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions.</a> J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).</li></ol>

여기 우리는 시 냅 스 소포 endocytosis를 모니터링 하기 위한 두 가지 방법을 보여 줍니다. 첫 번째 방법에서 우리 pHluorin transfected 신경에 시 냅 스 소포 단백질 융합 하 고 그 후 전기 자극을 모니터링. KCl에 의해 유도 된 둘째, 우리 EM 이미징 HRP 통풍 관의 사용. 우리는 두 가지 이유로 다른 자극을 사용. 첫째, 높은 칼륨 응용 문화에 모든 뉴런의 도발은 유도. 이 우리의 EM 방법론은 비 자극과 자극 뉴?...

신경 전달 물질 시 냅 스 소포에 저장 되며 exocytosis 발표. 시 냅 스 소포 막과 단백질은 endocytosis에 의해 내 면 그리고 exocytosis의 다음 라운드에서 다시. 시 냅 스 소포 endocytosis 시 냅 스 소포 풀을 유지 관리 하는 것이 중요 하다 고 플라즈마 막에서 튀어나온 소포를 제거 합니다. Endocytosis 시간 과정에 라이브 셀1,,23측정 하는 신랄 한 상황에서 침묵 중립 pH에 dequenched, pH에 민감한 녹색 형광 단백질 pHluorin 사용 되었습니다. PHluorin 단백질 시 냅 스 소포 단백질, synaptophysin 등 VAMP2/synaptobrevin의 lumenal 측에 일반적으로 붙어 있다. 휴식, pHluorin 시 냅 스 소포의 5.5 pH 루멘에 침묵 이다. 원형질 막에 소포 융해 노출 pH가 7.3 ~ extracellular 해결책에 기공을 루멘 pHluorin 형광에 있는 증가 결과로. Exocytosis, 뒤에 그 복구 된 소포 내 기 다시 산성화 시 냅 스 소포 단백질 endocytosis 인해 증가 형광 자연 붕괴 후 감퇴 반영 endocytosis 기공을 다시 산성화, 비록 그것은 대부분 반영 한다 endocytosis, 다시 산성화 endocytosis 대부분 조건1,4보다 빠릅니다 때문에. 다시 산성화의 시간 상수는 3-4 s 또는 더 적은5,6일반적으로 10 보다 더는 s 이상의 소포 endocytosis4,5에 필요한. 실험 다시 산성화 endocytosis를 구별 하기 위하여 필요한 경우 4-Morpholineethanesulfonic 산 (MES) 솔루션 (25 mM)를 사용 하 여 ph 5.5의 산 성 냉각 실험 시 냅 스 소포 단백질 검색할지 여부를 결정 하 사용할 수 있습니다. endocytosis1,,34를 통해 원형질 막. 따라서, pHluorin 형광 강도 증가 및 endocytosis, 균형을 반영 하 고 신경 자극 후 감소는 endocytosis에 구체적으로 반영 한다.
pHluorin 이미징 뿐만 아니라 endocytosis, 시간 과정 뿐만 아니라 시 냅 스 소포 풀7,8의 크기를 측정 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 갖는 릴리스 자발적인 가능성이 릴리스9. 많은 요인과 단백질 endocytosis, 칼슘, 수용 성 NSF 부착 단백질 수용 체 (올 무) 단백질, 두뇌 파생 된 neurotrophic factor(BDNF) calcineurin 등 규제에 관련 된 확인 된 pHluorin 이미징1 를 사용 하 여 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.만 주 신경에서 하지만 TIRFM17신경 세포에서 신경 전달 물질의 릴리스를 검출 될 수 또한. 최근, pHTomato, mOrange, dsRed, pHluorin 변종 단일 시 냅 스18,19에서 여러 요인의 동시 녹음을 모니터링 하기 위한 개발 되었다. 예를 들어 pHTomato 되어 synaptophysin 융합과 연 접 소포 융해와 Ca2 + 유입 postsynaptic 구획20에서 유전자 인코딩된 칼슘 표시기 (GCaMP5K)와 함께 사용. 따라서, pHluorin 시 냅 스 단백질에 부착 된 endocytosis 및 exocytosis 사이의 관계를 분석 하는 유용한 방법을 제공 합니다.
그들은 일반적으로 endocytosis endocytosis 동안 ultrastructural 변화를 보여주는 높은 공간 해상도 인해 공부 하는 데 사용 하는 또 다른 방법은. 2 개의 일반적인 신경 세포21 내 병 적인 변화를 시각화 하 고 소포 단백질22를 추적 하는 기능입니다. 특히, 시 냅 스 소포 통풍 관, 막 곡률의 관찰 periactive 영역에서 clathrin으로 코팅 하 고 endosomal 구조는 그들3,,2324,25 가능 ,26,,2728. EM 정착 액 유도 기형 등의 잠재적인 아티팩트를 포함 하는 동안 endocytosis, 영향을 줄 수 있는 그리고 데이터 분석은 노동 집약, 세포의 구조를 시각화 하는 매력적인 기회를 제공 하는 해상도. 통 문제 및 EM 시간적 해상도 제한 동결, endocytosis27중 섬세 한 구조를 안정화의 빠르고 비 화학 제품 방법을 제공 하는 높은 압력에 의해 극복할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lipofectamine LTX with Plus</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15338-100</td>
			<td>Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Growth medium for neuron, Warm up to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Gradient for neuronal differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Gradient for neuronal culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine coated coverslip</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-25-pdl</td>
			<td>Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin XI from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1005</td>
			<td>Neuronal culture-digest hippocampal tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td>Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulse stimulator</td>
			<td>A-M systems</td>
			<td>model 2100</td>
			<td>Apply electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted bath with field stimulation</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-21BRFS</td>
			<td>Apply electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stimulus isolation unit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SIU102</td>
			<td>Apply electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lubricant</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>111</td>
			<td>pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3693</td>
			<td>Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>190</td>
			<td>Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-HGFI</td>
			<td>Metal halide light source for pHluorin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3</td>
			<td>pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td>Software for imaging acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>Igor pro</td>
			<td>Software for imaging analysis and data presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC21B</td>
			<td>pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4832</td>
			<td>Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase(HRP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td>Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine(DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8001</td>
			<td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16365</td>
			<td>Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>200CX</td>
			<td>Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD digital camera</td>
			<td>AMT</td>
			<td>XR-100</td>
			<td>Electron microscopy, capturing images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>16707235</td>
			<td>Electron microscopy, grid staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons

Endocytosis, 동안 융합된 시 냅 스 소포는 신경 단자, 소포 재활용 및 따라서 반복적인 신경 발생 중 시 냅 시스 전송의 유지 보수에 대 한 허용에서 검색 됩니다. 병 적인 조건에서 장애인된 endocytosis 시 냅 스 강도 및 뇌 기능 감소에 지도 한다. 여기, 우리 포유류 hippocampal 신경 문화에서 시 냅 스에서 시 냅 스 소포 endocytosis를 측정 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 등 synaptophysin VAMP2/synaptobrevin, pHluorin, 증가 하는 pH에 민감한 녹색 형광 성 단백질으로 기공을 lumenal 측면에서 시 냅 스 기공을 막 단백질을 융합 하 여 시 냅 스 소포 단백질 endocytosis를 모니터링의 형광 강도 pH로 증가합니다. Exocytosis, 동안 기공을 루멘 pH 증가, endocytosis 기공을 루멘 동안 pH는 다시 acidified. 따라서, pHluorin 형광 강도의 증가 나타냅니다 퓨전, 반면 감소의 이라는 시 냅 스 소포 단백질 endocytosis를 나타냅니다. 기록 endocytosis를 pHluorin 이미징 메서드를 사용 하 여, 우리 소포에 의해 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 통풍 관의 전자 현미경 (EM) 측정 하 여 기공을 막 endocytosis 모니터링. 마지막으로, 우리는 높은 칼륨 유도 도발은 후 다양 한 시간에 신경 터미널 막 구 덩이의 형성을 모니터링합니다. HRP 통풍 관 및 막 구 덩이 형성의 시간 과정 endocytosis의 시간 과정을 나타냅니다.

지질 캐리어 메서드를 사용 하 여, SpH 표현 hippocampal 신경에 있는 boutons (그림 1a)의 식별에 대 한 허용. 셀의 전기 자극 형광 강도 exocytosis, 그리고 증가 유도 한다. 형광 (δ)의 증가 자극 (그림 1b)를 종료 하 여 중단 됐다. 증가 형광 endocytosis 인해 느린 감소에 선행 되었다. VAMP2-pHluorin, 경우 VAMP2 자극4후는 bouton에?...

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Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

연구

신경과학

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

교양 공감 뉴런의 돌기 성장을 유도

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Immunoprecipitation 및 아실-비오틴 거래소 (아베)에 의한 양식 Hippocampal 뉴런의 단백질 Palmitoylation의 감지

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Hippocampal 슬라이스 문화의 시냅틱 단백질의 포스트 퍼가기 Immunogold 라벨링

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...