Name: measuring synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons
Uploaded: 2017-09-04T12:30:00
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Agradecemos Dr. Yong Ling Zhu prevén construir pHluorin2x synaptophysin y el Dr. James E. Rothman proporcionando VAMP2-phluorin. Agradecemos a Dr. Susan Cheng y Virginia Crocker de NINDS microscopia electrónica por su soporte técnico y ayuda. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y movimiento programa de investigación intramuros en Estados Unidos y una beca del programa de iniciativa de KRIBB en investigación (Coreano biomédico científico programa de becas), Instituto de investigación de Corea de Biociencia y biotecnología, República de Corea.

Nota: el siguiente protocolo describe los métodos de proyección de imagen de pHluorin y métodos EM en neuronas hippocampal cultivadas. pHluorin monitores vesícula sináptica proteína asimilación en las células vivas y EM detecta la absorción de la vesícula sináptica y cambios ultraestructurales.
 cuidado de los animales y procedimiento seguido las pautas de NIH y fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado de animales de NIH.
 1. pHluorin imágenes...

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	<li>Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+vesicle-SNARE+recycling+in+synapses+of+the+central+nervous+system.">Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system.</a> Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).</li><li>Sun, T., Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcium/calmodulin-activated+calcineurin+in+rapid+and+slow+endocytosis+at+central+synapses.">The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses.</a> J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).</li><li>Wu, X. -. S. S., Lee, S. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+synaptic+vesicle+reacidification+at+hippocampal+nerve+terminals.">The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals.</a> J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).</li><li>Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+phluorin-based+probes+at+hippocampal+synapses.">Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses.</a> Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).</li><li>Moulder, K. L., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reluctant+vesicles+contribute+to+the+total+readily+releasable+pool+in+glutamatergic+hippocampal+neurons.">Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).</li><li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptopHluorin.">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).</li><li>Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+a+neurobiological+theory+of+hippocampal+function:+the+role+of+synaptic+plasticity,+synaptic+tagging+and+schemas.">Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas.</a> Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).</li><li>Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+accelerates+endocytosis+of+vSNAREs+at+hippocampal+synapses.">Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses.</a> Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).</li><li>Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+endocytic+capacity+at+a+CNS+synapse.">Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse.</a> J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).</li><li>Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+activity-dependent+requirement+for+dynamin+1+in+synaptic+vesicle+endocytosis.">A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis.</a> Science. 316 (5824), 570-574 (2007).</li><li>Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).</li><li>Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIRFM+and+pH-sensitive+GFP-probes+to+evaluate+neurotransmitter+vesicle+dynamics+in+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells:+cell+imaging+and+data+analysis.">TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis.</a> J Vis Exp. (95), e52267 (2015).</li><li>Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+photostability+of+bright+monomeric+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).</li><li>Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pHTomato,+a+red,+genetically+encoded+indicator+that+enables+multiplex+interrogation+of+synaptic+activity.">pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity.</a> Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).</li><li>Leitz, J., Kavalali, E. 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(112), e54060 (2016).</li><li>Schikorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Synaptic+Vesicle+Protein+Sorting+with+Enhanced+Horseradish+Peroxidase+in+the+Electron+Microscope.">Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope.</a> High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).</li><li>Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin/AP-2+mediate+synaptic+vesicle+reformation+from+endosome-like+vacuoles+but+are+not+essential+for+membrane+retrieval+at+central+synapses.">Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses.</a> Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).</li><li>Wu, Y., O'Toole, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamin+1-,+dynamin+3-+and+clathrin-independent+pathway+of+synaptic+vesicle+recycling+mediated+by+bulk+endocytosis.">A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis.</a> eLife. 2014 (3), e01621 (2014).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+has+a+molecular+scaffolding,+not+propulsive,+role+in+presynaptic+function.">Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).</li><li>Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+pathways+of+synaptic+vesicle+retrieval+revealed+by+single-vesicle+imaging.">Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging.</a> Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).</li><li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicles+interchange+their+membrane+proteins+with+a+large+surface+reservoir+during+recycling.">Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling.</a> Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).</li><li>Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusional+spread+and+confinement+of+newly+exocytosed+synaptic+vesicle+proteins.">Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins.</a> Nat Commun. 6, 8392 (2015).</li><li>Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+activity-dependent+bulk+endocytosis+with+the+genetically-encoded+reporter+VAMP4-pHluorin.">Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin.</a> J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).</li><li>Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+vesicle+cycling+in+presynaptic+terminals+using+the+genetically+encoded+probe+synaptopHluorin.">Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).</li><li>Wisse, E., Braet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+electron+microscopy+of+human+and+other+liver.">Fixation methods for electron microscopy of human and other liver.</a> World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+Photodamage+in+Live-Cell+Microscopy.">Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>S&#248;ndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+artifacts+in+protein-ligand+X-ray+structures:+implications+for+the+development+of+docking+scoring+functions.">Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions.</a> J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).</li></ol>

Aquí muestran dos métodos para el monitoreo de endocitosis vesícula sináptica. En el primer método, supervisamos pHluorin fusionado con una proteína de la vesícula sináptica en neuronas transfected y posteriormente eléctricamente estimulados. En segundo lugar, utilizamos proyección de imagen de EM de la absorción HRP como inducidas por KCl. Utilizamos diversos estímulos por dos razones. En primer lugar, aplicación de alto potasio induce la despolarización de todas las neuronas en la cultura. Esto facilita e...

Neurotransmisores se almacenan en vesículas sinápticas y liberados por exocitosis. La membrana de la vesícula sináptica y proteína son internalizados por endocitosis y reutilizadas en la próxima ronda de exocitosis. Endocitosis de vesículas sinápticas es importante para el mantenimiento de piscinas de la vesícula sináptica y quitan vesículas que sobresale de la membrana plasmática. La pHluorin pH-sensible a la proteína verde fluorescente, que se apagó en condiciones ácidas y dequenched en un pH neutro, se ha utilizado para medir el tiempo de endocitosis cursos en viven las células1,2,3. La proteína pHluorin se une típicamente al lado de las proteínas de la vesícula sináptica, como la sinaptofisina o VAMP2/synaptobrevin lumenal. En el resto, pHluorin se apaga en el lumen de pH 5.5 de vesículas sinápticas. Fusión de la vesícula a la membrana plasmática expone el lumen vesicular a la solución extracelular donde el pH es ~ 7.3, resultando en un incremento en la fluorescencia pHluorin. Después de la exocitosis, la fluorescencia creciente decae, debido a la endocitosis de las proteínas de la vesícula sináptica seguido de acidificación la vesícula dentro de las vesículas recuperadas. Aunque el decaimiento refleja endocitosis y acidificación vesicular de nuevo, en su mayoría refleja endocitosis, porque la acidificación es más rápida que la endocitosis en la mayoría condiciones1,4. La constante de tiempo de la acidificación es 3-4 s o menos5,6, que es generalmente más rápido que los 10 s o más necesarios para la endocitosis de vesículas4,5. Si los experimentos son necesarios para distinguir la endocitosis de la acidificación, experimentos de amortiguamiento ácidos con la solución de (MES) ácida 4-Morpholineethanesulfonic (25 mM) con un pH de 5.5 pueden utilizarse para determinar si las proteínas de la vesícula sináptica se recuperan de la membrana plasmática vía endocitosis1,3,4. Así, el aumento de intensidad de fluorescencia de pHluorin refleja un equilibrio de exo y endocitosis, y la disminución después de la estimulación nerviosa refleja específicamente endocitosis.
pHluorin la proyección de imagen puede utilizarse no sólo para medir el curso temporal de la endocitosis, pero también el tamaño de la vesícula sináptica piscinas7,8, y la probabilidad de liberación evocada y espontánea libertad9. Muchos factores y proteínas implicadas en la regulación de endocitosis, tales como calcio, proteínas solubles de receptores (trampa) de la proteína del NSF-accesorio, factor(BDNF) neurotrófico derivado del cerebro y calcineurina han sido identificadas usando proyección de imagen de pHluorin1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. por otra parte, se podría detectar liberación de neurotransmisores en las neuronas no sólo primarias, sino en las células del neuroblastoma con TIRFM17. Recientemente, pHTomato, dsRed, mOrange y variantes de pHluorin fueron desarrollados para el monitoreo de grabaciones simultáneas de múltiples factores en una sola sinapsis18,19. Por ejemplo, pHTomato ha sido fusionado con synaptophysin y utilizado con un indicador de calcio genéticamente codificados (GCaMP5K) para controlar la fusión de la vesícula presináptica y Ca2 + afluencia en el compartimiento postsináptico20. Por lo tanto, pHluorin unida a las proteínas sinápticas proporciona un método útil para analizar la relación entre endocitosis y exocitosis.
EM es otro método comúnmente utilizado para el estudio de endocitosis, debido a la alta resolución espacial que muestra cambios ultraestructurales durante la endocitosis. Dos áreas generales son la capacidad de visualizar los cambios patológicos dentro de las células neuronales21 y seguir vesícula proteínas22. En particular, la observación de la absorción de la vesícula sináptica, curvatura de la membrana recubierta por clatrina de la zona de periactive y endosomal estructuras son posibles con EM3,23,24,25 ,26,27,28. Mientras que EM comprende artefactos potenciales, tales como malformaciones inducidas por el fijador, que puede afectar la endocitosis, y análisis de datos es mano de obra, que la resolución ofrece una atractiva oportunidad para visualizar la estructura celular. Posibles problemas de fijador y la limitación en la resolución temporal de EM pueden superarse por la alta presión de congelación, proporcionando un método rápido y no químicos de estabilización de las delicadas estructuras presentes durante la endocitosis27.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lipofectamine LTX with Plus</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15338-100</td>
			<td>Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Growth medium for neuron, Warm up to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Gradient for neuronal differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Gradient for neuronal culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine coated coverslip</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-25-pdl</td>
			<td>Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin XI from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1005</td>
			<td>Neuronal culture-digest hippocampal tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td>Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulse stimulator</td>
			<td>A-M systems</td>
			<td>model 2100</td>
			<td>Apply electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted bath with field stimulation</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-21BRFS</td>
			<td>Apply electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stimulus isolation unit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SIU102</td>
			<td>Apply electrical stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lubricant</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>111</td>
			<td>pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3693</td>
			<td>Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>190</td>
			<td>Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>C-HGFI</td>
			<td>Metal halide light source for pHluorin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3</td>
			<td>pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td>Software for imaging acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>Igor pro</td>
			<td>Software for imaging analysis and data presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC21B</td>
			<td>pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-l-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4832</td>
			<td>Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase(HRP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6782</td>
			<td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td>Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine(DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8001</td>
			<td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16365</td>
			<td>Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>200CX</td>
			<td>Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD digital camera</td>
			<td>AMT</td>
			<td>XR-100</td>
			<td>Electron microscopy, capturing images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>16707235</td>
			<td>Electron microscopy, grid staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring synaptic vesicle endocytosis in cultured hippocampal neurons

Durante la endocitosis, vesículas sinápticas fundidas se recuperan en los terminales del nervio, permitiendo para el reciclaje de la vesícula y así el mantenimiento de la transmisión sináptica durante la cocción del repetidor del nervio. Endocitosis deteriorada en condiciones patológicas conduce a disminuciones en las funciones de cerebro y fuerza sinápticas. Aquí, describimos los métodos utilizados para medir la endocitosis de vesículas sinápticas en la sinapsis hippocampal mamífera en cultivo neuronal. Supervisamos la endocitosis de la proteína de la vesícula sináptica mediante la fusión de una proteína de la membrana vesicular sináptica, incluyendo synaptophysin y VAMP2/synaptobrevin, en el lado lumenal de vesicular, con pHluorin, una proteína fluorescente verde sensibles al pH que aumenta su intensidad de fluorescencia como el pH aumenta. Durante la exocitosis, pH del lumen vesicular aumenta, mientras que durante lumen vesicular endocitosis es acidificado a pH. Así, un aumento de la intensidad de la fluorescencia pHluorin indica fusión, mientras que indica que una disminución de la endocitosis de la proteína de la vesícula sináptica con. Además de utilizar el método de proyección de imagen de pHluorin para grabar endocitosis, supervisamos endocitosis la membrana vesicular por microscopia electrónica (EM) medidas de la absorción de peroxidasa (HRP) de rábano por vesículas. Por último, controla la formación de hoyos de membrana terminal del nervio en las varias horas después de la despolarización inducida por potasio alto. El curso del tiempo de formación de HRP absorción y membrana pit indica el curso del tiempo de endocitosis.

Usando el método del portador lípido, SpH se expresó en neuronas hipocampales, lo que permite la identificación de los botones (Figura 1a). Estimulación eléctrica de las células inducido por exocitosis y un correspondiente aumento en la intensidad de la fluorescencia. El aumento de fluorescencia (ΔF) fue detenido por fin el estímulo (Figura 1b). El aumento de la fluorescencia fue seguida por un lento descenso, debido a l...

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Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Endocitosis de vesículas sinápticas se detectan por microscopia ligera de pHluorin fusionado con la proteína de la vesícula sináptica y por microscopia electrónica de la absorción de la vesícula.

Medición de endocitosis vesícula sináptica en neuronas Hippocampal cultivadas

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

El estudio de Piscinas vesícula sináptica con fotoconversión de tintes estirilo

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Investigación

Neurociencias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Análisis cuantitativo de Reposición Synaptic piscina vesículas en cultivos de neuronas granulares del cerebelo con tintes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Ensayo de daño del ADN en las neuronas del hipocampo utilizando el ensayo cometa

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

El examen de la vesícula sináptica Reciclaje utilizando tintes FM Durante Evocados, espontánea, y actividades sinápticas miniatura

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...