Name: new methods to study gustatory coding
Uploaded: 2017-06-29T15:00:00
Duration: 10 min 59 s
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Diese Arbeit wurde von einem intramuralen Stipendium von NIH-NICHD an MS unterstützt. Wir danken G. Dold und T. Talbot von der NIH-NIMH Instrumentation Core Facility für die Unterstützung bei der Gestaltung des Tastant Delivery Systems.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebenen Verfahren erlauben in vivo Aufnahmen von einem relativ einfachen Tier, Manduca sexta , um die Aktivität mehrerer, zufällig ausgewählter GRNs über lange Zeitdauern (für mehr als 2 h) vor, während und nach der Tastantlieferung zu charakterisieren. Diese Methoden erlauben auch die schnelle, sequentielle Abgabe von mehrfachen Taststimuli mit präziser zeitlicher Kontrolle, Vorteile, die für das Studium von neuronalen Mechanismen, die einer schmackhaften Repräsentation zugrunde liegen, nützlich sind. Dieses Protokoll wurde verwendet, um zu untersuchen, wie die Reaktionen von GRNs auf Geschmackstoffe transformiert werden, wenn sie auf ihre postsynaptischen Zielneuronen ( z. B. in der SEZ) übertragen werden, indem sie GRNs gleichzeitig mit monosynaptisch verbundenen Interneuronen überwachen. Darüber hinaus können diese Methoden an die Bedürfnisse des Experimentators angepasst werden, so dass die Durchführung von komplexen Paradigmen grundlegende Aspekte der gustatory Codierung zu studieren. Wenn anfangsG unsere Studien, ein technisches Problem, das wir manchmal zu beheben hatten, war die Unfähigkeit, Spiking-Signale aus N. maxillaris mit den Tetrodendrähten zu erkennen. Mögliche Ursachen dafür sind vielfältig, da das Dissektionsprotokoll anspruchsvoll ist und manche Praxis notwendig ist, um eine gute Vorbereitung zu erhalten. Zuerst werden während der Motten-Sezierung die Oberkiefer-Nerven leicht zu beschädigen, besonders während der Entfernung der Hülle, die das Nervengewebe umgibt. Zweitens, wenn die Scheide nicht vollständig entfernt wird, können die Tetrodendrähte nicht in der Lage sein, auf den Nerv zuzugreifen. In beiden Fällen ist das Starten einer neuen Vorbereitung oft der einfachste Weg, um diese Probleme zu lösen. Drittens kann es ein Problem mit den Tetrodendrähten geben. Dies kann durch Messung der Impedanz der Drähte, die ~ 270 kΩ bei 1kHz sein sollte, überprüft werden. Wenn der Impedanzwert über ~ 300 kΩ liegt, galvanisieren Sie die Drähte mit Gold, um die gewünschte Impedanz zu erreichen (siehe Referenz 30 ). Viertens kann ein Gerät verkürzt werdenOder fehlerhaft Ein weiteres mögliches Problem ist, dass spiking Signale aufgezeichnet werden, aber die Neurone (n) erscheinen unempfänglich für die Tastamente. Dies könnte daran liegen, dass die aufgezeichneten Neuronen unempfindlich gegenüber dem gelieferten Geschmack sind. Auch ist wichtig zu beachten, dass zusätzlich zu den Axonen der GRNs der N. maxillaris auch mechanosensorische Fasern trägt. So ist es möglich, von mechanosensorischen Neuronen anstelle von oder zusätzlich zu GRNs aufzuzeichnen. Das Tastant-Abgabesystem ist jedoch so ausgelegt, dass es während des gesamten Experiments eine konstante mechanische Eingabe liefert, was es unwahrscheinlich macht, dass Reaktionen auf einen Geschmack durch Reaktionen auf die mechanische Komponente seiner Auslieferung verwechselt werden. Neuronen, die auf einige, aber nicht andere Geschmacksrichtungen reagieren, oder auf unterschiedliche Weise zu verschiedenen Geschmacksrichtungen, können eindeutig als GRNs eingestuft werden. Wir empfehlen, frisch verdünnte Geschmacksstoffe zu verwenden, um Variationen der Geschmackskonzentration oder -zusammensetzung aufgrund von vermindertem Abbau oder Verdampfung zu vermeidenDes Lösungsmittels. Wir empfehlen auch, das System regelmäßig zu reinigen, um Schlauchverunreinigungen und / oder Hindernisse zu vermeiden. Ein weiteres mögliches technisches Problem ist ein nachteiliges Signal-Rausch-Verhältnis. Dieses Problem kann oft durch Rechlorieren oder Einstellen der Position der Bad-Masseelektrode gelöst werden. Andere Lösungen können eine Abschirmung erfordern und die Länge jeder elektrischen Verbindung im Gerät minimieren. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass eine korrekte Analyse der Daten, die mit Tetrodenaufnahmen erhalten wurden, eine sorgfältige Spikesortierung erfordert. Wir haben festgestellt, dass vollautomatische Methoden in der Regel unzureichend sind. Wir empfehlen, mit der Spike-Sortierliteratur vertraut zu werden, bevor wir die Tetrodendaten 10 , 29 , 31 , 32 , 33 analysieren. Alternativen zu unserer Sektion ProTocol kann verwendet werden. Hier haben wir eine Zergliederung durch den ventralen Teil des Mottenkopfes beschrieben, der Zugang zu den Oberkiefernerven und SEZ bietet, aber es ist auch möglich, auf diese Strukturen zuzugreifen, indem sie durch die dorsale Seite zerlegen. Wir fanden die dorsale Seite Vorbereitung ist nicht optimal für die Aufnahmen von diesen Geschmack Strukturen aufgrund ihrer tiefen Lage, aber diese Vorbereitung bietet den Vorteil der Ermöglichung von Aufnahmen aus höheren Ordnung Strukturen wie der Pilz Körper, ein Bereich, der mit Multi verbunden war -sensorische Integration, assoziatives Lernen und Gedächtnisverarbeitung 34 . Wir haben uns auf die Verwendung von Tetrodenelektroden konzentriert, um aus dem N. maxillaris aufzutragen, aber, wie wir veranschaulicht haben, können auch standardmäßige intrazelluläre scharfe Elektroden verwendet werden. Darüber hinaus können beide Techniken kombiniert werden, um simultane Aufnahmen von mehreren Gehirnbereichen auszuführen 10 . Die neurowissenschaftliche Literatur bietet viele Beispiele für iWirbeltiermodelle, die sich als mächtige Werkzeuge erwiesen haben, um grundlegende Prinzipien der sensorischen Verarbeitung, wie z. B. olfaktorische Kodierung, die sowohl für Insekten als auch für Wirbeltiere 35 , 36 , 37 , 38 , 39 gelten, aufzudecken. Wir hoffen, dass unsere Methoden zu grundlegenden neuen Einsichten über die gustatorische Kodierung führen werden.

Die gustatorischen und olfaktorischen Systeme erzeugen interne Darstellungen von Chemikalien in der Umwelt, was zu einer Wahrnehmung von Geschmack und Gerüchen führt. Diese chemischen Sinne sind wesentlich für das Auslösen zahlreicher Verhaltensweisen, die für das Überleben des Organismus kritisch sind, von der Suche nach Kumpel und Mahlzeiten zur Vermeidung von Raubtieren und Toxinen. Der Prozess beginnt, wenn Umweltchemikalien mit Rezeptoren interagieren, die sich in den Plasmamembranen von sensorischen Rezeptorzellen befinden; Diese Zellen, direkt oder durch Wechselwirkungen mit Neuronen, übertragen Informationen über die Identität und Konzentration von Chemikalien in elektrische Signale. Diese Signale werden dann auf Neuronen höherer Ordnung und auf andere Hirnstrukturen übertragen. Wenn diese Schritte fortschreiten, wird das ursprüngliche Signal immer Veränderungen unterworfen, die die Fähigkeit des Organismus fördern, die sensorischen Informationen zu erkennen, zu unterscheiden, zu klassifizieren, zu vergleichen und zu speichern und eine geeignete Aktion auszuwählen. Verstehen, wie der BHIn verwandelt Informationen über Umweltchemikalien, um am besten eine Vielzahl von Aufgaben zu erfüllen ist eine grundlegende Frage in der Neurowissenschaften. Die Gustator-Codierung wurde als relativ einfach angesehen: Eine weit verbreitete Ansicht stellt fest, dass jedes chemische Molekül, das einen Geschmack hervorruft (ein &quot;schmackhaft&quot;), natürlich zu einer der etwa fünf oder so grundlegenden Geschmackseigenschaften gehört ( dh süß, bitter, sauer , Salzig und umami) 1 . In dieser &quot;Grundgeschmack&quot; -Ansicht ist die Aufgabe des Geschmackssystems zu bestimmen, welcher dieser Grundgeschmack vorhanden ist. Ferner sind die neuronalen Mechanismen, die der grundlegenden Geschmacksdarstellung im Nervensystem zugrunde liegen, unklar und werden durch eine &quot;markierte Linie&quot; 2 , 3 , 4 , 5 , 6 oder ein &quot;über Fasermuster&quot; 7 bestimmt </suP&gt; , 8 code. In einem etikettierten Liniencode reagiert jede sensorische Zelle und jede ihrer neuralen Anhänger auf eine einzige Geschmacksqualität, die zusammen einen direkten und unabhängigen Kanal zu höheren Bearbeitungszentren im zentralen Nervensystem bildet, die diesem Geschmack gewidmet sind. Im Gegensatz dazu kann in einem across-Faser-Muster-Code jede sensorische Zelle auf mehrere Geschmackseigenschaften reagieren, so dass Informationen über den Geschmack durch die Gesamtreaktion der Population von sensorischen Neuronen repräsentiert werden. Ob gustatorische Information durch grundlegende Geschmäcke, durch markierte Linien oder durch einen anderen Mechanismus repräsentiert wird, ist unklar und steht im Mittelpunkt der neueren Untersuchung 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Unsere eigenen jüngsten Arbeiten deuten darauf hin, dass das Geschmackssystem einen räumlich-zeitlichen Bevölkerungscode verwendet, um zu erzeugenDarstellungen einzelner Geschmacksrichtungen anstatt der Grundgeschmackskategorien 10 . Hier bieten wir 3 neue Werkzeuge an, um das Studium der Gustatory Coding zu unterstützen. Zuerst schlagen wir die Verwendung des hawkmoth Manduca sexta als relativ einfacher Modellorganismus vor, der dem elektrophysiologischen Studium des Geschmacks zugänglich ist und ein Sektionsverfahren beschreibt. Zweitens schlagen wir die Verwendung von extrazellulären &quot;Tetroden&quot; vor, um die Aktivität einzelner GRNs aufzuzeichnen. Und drittens schlagen wir einen neuen Apparat vor, um präzise zeitgesteuerte Impulse für das Tier zu liefern und zu überwachen. Diese Werkzeuge wurden aus Techniken unseres Labors angepasst und andere haben das olfaktorische System untersucht. Insekten wie die Fruchtfliege Drosophila melanogaster , die Heuschrecke Schistocerca americana , sowie die Motte Manduca sexta, haben seit Jahrzehnten leistungsstarke Mittel, um Grundprinzipien über den Ner zu verstehenVous-System, einschließlich sensorischer Codierung ( zB Olution 13 ). Bei Säugetieren sind Geschmacksrezeptoren spezialisierte Zellen, die mit Neuronen über komplexe Sekundärboten 1 , 14 kommunizieren. Es ist einfacher bei Insekten: ihre Geschmacksrezeptoren sind Neuronen. Weiterhin sind Säugetier-Geschmackswege in der Nähe der Peripherie relativ komplex, mit mehreren, parallelen neuronalen Strecken, und wichtige Komponenten sind herausfordernd zugänglich, in kleinen knöchernen Strukturen enthalten. Insektengeschäftswege scheinen einfacher zu sein. Bei Insekten sind GRNs in spezialisierten Strukturen, die als Sensilla bekannt sind, in der Antenne, den Mundstücken, den Flügeln und den Beinen 16 , 17 enthalten . Die GRNs direkt projektieren, um die subösophageale Zone (SEZ), eine Struktur, deren Rolle wurde vor allem gustatory 17 , und die Zweite Ordnung enthältGeschmack Neuronen 10 . Von dort aus gelangt die Information zum Körper, um Reflexe zu fahren und höhere Gehirnbereiche zu integrieren, zu speichern und letztlich Verhaltensweisen zu treffen 16 . Es ist notwendig, periphere Geschmacksreaktionen zu charakterisieren, um zu verstehen, wie die Geschmacksinformation propagiert und von Punkt zu Punkt im ganzen Nervensystem transformiert wird. Die am häufigsten verwendete Methode zur direkten Überwachung der neuronalen Aktivität von GRNs bei Insekten ist die Tip-Recording-Technik 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Dabei geht es darum, eine Elektrode direkt auf ein Sensillum zu legen, von denen viele relativ leicht zugänglich sind. Der Geschmack ist in der Elektrode enthalten, so dass man zu aktivieren und extRaumuläre Messung der neuronalen Reaktionen von GRNs im Sensillum. Da aber der Geschmack in der Elektrode enthalten ist, ist es nicht möglich, die GRN-Aktivität zu messen, bevor der Geschmack abgegeben wird oder nachdem er entfernt wurde, oder um Tastants auszutauschen, ohne die Elektrode 20 zu ersetzen. Eine andere Methode, die &quot;Seitenwand&quot; Aufnahmetechnik, wurde auch verwendet, um GRNs Aktivität aufzuzeichnen. Hier wird eine Aufzeichnungselektrode in die Basis eines Geschmacksensilums 24 eingeführt und die Geschmackstoffe werden durch eine separate Glaskapillare an der Spitze des Sensillums abgegeben. Beide Techniken beschränken die Aufzeichnung von GRNs auf ein bestimmtes Sensillum. Hier schlagen wir eine neue Technik vor: Aufzeichnung von zufällig ausgewählten GRN-Axonen aus verschiedenen Sensillen, während sie separat Septionen von Tasting an den Rüssel liefern. Axon-Aufnahmen werden erreicht, indem entweder scharfe Glaselektroden oder extrazelluläre Elektrodenbündel (Tetroden) in den Nerven gebracht werden, der Axone trägtGRNs im Rüssel der SEZ 10 . In Manduca durchqueren diese Axone den N. maxillaris, der bekanntermaßen rein afferent ist und die eindeutige Aufzeichnung von Sinnesreaktionen ermöglicht. Diese Methode der Aufzeichnung von Axonen, erlaubt für mehr als zwei Stunden, stabile Messung der GRN-Antworten vor, während und nach einer Reihe von leckeren Präsentationen. Hier beschreiben wir ein Sektionsverfahren, um die Oberkiefernerven zusammen mit der SEZ auszusetzen, die es erlauben, gleichzeitig die Reaktionen von mehreren GRNs und Neuronen in der SEZ 10 aufzuzeichnen. Wir beschreiben auch die Verwendung von extrazellulären Aufnahmen von GRNs mit einer maßgeschneiderten 4-Kanal-Twisted-Wire-Tetrode, die in Kombination mit einer Spike-Sortiermethode die Analyse von mehreren (in unseren Händen bis zu sechs) GRNs gleichzeitig ermöglicht. Wir vergleichen weiter Aufnahmen mit Tetroden zu Aufnahmen mit scharfen intrazellulären gemachtElektroden Schließlich beschreiben wir einen neuen Apparat für die Bereitstellung von schmackhaften Reizen. Angepasst von Geräten, die von vielen Forschern verwendet wurden, um Geruchsstoffe in Olivitätsstudien zu liefern, bietet unser neues Gerät Vorteile für das Studieren von Böen: Verbesserung des bisherigen Mehrkanal-Abgabesystems, wie sie von Stürckow und Kollegen entwickelt wurden (siehe Referenzen 26 , 27 ), unser Gerät erreicht präzise Kontrolle über den Zeitpunkt der Tastant-Abgabe, während eine Spannungsauslesung dieser Zeitsteuerung bereitgestellt wird; Und es ermöglicht die schnelle, sequentielle Lieferung von mehrfachen Taststimuli 10 . Die Apparatur badet den Rüssel in einem konstanten Strom von sauberem Wasser, in das kontrollierte Impulse des Geschmacks geliefert werden können. Jeder schmackhafte Puls geht über den Rüssel und wird dann weggewaschen. Schmecken enthalten eine kleine Menge von geschmacklosen Lebensmittel Färbung, so dass ein Farbsensor zu überwachen, mit präzisen Timing, die Passage von schmackhaften ovEr ist der Rüssel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Dissection and specimen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 15 ml -Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, Short bevel, 19G x 1-1/2&#34;&#160;</td>
			<td>&#160;MONOJET</td>
			<td>888200144</td>
			<td>For aplying air to remove the hair from the moth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay-Van Aken Plastalina&#160;</td>
			<td>DickBlick</td>
			<td>33268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish-100 x 15 mm&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89000-304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip (1-200 &#181;L)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Techni Edge</td>
			<td>TE05-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 AWG standard hookup wire</td>
			<td>AlphaWire</td>
			<td>1551</td>
			<td>For inserting the proboscis into the pippete tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Batik wax</td>
			<td>Jacquard</td>
			<td>7946000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric waxer</td>
			<td>Almore International</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Myscroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #1 forceps (coarse)&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500335</td>
			<td>For removing fat and non nervous tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 titanium forceps (fine)&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14096</td>
			<td>For removing fat and non nervous tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF forceps (super-fine)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500085</td>
			<td>For desheathing the nervious tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors (fine)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td>For removing the cuticle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11097113001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Permatex</td>
			<td>84101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Saline perfusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension set with rate flow regulator</td>
			<td>&#160;B Braun Medical Inc.</td>
			<td>V5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set with Y injection site</td>
			<td>&#160;B Braun Medical Inc.</td>
			<td>V1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tastant delivery system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Translucent Nylon Tubing OD 1/4&#34;, ID 1/8&#34;</td>
			<td>Small Parts Inc.</td>
			<td>B001JJT4SA</td>
			<td>Rigid tube that connects the four main elements of the system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Circuit Specialists</td>
			<td>ZD200BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary tool-Dremel</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)&#160;</td>
			<td>Industrial Netting</td>
			<td>XN5170</td>
			<td>For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized 16-Channel perfusion system&#160;</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-16H</td>
			<td>For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controler and fitting accesories.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubing, ID 0.034&#34;, ID 0.050&#34;</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Co</td>
			<td>427421</td>
			<td>&#160;Output tube from the perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>For controlling the output channel of the perfusion system.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW 2011</td>
			<td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compulab 3 Manostat peristaltic pump</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1366</td>
			<td>For pumping water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, ID 1/16&#34; OD 1/8&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WU-95802-02</td>
			<td>To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color sensor-digital fiber optic sensor</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>&#160;FS-V31M</td>
			<td>For monitoring tastant delivery.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color sensor-reflective fiber unit</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>FU35-FZ</td>
			<td>To connect the color sensor device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental periphery Wax</td>
			<td>Henry-Schein Dental</td>
			<td>6652151</td>
			<td>To secure the proboscis into the rigid tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 3.7 L containers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To provide water to the system, and to recollect the water waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps 25.5 cm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500364</td>
			<td>To introduce moths proboscis into the proboscis hole from the rigid tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Electrophysiology Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.C. amplifier</td>
			<td>Brown-Lee</td>
			<td>440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamp</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Schott Fostec Light Source DCR 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>To precicely insert the tetrodes into the animals brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration-isolation table (MICRO-g lab table)</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix&#160;</td>
			<td>TDS2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-channle pre-amplifier and amplifier</td>
			<td>16 Channel MA-800 Amplifier System&#160;</td>
			<td>B.E.S 2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>optiplex 780</td>
			<td>The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32GHz, 3GB. Processor: Intel Core&#160;2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW 2011</td>
			<td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tastants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

new methods to study gustatory coding

Der Geschmackssinn erlaubt es den Tieren, Chemikalien in der Umwelt zu erkennen, was zu Verhaltensweisen führt, die für das Überleben entscheidend sind. Wenn Gustatory Receptor Neurons (GRNs) schmeckende Moleküle erkennen, kodieren sie Informationen über die Identität und Konzentration des Geschmacks als Muster der elektrischen Aktivität, die sich dann zu den Neuronen im Gehirn ausbreiten. Diese Muster bilden innere Darstellungen des Geschmacks, die es dem Tier erlauben, Handlungen auszuwählen und Erinnerungen zu bilden. Die Verwendung von relativ einfachen Tiermodellen war ein mächtiges Werkzeug, um Grundprinzipien in der sensorischen Kodierung zu untersuchen. Hier schlagen wir drei neue Methoden vor, um mit der Motte Manduca sexta die Gustatory Coding zu untersuchen. Zuerst stellen wir ein Dissektionsverfahren für die Freilegung der Oberkiefernerven und der subösophagealen Zone (SEZ) vor, was die Aufzeichnung der Aktivität von GRNs aus ihren Axonen ermöglicht. Zweitens beschreiben wir die Verwendung von extrazellulären Elektroden, um die Aktivität von mehreren GRNs aufzuzeichnen, indem man teTrommeln direkt in den N. maxillaris Drittens präsentieren wir ein neues System für die Bereitstellung und Überwachung, mit hoher zeitlicher Präzision, Impulse verschiedener Geschmacksrichtungen. Diese Methoden erlauben die Charakterisierung von neuronalen Reaktionen in vivo direkt von GRNs vor, während und nach der Verabreichung von Leckerbissen. Wir stellen Beispiele für Spannungsspuren dar, die von mehreren GRNs aufgenommen wurden, und stellen ein Beispiel dar, wie eine Spike-Sortierungstechnik auf die Daten angewendet werden kann, um die Antworten einzelner Neuronen zu identifizieren. Um unseren Aufzeichnungsansatz zu validieren, vergleichen wir extrazelluläre Aufnahmen von GRNs mit Tetroden zu intrazellulären Aufnahmen, die mit scharfen Glaselektroden erhalten wurden.

Die Aktivität von GRNs kann mit einer extrazellulären Tetrodelektrode vor, während und nach der Tastantabgabe aufgezeichnet werden ( Abbildung 6A und 6C ). Fig. 6A (mittlere und untere Tafeln) zeigt gefilterte (300-6.000 Hz) Spannungsspuren, die von jedem der vier Drähte aufgezeichnet werden, die im N. maxillaris angeordnet sind, wobei Signale mit unterschiedlichen Amplituden, die die Aktionspotentiale (Pfeile) widerspiegeln, beobachtet werden können. Ein 1 s Puls von Tastament (1 M Saccharose) wurde 2s nach Beginn des Experiments geliefert; Der Beginn und der Versatz des Stimulus wurde durch den Farbsensor überwacht ( Bild 6A , oberes Feld). Die schmackhaft induzierten Spikes, die in jedem der vier Kanäle beobachtet werden können ( Abbildung 6A , Mitteltafel). GRNs können identifiziert und von Mechanosensoren (hier nicht gezeigt) unterschieden werden, wenn sie auf einige Geschmacksrichtungen und nicht auf andere reagieren Um einzelne Neuronenantworten aus den Tetrodenaufnahmen zu identifizieren und zu isolieren, führten wir mit einer Reihe von benutzerdefinierten Funktionen auf der Basis von Pouzats 31 und Kleinfelds 32 , 33 Methoden (diese Methoden sind in diesen Zitaten beschrieben: 10 , 29 ). Fig. 6B zeigt ein Beispiel einer Spikesortierung, die auf die in Fig. 6A gezeigten Daten angewendet wurde, in denen drei gut isolierte Einheiten gefunden wurden. Rasterplots aus Abbildung 6C zeigen die Reaktionen der drei isolierten Einheiten in Abbildung 6B auf sechs verschiedene Geschmacksstoffe (1 M Saccharose, Maltose und NaCl, 100 mM Koffein und 10 mM Berberin und Lobeline), die nacheinander (4 Versuch)S / tastant werden gezeigt). Wie in Abbildung 6C gezeigt , haben die aufgezeichneten GRNs unterschiedliche Ebenen der Baselineaktivität, die von stiller (GRNs 1) bis zu niedrig oder mäßig (GRN 2 und 3) reichen. Nach dem anstrengenden Beginn zeigen GRNs diverse Aktivitätsmuster und zeigen unterschiedliche Selektivität für die Geschmackstoffe. Zum Beispiel antwortete GRN 1 nur auf Saccharose, während GRN 2 auf Maltose und NaCl mit Stacheln von Spikes und Lobeline mit Spiking nur zu Beginn des Reizes reagierte. Darüber hinaus sind einige Reaktionen mit dem Timing des Stimulus verriegelt ( zB GRN 1-Antwort auf Saccharose), während andere Reaktionen die Dauer des Reizes ( zB GRN 3-Response auf Berberine) überdauern oder sowohl exzitatorische als auch inhibitorische Komponenten enthalten ( z GRN 2 -Antworten auf NaCl und Saccharose). Für weitere Informationen über die unterschiedlichen Empfindlichkeiten und Aktivitätsmuster von GRNs siehe Referenz 10 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; Zur Validierung der Verwendung der Tetrode- und Spike-Sortierungstechniken zur Aufzeichnung von GRNs aus dem N. maxillaris haben wir intrazelluläre Aufnahmen von GRN-Axonen in anderen Tieren mit herkömmlichen scharfen Glaselektroden (Widerstand von 80-120 MΩ) durchgeführt. Wir fanden heraus, dass die Aktivitätsmuster, die unter Verwendung von intrazellulären Aufnahmen erhalten wurden, den Reaktionen ähnlich waren, die unter Verwendung der Tetrodentechnik beobachtet wurden ( 7 ). Die Spannungsspuren in der grünen Box in Panel A wurden intrazellulär von GRN 1 während 5 aufeinanderfolgenden Versuchen der Saccharose-Präsentation aufgezeichnet, und die gleichen Antworten werden als Raster-Diagramme in Panel B gezeigt. (Beachten Sie, dass diese Art von Antwort mit der mit Tetroden und Gezeigt in 6C .) GRN 2, aufgezeichnet mit scharfen intrazellulären Elektroden, zeigt ein breiteres Antwortmuster. <img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/&gt; Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse von Nervenaufnahmen mit extrazellulären Tetroden. ( A ) Gefilterte (300-6.000 Hz) Spannungsspuren, die von jedem der vier Drähte im N. maxillaris aufgezeichnet wurden, werden angezeigt (Mittelfeld). Ein 1 s Puls von Tastament wurde während der Zeitspanne angewendet, die durch eine rote Schattierung in der mittleren Platte angezeigt wurde. Der Beginn und der Versatz des Stimulus wurde durch den Farbsensor überwacht, wie durch die rote Spannungsspur auf der oberen Tafel angezeigt und wird auf dem mittleren Feld durch den rot-schattierten Bereich angezeigt. Die gepunkteten horizontalen Linien bezeichnen +50 (oben), 0 (Mitte) und -50 (unten) μV. Eine Vergrößerung der Rohspannungsspuren entsprechend der Fläche innerhalb der vertikalen gestrichelten Linien ist dargestellt (Bodenplatte). Beispiele für Spikes sind durch die Pfeile gekennzeichnet. ( B ) Ein Beispiel für eine Spikesortierung, die auf die in der Platte A gezeigten Daten angewendet wird. Die Wellenformen, die an jedem der vier extrazellulären Drähte (1-4) aufgezeichnet wurden,E identifiziert mit drei verschiedenen GRNs (Einheiten 1-3), die zu den aufgezeichneten Signalen beitragen. Einzelne Ereignisse (farbige dünne Linien) und die mittlere (dicke schwarze Linie) werden für die drei Einheiten gezeigt. Es müssen mehrere statistische Kriterien betrachtet werden, um unabhängige Einheiten nach der Spike-Sortiermethode zuverlässig zu identifizieren (siehe Referenzen 10 , 29 ). ( C ) Rasterplots, die die Antworten der drei isolierten Einheiten auf eine Sequenz von sechs verschiedenen Tastants darstellen (4 Versuche / Geschmack sind gezeigt). Die Zeitspanne der schmackhaften Zustellung (1 s) wird durch den rot-schattierten Bereich angezeigt. Die Konzentrationen der Geschmacksstoffe waren entweder 1 M (Saccharose, Maltose, NaCl), 100 mM (Koffein) und 10 mM (Berberin und Lobeline). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 7" c<html> Lass = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg&quot; /&gt; Abbildung 7 : Intrazelluläre Aufnahmen von GRN-Axonen. ( A , grünes Kastenfeld) Spannungsspuren, die von einem GRN mit scharfen Glas intrazellulären Elektroden (Widerstand von 80 - 120 MΩ) aufgezeichnet wurden, die in den N. maxillaris eingebracht wurden, entstanden durch 5 aufeinanderfolgende Stimulationen mit 1 M Saccharose (Suc). ( B ) Raster-Plots der Reaktionen von zwei GRNs, einschließlich der in Panel A (Green Box Panel) gezeigten Reaktionen auf zwei verschiedene Talkants, die nacheinander geliefert wurden (100 mM Grau-Schriftfarbe, 1 M Schwarz-Schriftfarbe), aufgenommen mit scharfen Glas-Intrazellulären Elektroden In den N. maxillaris (7 Versuche / Geschmack und 3 Versuche / Wasser werden gezeigt). Die Tastzeit wird in den beiden Tafeln durch rot-schattierte Bereiche angezeigt. Der Beginn und der Versatz des Stimulus wurde durch den Farbsensor überwacht, wie durch die roten Spannungsspuren am Boden jedes Panels angezeigt.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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New Methods to Study Gustatory Coding

Wir präsentieren drei neue Methoden, um die gustende Kodierung zu untersuchen . Mit einem einfachen Tier, der Motte Manduca sexta ( Manduca ) , beschreiben wir ein Dissektionsprotokoll, die Verwendung von extrazellulären Tetroden zur Aufzeichnung der Aktivität von mehreren Gustatorrezeptor-Neuronen und ein System zur Bereitstellung und Überwachung von präzise zeitgesteuerten Impulsen.

Neue Methoden zum Studieren der Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

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