Name: new methods to study gustatory coding
Uploaded: 2017-06-29T15:00:00
Duration: 10 min 59 s
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Este trabalho foi apoiado por uma doação intramural do NIH-NICHD ao MS. Agradecemos a G. Dold e T. Talbot, do NIH-NIMH Instrumentation Core Facility para assistência no projeto do sistema de entrega de saborizantes.

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Os autores não têm nada a divulgar.

Os métodos aqui descritos permitem gravações in vivo de um animal relativamente simples, Manduca sexta , para caracterizar a atividade de múltiplas GRN selecionadas aleatoriamente em longas durações (por mais de 2 h), antes, durante e após a entrega do sabor. Esses métodos também permitem a entrega rápida e sequencial de múltiplos estímulos de saborizantes com controle temporal preciso, vantagens que são úteis para o estudo de mecanismos neurais subjacentes à representação de saborizantes. Este protocolo tem sido usado para estudar como as respostas de GRNs a tastants são transformadas quando são transmitidas para seus neurônios alvo pós-sinápticos ( por exemplo, na SEZ) monitorando GRNs simultaneamente com interneurônios monossinticamente conectados 10 . Além disso, esses métodos podem ser adaptados às necessidades do experimentador, permitindo a execução de paradigmas complexos para estudar aspectos fundamentais da codificação gustativa. Quando começarNos nossos estudos, um problema técnico que às vezes precisávamos solucionar era a incapacidade de detectar sinais de inclinação do nervo maxilar com os fios de tetrodos. Possíveis causas para isso são diversas, já que o protocolo de dissecação é desafiador, e é necessária alguma prática para obter uma boa preparação. Primeiro, durante a dissecção da traça, os nervos maxilares são fáceis de danificar, especialmente durante a remoção da bainha que envolve o tecido nervoso. Em segundo lugar, se a bainha não for removida completamente, os fios do tetrode podem não ter acesso ao nervo. Em ambos os casos, iniciar uma nova preparação geralmente é a maneira mais fácil de resolver esses problemas. Em terceiro lugar, pode haver um problema com os fios tetrodos. Isso pode ser verificado medindo a impedância dos fios que deve ser ~ 270 kΩ a 1kHz. Se o valor da impedância estiver acima de ~ 300 kΩ, eletrole os fios com ouro para obter a impedância desejada (ver referência 30 ). Em quarto lugar, um equipamento pode estar desconectadoOu se comportando mal. Outro possível problema é que os sinais de pico são gravados, mas o (s) neurônio (s) aparentemente não respondem aos provadores. Isso pode ser porque os neurônios registrados são insensíveis ao conjunto de saborizantes entregues. Além disso, é importante ter em mente que, além de axônios de GRNs, o nervo maxilar também carrega fibras mecanossensíveis. Assim, é possível gravar a partir de neurônios mecanossensores em vez de, ou além de, GRNs. No entanto, o sistema de entrega de saborizado foi concebido para proporcionar uma entrada mecânica constante ao longo do experimento, tornando improvável que as respostas a um saborizador sejam confundidas pelas respostas ao componente mecânico da sua entrega. Os neurônios que respondem a alguns, mas não a outros saborizantes, ou de maneiras diferentes a diferentes saborizantes, podem ser classificados de forma inequívoca como GRNs. Recomendamos o uso de saborizantes recentemente diluídos para evitar variações na concentração de sabor ou composição devido à degradação ou evaporação do compostoDo solvente. Também recomendamos limpar o sistema regularmente para evitar a contaminação da tubagem e / ou obstruções. Outro possível problema técnico é uma relação sinal-ruído desvantagem. Este problema muitas vezes pode ser resolvido através da recarga ou ajuste da posição do eletrodo de terra do banho. Outras soluções podem exigir blindagem e minimizar o comprimento de cada conexão elétrica no aparelho. Finalmente, é importante notar que a análise correta dos dados obtidos usando gravações de tetrode requer uma classificação cuidadosa dos espinhos. Descobrimos que os métodos totalmente automatizados geralmente são inadequados. Recomendamos familiarizar-se com a literatura de classificação de espiga antes de analisar dados de tetrodos 10 , 29 , 31 , 32 , 33 . Alternativas à nossa dissecção profissionalTocol pode ser usado. Aqui, descrevemos uma dissecção através da parte ventral da cabeça da traça, proporcionando acesso aos nervos maxilares e SEZ, mas também é possível acessar essas estruturas por dissecação através do lado dorsal. Nós achamos que a preparação do lado dorsal não é otimizada para fazer gravações dessas estruturas gustativas devido à sua localização profunda, mas esta preparação oferece a vantagem de habilitar gravações de estruturas de ordem superior, como o corpo de cogumelo, uma área associada a multi Integração sensorial, aprendizagem associativa e processamento de memória 34 . Nós nos concentramos no uso de eletrodos de tetrodos para gravar a partir do nervo maxilar, mas, como ilustramos, eletrodos afiados intracelulares padrão também podem ser usados ​​para este propósito. Além disso, ambas as técnicas podem ser combinadas para realizar gravações simultâneas de várias áreas do cérebro 10 . A literatura sobre neurociências oferece muitos exemplos de iModelos de nvertebrados que provaram ser ferramentas poderosas para revelar princípios fundamentais de processamento sensorial, como a codificação olfativa, que se aplicam tanto aos insetos quanto aos vertebrados 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Esperamos que nossos métodos conduzam a novas idéias fundamentais sobre a codificação gustativa.

Os sistemas gustativo e olfativo geram representações internas de produtos químicos no meio ambiente, dando origem a percepções de gostos e odores, respectivamente. Esses sentidos químicos são essenciais para provocar numerosos comportamentos críticos para a sobrevivência do organismo, que vão desde encontrar companheiros e refeições para evitar predadores e toxinas. O processo começa quando os agentes químicos ambientais interagem com receptores localizados nas membranas plasmáticas das células receptoras sensoriais; Essas células, diretamente ou através de interações com neurônios, transduzem informações sobre a identidade e concentração de produtos químicos em sinais elétricos. Estes sinais são então transmitidos para neurônios de ordem superior e para outras estruturas cerebrais. À medida que estes passos progridem, o sinal original sempre sofre mudanças que promovem a capacidade do organismo de detectar, discriminar, classificar, comparar e armazenar as informações sensoriais e selecionar uma ação apropriada. Entendendo como o sutiãNa transformação de informações sobre produtos químicos ambientais para executar melhor uma variedade de tarefas é uma questão básica na neurociência. A codificação de Gustatory foi pensada para ser relativamente simples: uma visão extensa postula que cada molécula química que provoca um sabor (um &quot;saborizante&quot;) pertence naturalmente a uma das aproximadamente cinco qualidades básicas de sabor ( ou seja , doce, amargo, azedo , Salgados e umami) 1 . Nesta visão de &quot;gosto básico&quot;, o trabalho do sistema gustativo é determinar qual desses gostos básicos está presente. Além disso, os mecanismos neurais subjacentes à representação básica do sabor no sistema nervoso não são claros e são pensados ​​para serem governados por uma &quot;linha marcada&quot; 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ou um &quot;padrão de fibra transversal&quot; 7 </suP&gt; , código 8 . Em um código de linha rotulado, cada célula sensorial e cada um de seus seguidores neurais respondem a uma única qualidade de sabor, formando um canal direto e independente para centros de processamento superiores no sistema nervoso central dedicado a esse gosto. Em contraste, em um código de padrão de fibra, cada célula sensorial pode responder a múltiplas características de sabor, de modo que a informação sobre o saborizante seja representada pela resposta geral da população de neurônios sensoriais. Se a informação gustativa é representada por gostos básicos, através de linhas rotuladas, ou através de algum outro mecanismo, não está claro e é o foco da investigação recente 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Nosso próprio trabalho recente sugere que o sistema gustativo usa um código de população spatiotemporal para gerarRepresentações de saborizantes individuais em vez de categorias básicas de gosto 10 . Aqui, oferecemos 3 novas ferramentas para auxiliar no estudo da codificação gustativa. Primeiro, sugerimos o uso do hawkmoth Manduca sexta como um organismo modelo relativamente simples, possivel para o estudo eletrofisiológico do gosto e descrevendo um procedimento de dissecação. Em segundo lugar, sugerimos o uso de &quot;tetrodes&quot; extracelulares para registrar a atividade de GRNs individuais. E em terceiro lugar, sugerimos um novo aparelho para entregar e monitorar pulsos de saborizante precisamente cronometrados para o animal. Essas ferramentas foram adaptadas das técnicas que nosso laboratório usou para estudar o sistema olfativo. Insetos como a mosca da fruta Drosophila melanogaster , o gafanhoto Schistocerca americana , bem como a maruca Manduca sexta, têm proporcionado por décadas recursos poderosos para entender princípios básicos sobre o nerSistema de você, incluindo a codificação sensorial ( por exemplo, olfação 13 ). Nos mamíferos, os receptores de gosto são células especializadas que se comunicam com os neurônios através de caminhos complexos do segundo mensageiro 1 , 14 . É mais simples em insetos: seus receptores de gosto são neurônios. Além disso, as vias de sabor de mamíferos perto da periferia são relativamente complexas, apresentando múltiplas rotas neurais paralelas, e componentes importantes são difíceis de acessar, contidos em pequenas estruturas ósseas 15 . As vias de sabor do inseto parecem ser mais simples. Em insetos, os GRNs estão contidos em estruturas especializadas conhecidas como sensilla, localizadas na antena, partes bucais, asas e pernas 16 , 17 . Os GRNs diretamente projetam para a zona subesofágica (SEZ), uma estrutura cujo papel foi considerado principalmente 17 gustativo e que contém segunda ordemNeurônios gustativos 10 . A partir daí, a informação viaja para o corpo para conduzir reflexos e para áreas superiores do cérebro para serem integradas, armazenadas e, em última instância, para dirigir as escolhas comportamentais 16 . É necessário caracterizar as respostas do sabor periférico para entender como a informação do gosto é propagada e transformada de um ponto para outro através do sistema nervoso. O método mais utilizado para monitorar diretamente a atividade neural de GRN em insetos é a técnica de gravação de ponta 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Isso envolve a colocação de um eletrodo diretamente em um sensillum, muitos dos quais são relativamente fáceis de acessar. O saborizador está incluído no eletrodo, permitindo que um seja ativado e extMede as respostas neuronais nas GRNs de forma racélular no sensillum. Mas, como o saborizador está contido no eletrodo, não é possível medir a atividade do GRN antes que o saborizador seja entregue ou após a remoção, ou para trocar os saborizantes sem substituir o eletrodo 20 . Outro método, a técnica de gravação &quot;side-wall&quot;, também foi usado para registrar a atividade GRNs. Aqui, um eletrodo de gravação é inserido na base de um sabor sensorial 24 , e os saborizantes são entregues através de um capilar de vidro separado na ponta do sensillum. Ambas as técnicas restringem a gravação de GRNs para um sensillum particular. Aqui, sugerimos uma nova técnica: gravação de axônios GRN selecionados aleatoriamente de sensilla diferente, enquanto distribuímos separadamente as seqüências de saborizantes para a probóscide. As gravações de Axon são conseguidas colocando eletrodos de vidro afiados ou feixes de eletrodos extracelulares (tetrodos) no nervo que carrega axônios deGRNs na probóscide ao SEZ 10 . Em Manduca , esses axônios atravessam o nervo maxilar, que é conhecido por ser puramente aferente, permitindo a gravação inequívoca de respostas sensoriais 25 . Este método de gravação a partir de axônios, permite, durante mais de duas horas, medição estável de respostas GRN antes, durante e após uma série de apresentações de sabor. Aqui, descrevemos um procedimento de dissecção para expor os nervos maxilares em conjunto com o SEZ, o que pode permitir que se grave simultaneamente as respostas de GRN e neurônios múltiplos no SEZ 10 . Nós também descrevemos o uso de gravações extracelulares de GRNs usando um tetrode de fio torcido personalizado de 4 canais que, quando combinado com um método de classificação por espiga, permite a análise de GRNs múltiplos (em nossas mãos, até seis) simultaneamente. Além disso, comparamos as gravações feitas com tetrodes com gravações feitas com células intracelulares afiadasEletrodos. Finalmente, descrevemos um novo aparelho para fornecer estímulos de saborizante. Adaptado do equipamento usado por muitos pesquisadores para fornecer odorantes em estudos de olfação, nosso novo aparelho oferece vantagens para o estudo da gustação: melhorando o sistema de entrega multicanal anterior, como os desenvolvidos por Stürckow e colegas (ver referências 26 , 27 ), nosso aparelho alcança informações precisas Controle sobre o tempo da entrega do saborizante enquanto fornece uma leitura de tensão desse tempo; E permite a entrega rápida e sequencial de vários estímulos de saborizantes 10 . O aparelho baça a probóscide em um fluxo constante de água limpa em que podem ser entregues pulsos controlados de saborizante. Cada pulso saboroso passa sobre a probóscis e depois é lavado. Os saborizantes contêm uma pequena quantidade de coloração insípida, permitindo que um sensor de cor monitore, com cronometragem precisa, a passagem do tastant ovE a probóscide.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Dissection and specimen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 15 ml -Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, Short bevel, 19G x 1-1/2&#34;&#160;</td>
			<td>&#160;MONOJET</td>
			<td>888200144</td>
			<td>For aplying air to remove the hair from the moth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay-Van Aken Plastalina&#160;</td>
			<td>DickBlick</td>
			<td>33268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish-100 x 15 mm&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89000-304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip (1-200 &#181;L)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Techni Edge</td>
			<td>TE05-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 AWG standard hookup wire</td>
			<td>AlphaWire</td>
			<td>1551</td>
			<td>For inserting the proboscis into the pippete tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Batik wax</td>
			<td>Jacquard</td>
			<td>7946000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric waxer</td>
			<td>Almore International</td>
			<td>66000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Myscroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #1 forceps (coarse)&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500335</td>
			<td>For removing fat and non nervous tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 titanium forceps (fine)&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14096</td>
			<td>For removing fat and non nervous tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF forceps (super-fine)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500085</td>
			<td>For desheathing the nervious tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors (fine)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td>For removing the cuticle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11097113001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Permatex</td>
			<td>84101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Saline perfusion system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension set with rate flow regulator</td>
			<td>&#160;B Braun Medical Inc.</td>
			<td>V5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set with Y injection site</td>
			<td>&#160;B Braun Medical Inc.</td>
			<td>V1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tastant delivery system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Translucent Nylon Tubing OD 1/4&#34;, ID 1/8&#34;</td>
			<td>Small Parts Inc.</td>
			<td>B001JJT4SA</td>
			<td>Rigid tube that connects the four main elements of the system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering iron</td>
			<td>Circuit Specialists</td>
			<td>ZD200BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary tool-Dremel</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)&#160;</td>
			<td>Industrial Netting</td>
			<td>XN5170</td>
			<td>For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressurized 16-Channel perfusion system&#160;</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-16H</td>
			<td>For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controler and fitting accesories.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubing, ID 0.034&#34;, ID 0.050&#34;</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Co</td>
			<td>427421</td>
			<td>&#160;Output tube from the perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td>For controlling the output channel of the perfusion system.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW 2011</td>
			<td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compulab 3 Manostat peristaltic pump</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1366</td>
			<td>For pumping water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, ID 1/16&#34; OD 1/8&#34;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WU-95802-02</td>
			<td>To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color sensor-digital fiber optic sensor</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>&#160;FS-V31M</td>
			<td>For monitoring tastant delivery.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color sensor-reflective fiber unit</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>FU35-FZ</td>
			<td>To connect the color sensor device.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental periphery Wax</td>
			<td>Henry-Schein Dental</td>
			<td>6652151</td>
			<td>To secure the proboscis into the rigid tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 3.7 L containers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To provide water to the system, and to recollect the water waste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps 25.5 cm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500364</td>
			<td>To introduce moths proboscis into the proboscis hole from the rigid tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Electrophysiology Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.C. amplifier</td>
			<td>Brown-Lee</td>
			<td>440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamp</td>
			<td>Schott</td>
			<td>Schott Fostec Light Source DCR 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>To precicely insert the tetrodes into the animals brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration-isolation table (MICRO-g lab table)</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix&#160;</td>
			<td>TDS2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-channle pre-amplifier and amplifier</td>
			<td>16 Channel MA-800 Amplifier System&#160;</td>
			<td>B.E.S 2013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>optiplex 780</td>
			<td>The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32GHz, 3GB. Processor: Intel Core&#160;2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW 2011</td>
			<td>To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tastants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

new methods to study gustatory coding

O sentido do gosto permite que os animais detectem produtos químicos no meio ambiente, dando origem a comportamentos críticos para a sobrevivência. Quando os neurônios do receptor Gustatory (GRNs) detectam moléculas de saborizante, codificam informações sobre a identidade e a concentração do saborizante como padrões de atividade elétrica que se propagam para os neurônios seguidores no cérebro. Esses padrões constituem representações internas do saborizante, que então permitem ao animal selecionar ações e formar memórias. O uso de modelos animais relativamente simples tem sido uma ferramenta poderosa para estudar princípios básicos na codificação sensorial. Aqui, propomos três novos métodos para estudar a codificação gustativa usando a traça Manduca sexta . Primeiro, apresentamos um procedimento de dissecção para exposição dos nervos maxilares e da zona subesofágica (SEZ), permitindo o registro da atividade de GRNs de seus axônios. Em segundo lugar, descrevemos o uso de eletrodos extracelulares para registrar a atividade de GRNs múltiplos, colocando teTrode fios diretamente no nervo maxilar. Em terceiro lugar, apresentamos um novo sistema para entrega e monitoramento, com alta precisão temporal, pulsos de diferentes saborizantes. Estes métodos permitem a caracterização de respostas neuronais in vivo directamente a partir de GRNs antes, durante e após a entrega dos saborizantes. Nós fornecemos exemplos de traços de tensão gravados em GRN múltiplos e apresentamos um exemplo de como uma técnica de classificação de espiga pode ser aplicada aos dados para identificar as respostas de neurônios individuais. Finalmente, para validar nossa abordagem de gravação, comparamos as gravações extracelulares obtidas de GRNs com tetrodos para gravações intracelulares obtidas com eletrodos de vidro afiados.

A atividade dos GRNs pode ser registrada usando um eletrodo de tetrodo extracelular antes, durante e após a entrega do sabor ( Figura 6A e 6C ). A Figura 6A (painéis médio e inferior) mostra os traços de tensão filtrados (300-6,000 Hz) registrados por cada um dos quatro fios colocados no nervo maxilar, onde são observados sinais de diferentes amplitudes que refletem potenciais de ação (setas). Um pulso de 1 s de saborizante (sacarose 1 M) foi administrado 2s após o início da experiência; O início e o deslocamento do estímulo foram monitorados pelo sensor de cor ( Figura 6A , painel superior). Os picos induzidos por saborizantes que podem ser observados em cada um dos quatro canais ( Figura 6A , painel central). Os GRNs podem ser identificados e distinguidos dos mechanosensores (nenhum mostrado aqui) quando eles respondem a alguns provadores e não aos outros Para identificar e isolar respostas de neurônios únicos das gravações de tetrodos, realizamos classificação de espiga fora de linha usando um conjunto de funções personalizadas com base em métodos 32 , 33 de Pouzat e Kleinfeld (esses métodos são descritos nessas citações: 10 , 29 ). A Figura 6B mostra um exemplo de classificação por espiga aplicado aos dados mostrados na Figura 6A , em que foram encontradas três unidades bem isoladas. As tramas de escala da Figura 6C representam as respostas das três unidades isoladas na Figura 6B a seis saborizantes diferentes (sacarose 1 M, maltose e NaCl, 100 mM de cafeína e 10 mM de berberina e lobelina) entregues em sequência (4 testesS / tastant são mostrados). Conforme mostrado na Figura 6C , os GRNs registrados têm níveis diferentes de atividade de linha de base, variando de silencioso (GRN 1) a baixo ou moderado (GRN 2 e 3). Após o início do sabor, os GRNs mostram diversos padrões de atividade e exibem seletividade diferente para os saborizantes. Por exemplo, o GRN 1 respondeu apenas a sacarose, enquanto o GRN 2 respondeu a maltose e NaCl com explosão de espigas e a lobelina com pico apenas no início do estímulo. Além disso, algumas respostas são bloqueadas no momento do estímulo ( por exemplo, resposta do GRN 1 à sacarose), enquanto que outras respostas superam a duração do estímulo ( por exemplo, resposta do GRN 3 à berberina) ou contêm componentes excitadores e inibitórios ( por exemplo, Figura 7 Respostas de GRN 2 ao NaCl e à sacarose). Para mais informações sobre as diversas sensibilidades e padrões de atividade dos GRN, veja a referência 10 . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; Para validar o uso das técnicas de tetrodo e triagem de ponta para registrar GRNs do nervo maxilar, realizamos gravações intracelulares de axônios GRN em outros animais usando eletrodos convencionais de vidro afiado (resistência de 80-120 MΩ). Descobrimos que os padrões de atividade obtidos usando gravações intracelulares foram semelhantes às respostas observadas usando a técnica de tetrodos ( Figura 7 ). Os traços de tensão na caixa verde no Painel A foram registrados intracelularmente a partir do GRN 1 durante 5 testes consecutivos de apresentação de sacarose e as mesmas respostas são mostradas como parcelas de quadros no painel B. (Observe que esse tipo de resposta corresponde ao obtido com tetrodos e Mostrado na Figura 6C .) GRN 2, gravado com eletrodos intracelulares afiados, mostra um padrão de resposta mais amplo. <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/&gt; Figura 6: Resultados representativos das gravações do nervo maxilar com Tetrodes extracelulares. ( A ) São mostrados traços de tensão filtrados (300-6,000 Hz) gravados por cada um dos quatro fios no nervo maxilar (painel central). Um pulso de saborizante de 1 s foi aplicado durante o período de tempo indicado pelo sombreamento vermelho no painel do meio. O início e o deslocamento do estímulo foram monitorados pelo sensor de cor como indicado pelo traçado de tensão vermelha no painel superior e é indicado no painel do meio pela área sombreada vermelha. As linhas horizontais pontilhadas indicam +50 (superior), 0 (meio) e -50 (inferior) μV. É mostrado um alargamento dos traços de tensão bruta correspondentes à área dentro das linhas pontilhadas verticais (painel inferior). Exemplos de pontos são indicados pelas setas. ( B ) Um exemplo de classificação de espiga aplicado aos dados mostrados no painel A. As formas de onda registradas em cada um dos quatro fios extracelulares (1-4) sãoE identificado com três GRN diferentes (unidades 1-3) contribuindo para os sinais gravados. Eventos individuais (linhas finas coloridas) e a média (linha preta grossa) são mostradas para as três unidades. Uma série de critérios estatísticos devem ser considerados para identificar de forma confiável unidades independentes usando o método de classificação por espiga (ver referências 10 , 29 ). ( C ) Raster tramas representando as respostas das três unidades isoladas a uma seqüência de seis saborizantes diferentes (4 ensaios / saborizantes são mostrados). O período de tempo de entrega do saborizante (1 s) é indicado pela área sombreada vermelha. As concentrações de saborizantes foram 1M (sacarose, maltose, NaCl), 100 mM (cafeína) e 10 mM (berberina e lobelina). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 7" c<html> Lass = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7 : Gravação intracelular de Axões GRN. ( A , painel da caixa verde) Traços de tensão gravados a partir de um GRN com eletrodos intracelulares de vidro afiado (resistência de 80 - 120 MΩ) colocados no nervo maxilar, provocados por 5 estímulos consecutivos com sacarose 1 M (Suc). ( B ) Parcelas rásticas das respostas de dois GRNs, incluindo respostas mostradas no painel A (painel de caixa verde), a dois saborizantes diferentes entregues em sequência (cor de cor cinza 100 mM, cor de fonte negra de 1 M) gravados com eletrodos intracelulares de vidro afiado Colocado no nervo maxilar (7 ensaios / saborizante e 3 ensaios / água são mostrados). O tempo de entrega do Tastant é indicado pelas áreas sombreadas vermelhas em ambos os painéis. O início e o deslocamento do estímulo foram monitorados pelo sensor de cor, conforme indicado pelos traços de tensão vermelha na parte inferior de cada painel.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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New Methods to Study Gustatory Coding

Apresentamos três novos métodos para estudar codificação gustativa . Usando um animal simples, a traça Manduca sexta ( Manduca ) , descrevemos um protocolo de dissecção, o uso de tetrodos extracelulares para registrar a atividade de múltiplos neurônios receptores gustativos e um sistema para fornecer e monitorar pulsos precisamente cronometrados de saborizantes.

Novos métodos para estudar codificação gustativa

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

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